Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

Zusammenfassung

Dieses Protokoll hebt eine Methode zur schnellen Bewertung der Biokompatibilität einer kristallinen Nanocellulose (CNC)/Agarose-Verbundhydrogel-Biomaterialtinte mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die phänotypische Expression der Zelloberflächenrezeptoren Kit (CD117) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hervor.

Zusammenfassung

Das dreidimensionale (3D) Bioprinting verwendet Hydrogel-basierte Verbundwerkstoffe (oder Biomaterialtinten), die in einem Muster abgeschieden werden und ein Substrat bilden, auf dem Zellen abgeschieden werden. Da viele Biomaterialtinten potenziell zytotoxisch für Primärzellen sein können, ist es notwendig, die Biokompatibilität dieser Hydrogel-Verbundwerkstoffe vor ihrer Verwendung in kostspieligen 3D-Tissue-Engineering-Prozessen zu bestimmen. Einige 3D-Kulturmethoden, einschließlich Bioprinting, erfordern, dass Zellen in eine 3D-Matrix eingebettet werden, was es schwierig macht, die Zellen auf Veränderungen der Lebensfähigkeit und Biomarkerexpression zu extrahieren und zu analysieren, ohne mechanische Schäden hervorzurufen. Dieses Protokoll beschreibt als Proof of Concept eine Methode zur Bewertung der Biokompatibilität eines kristallinen Nanocellulose (CNC) eingebetteten Agarose-Verbundwerkstoffs, der zu einem 24-Well-Kultursystem mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen (BMMCs) unter Verwendung von durchflusszytometrischen Assays für zelllebensfähigkeit und Biomarkerexpression hergestellt wird.

Nach 18 h Exposition gegenüber der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix war die BMMC-Lebensfähigkeit unverändert, gemessen anhand der Propidiumiodidid (PI)-Permeabilität. BMMCs, die auf dem CNC/Agarose/D-Mannitol-Substrat kultiviert wurden, schienen jedoch ihre Expression des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) und des Stammzellfaktorrezeptors (Kit; CD117), obwohl dies nicht von der Menge an CNC im Bioink-Verbundwerkstoff abhängig zu sein scheint. Die Lebensfähigkeit von BMMCs wurde auch nach einer zeitlichen Exposition gegenüber Hydrogelgerüsten bewertet, die aus einer kommerziellen Biomaterialtinte hergestellt wurden, die aus fibrillerer Nanocellulose (FNC) und Natriumalginat unter Verwendung eines 3D-Extrusionsbioprinters hergestellt wurde. Über einen Zeitraum von 6-48 h beeinträchtigten die FNC/Alginat-Substrate die Durchflusszytometrie und Mikrotiterassays (XTT und Laktatdehydrogenase) ermittelte Lebensfähigkeit der BMMCs nicht. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um die biochemische Kompatibilität von Kandidaten-Biomaterialtinten schnell auf ihren Nutzen als 3D-Gerüste für das Post-Print-Seeding mit Mastzellen zu überprüfen.

Einleitung

Das jüngste Interesse an 3D-Kultursystemen und 3D-Bioprinting hat die Aufmerksamkeit auf Hydrogele und Hydrogel-Verbundwerkstoffe gelenkt. Diese Verbundwerkstoffe dienen als viskose, aber poröse Biomimetik und können aus bis zu 99 Gew.-% Wassergehalt bestehen, was mit biologischen Geweben vergleichbar ^ist1,2,3. Diese Eigenschaften von Hydrogel-Verbundwerkstoffen ermöglichen somit das Wachstum von Zellen, ohne ihre Lebensfähigkeit und Funktion zu beeinträchtigen. Ein solcher Verbundwerkstoff ist kristalline Nanocellulose (CNC), die als Verstärkungsmaterial in Hydrogel-Verbundwerkstoffen, Zellgerüsten bei der Entwicklung von Biomaterialimplantaten und in zweidimensionaler (2D) und 3D-in-vitro-Zellkultur4,5 verwendet wurde. In den meisten Fällen sind Matrizen, die aus CNC bestehen, nicht offen zytotoxisch für menschliche Hornhautepithelzellen6, Darmepithelzellen7, aus dem menschlichen Knochenmark stammende mesenchymale ^Stammzellen8 oder neuronenähnliche ^Zellen9. Die metabolische Aktivität und Proliferation von mesenchymalen Stammzellen aus dem menschlichen Knochenmark nimmt jedoch in Korrelation mit der erhöhten Viskosität von Nanocellulose-Verbundwerkstoffen auf Holzbasis ab, was darauf hindeutet, dass die Zusammensetzung der Matrix sorgfältig auf ihre schädlichen Auswirkungen auf die Zellfunktionen getestet werden ^muss8.

In ähnlicher Weise kann CNC bei der Internalisierung Entzündungsreaktionen in Makrophagen hervorrufen, die schwerwiegende Folgen in 3D-Immunzellkultursystemen haben ^{könnten10,11}. Tatsächlich gibt es nur sehr wenige Daten darüber, wie CNC andere Immunzellantworten beeinflussen kann, insbesondere allergische Entzündungsreaktionen, die von Mastzellen initiiert werden. Mastzellen sind granulierte Leukozyten, die den hochaffinen IgE-Rezeptor FceRI exprimieren, der für die Aktivierung von Entzündungsreaktionen auf Allergene verantwortlich ist. Ihre Proliferation und Differenzierung sind abhängig vom Stammzellfaktor (SCF), der den Tyrosinrezeptor Kit bindet. Mastzellen werden aus Vorläuferzellen des Knochenmarks gewonnen, die in den Kreislauf gelangen und anschließend peripher wandern, um sich ubiquitär in allen menschlichen Geweben zu ^verteilen12. Da Mastzellen in einer 3D-Gewebeumgebung funktionieren, sind sie ein idealer Immunzellkandidat für die Untersuchung immunologischer Prozesse in in vitro 3D-Gewebemodellen. Bis heute gibt es jedoch kein brauchbares in vitro 3D-Gewebemodell, das Mastzellen enthält.

Aufgrund der hochempfindlichen Natur von Mastzellen und ihrer Neigung, entzündungsfördernde Reaktionen auf äußere Reize hervorzurufen, ist eine sorgfältige Berücksichtigung der 3D-Matrixbestandteile und der Bioprinting-Methode zur Einführung von Mastzellen in das 3D-Gerüst erforderlich, wie weiter diskutiert. Gewebekonstrukte können aus zwei großen Kategorien von Biomaterialien biofabriziert werden, nämlich Biotinten und Biomaterialtinten. Der Unterschied liegt in der Tatsache, dass Biotinten zellbeladene Hydrogel-Verbundwerkstoffe sind, während Biomaterial-Tinten Hydrogel-Komposite sind, die frei von Zellen sind, wie von Groll et ^al.13,14 definiert. Daher enthalten 3D-Konstrukte, die mit Biotinten gedruckt werden, Zellen, die in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, während 3D-Konstrukte, die mit Biomaterialtinten gedruckt werden, mit Zellen nach dem Drucken ausgesät werden müssen. Die Biofabrikation von Kulturgerüsten aus Hydrogel-basierten Biotinten/Biomaterialtinten wird am häufigsten mit Extrusions-3D-Bioprintern durchgeführt, die die Bioink-/Biomaterialtinte durch eine mikroskalige Düse unter Druck entweder über einen pneumatisch oder mechanisch angetriebenen Kolben ^{extrudieren14}. Extrusionsbioprinter stellen 3D-Gerüste her, indem sie die Bioink in 2D-Querschnittsmustern ablegen, die nacheinander in einem "Bottom-up" -Ansatz aufeinander gestapelt werden.

Um mit dem Extrusions-Bioprinting kompatibel zu sein, muss die Hydrogel-basierte Bioink/Biomaterial-Tinte thixotrope (scherverdünnende) Eigenschaften besitzen, wobei die konstituierenden Hydrogelpolymere der Bioink/Biomaterial-Tinte bei Scherspannung wie eine Flüssigkeit durch eine Mikrokanaldüse fließen, aber bei Entfernung der Scherspannung in einen viskosen, gelartigen Zustand ^{zurückkehren15} . Aufgrund ihres hohen Wassergehalts müssen die Polymere von Hydrogel-basierten Biotinten / Biomaterialtinten entweder physikalisch oder kovalent vernetzt werden, um die Architektur und strukturelle Integrität der 3D-biogedruckten Struktur zu erhalten. Bei zellbeladenen Biotinten werden die Zellen während des Vernetzungsprozesses direkt chemischen Belastungen ausgesetzt. Der Prozess der Extrudierung von Zellen, die in der Bioink-Hydrogel-Matrix eingekapselt sind, setzt die Zellen auch Scherstress aus, was zu einer verminderten Lebensfähigkeit und / oder zum Zelltod führen kann. Sobald das 3D-Gewebemodell biogedruckt wurde, ist es schwierig, zwischen dem Grad der Zytotoxizität, der durch die Hydrogelmatrix selbst hervorgerufen wird, und den Extrusions- bzw. Vernetzungsprozessen zu unterscheiden. Dies ist besonders herausfordernd im Zusammenhang mit 3D-Gerüsten, bei denen die Zellen in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, was es schwierig macht, die Zellen für nachfolgende Analysen zu entfernen, was die Lebensfähigkeit von Mastzellen beeinträchtigen würde.

Ein schonenderer Ansatz zur Erzeugung von 3D-Gewebekonstrukten, die Mastzellen enthalten, besteht darin, die Zellen in vorgedruckte, poröse Biomaterial-Tinten-3D-Gerüste aus einer Zellkultursuspension zu säen, die die angeborene Fähigkeit von Mastzellen nutzt, aus dem Kreislauf in periphere Gewebe zu wandern. Die Vorteile dieses Zellsaatansatzes sind zweifach: (i) Die Mastzellen werden keiner Scher- bzw. chemischen Belastung durch die Extrusions- bzw. Vernetzungsprozesse ausgesetzt, und (ii) die Zellen können nach der Exposition durch sanftes Waschen zur Analyse leicht aus dem 3D-Gerüst entfernt werden, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der zusätzliche Vorteil der Aussaat und Analyse der Zelllebensfähigkeit von Mastzellen auf 3D-biogedruckten, porösen Hydrogel-Gerüsten im Gegensatz zu 2D-Hydrogel-Scheiben besteht darin, dass die 3D-biogedruckten Hydrogel-Gerüste mikroskalige topographische Merkmale von In-vivo-Geweben rekapitulieren, die in großen, planaren 2D-Hydrogelscheiben nicht vorhanden sind. Dieser Ansatz ist ein geeigneter, schneller und kostengünstiger Ansatz, um die potenziell katastrophalen zytotoxischen Wirkungen von Bioink-Hydrogel-Matrices auf Mastzellen sowie andere immunologische Zellen zu bestimmen, bevor in kostspielige 3D-Tissue-Engineering-Experimente investiert wird.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus fünf Abschnitten: (1) Isolierung des Knochenmarks der Maus und Differenzierung von aus dem Knochenmark der Maus stammenden Mastzellen (BMMCs), (2) Herstellung von CNC/Agarose/D-Mannitol-Hydrogel-Substraten in einem 24-Well-System und Kultur von BMMCs auf den Substraten, (3) Entfernung von BMMCs aus den CNC/Agarose/D-Mannitol-Hydrogel-Substraten und Analyse der Lebensfähigkeit und Biomarkerexpression mittels Durchflusszytometrie, (4) 3D-Bioprinting von Hydrogelgerüsten aus einer kommerziell erhältlichen fibrillären Nanocellulose (FNC)/Natriumalginat-Verbund-Biomaterialtinte und (5) Kultur von BMMCs auf FNC/Natriumalginat-Hydrogel-Gerüsten und Analyse der Lebensfähigkeit mittels Durchflusszytometrie, XTT und Laktatdehydrogenase (LDH)-Mikrotiterassays.

1. Generierung der BMMC-Kultur

HINWEIS: Mäuse wurden durch _{CO2-Ersticken} nach Isoflurananästhesie eingeschläfert. Tibia und Femur wurden isoliert und das gesamte Knochenmark geerntet. Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Genehmigung des Health Science Animal Care and Use Committee der University of Alberta durchgeführt.

1. Bereiten Sie das vollständige RPMI-1640-Kulturmedium vor, indem Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Nahrungsergänzungsmittel zu den angegebenen Endkonzentrationen hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit NaOH auf 7,4-7,6 ein, filtrieren Sie mit einem Einweg-Flaschenverschlussfilter (0,2 μm Porengröße) und lagern Sie ihn bis zu 2 Monate bei 4 ° C im Dunkeln.
2. Erhalten Sie Femuren von Mäusen in Übereinstimmung mit den lokalen Protokollen und Verfahren des University Animal Care Committee.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden Femuren aus C57BL/6-Mäusen isoliert, aber jeder Stamm kann verwendet werden, wenn er für die Studie relevant ist.
3. Entfernen Sie Haut und Muskeln mit einer Schere aus dem Hüftgelenk, und ziehen Sie dann den Oberschenkelknochen vorsichtig ab, indem Sie ihn leicht aus der Hüftpfanne drehen (Abbildung 1). Achten Sie darauf, den Hüftkopf nicht abzubrechen. Schneiden Sie die Tibia vom Femur an der medialen Fabella mit einer Schere ab. Entfernen Sie die Pfote, indem Sie knapp über dem Kalkaneum schneiden und verwerfen.
4. Entfernen Sie mit einem Skalpell Haut und Knorpel von Femur- und Tibiastücken. Machen Sie mit einer Schere einen sauberen Schnitt an jedem Ende des Femurs und der Tibia und legen Sie das rote Knochenmark im Inneren frei. Falls erforderlich, entfernen Sie das Wadenbein an dieser Stelle, aber beachten Sie, dass es bei der Manipulation der Tibia während der Knochenmarkrötung helfen kann.
5. Bereiten Sie eine 26 G-Nadel mit einer 5-ml-Luer-Lock-Spritze vor und füllen Sie sie mit ca. 5 ml vollständigem Medium, das wie oben beschrieben hergestellt wurde.
   HINWEIS: An dieser Stelle kann auch unvollständige RPMI ohne die Additive verwendet werden, um Reagenzien zu sparen.
6. Halten Sie den Femur oder die Tibia mit einer Pinzette fest, führen Sie die Nadel in ein Ende des Knochens ein und drücken Sie vorsichtig auf die Spritze. Halten Sie den Knochen über ein 50 ml steriles konisches Röhrchen und injizieren Sie vorsichtig etwa 5 ml Medium in den Knochen, wobei Sie etwas Druck ausüben. Beobachten Sie, wie Knochenmarkstücke am anderen Ende des Knochens als dünne rote Bänder in die konische Röhre fallen.
7. Die Aspirate nach unten drehen und in einem vollständigen Medium resuspendieren oder direkt in einen sterilen T175 ^{cm2-Gewebekulturkolben} mit 50 ml vollständigem RPMI-1640-Medium überführen. Halten Sie die Aspirate in einem vollständigen RPMI-1640-Medium mit 30 ng/ml rekombinantem Interleukin (IL)-3 für die Maus.
8. Nach 1 Tag beobachten Sie die Kulturen unter einem Lichtmikroskop. Die Kultur wird aus einer heterogenen Population von Zellen unterschiedlicher Form und Größe und noch größeren Knochenmarkstücken bestehen. Füttern Sie Zellkulturen durch Zugabe von 15 ml frischem Medium alle 3-5 Tage unter Verwendung des vollständigen RPMI-1640-Mediums wie oben beschrieben und stellen Sie sicher, dass die Zelldichte niemals 1 × ¹⁰⁶ Zellen / ml überschreitet. Einmal pro Woche die Zellen bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur herunterdrehen, in frischem vollständigem RPMI-1640-Medium resuspendieren und 1:4 in 50 ml Medium in frische T175-Kolben teilen.
9. Bestimmen Sie nach 4 Wochen die Zellreinheit, indem Sie die Oberflächenexpression von CD117 (Kit) und FceRI-Rezeptoren mittels Durchflusszytometrie messen, wie unten beschrieben (Abschnitt 3.2).
   HINWEIS: Nach 4 Wochen sollten 99% der Zellen doppelt positiv auf CD117 (Kit) und FcεRI sein.
10. Halten Sie die BMMCs mit 20 ng/ml IL-3 ab 4 Wochen im vollständigen RPMI-1640-Medium. Nach etwa 6 Wochen hören die Zellen auf, sich zu teilen und müssen nicht mehr gespalten werden. Füttern Sie die Kulturen alle 3-5 Tage, pelletieren Sie die Zellen einmal pro Woche durch Zentrifugation und resuspenieren Sie in frischem vollständigem RPMI-1640-Medium.

2. Herstellung der CNC/Agarose/D-Mannitol-Hydrogel-Substrate und BMMC-Kultur

1. In einer Glasflasche 0,2 g Agarosepulver zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (2% w/v) auf ein Endvolumen von 10 mL geben und 1 min bei 100 °C kochen, um sich aufzulösen.
2. 2,5 g CNC-Pulver in PBS auf ein Endvolumen von 10 ml auflösen, um eine 25%ige W/V-Mischung herzustellen.
3. Lösen Sie 2 g CNC-Pulver in PBS auf ein Endvolumen von 10 ml auf, um eine 20% ige W / V-Mischung herzustellen, und verdünnen Sie die 20% W / V-Mischung seriell, um 10,5 und 2% W / V-CNC-Mischungen herzustellen.
4. Erhitzen Sie die 25, 20, 10, 5 und 2% w/v CNC-Mischungen für 10 min auf 37 °C (Abbildung 2A).
5. 0,46 g D-Mannitol in die heiße Agaroselösung (4,6 % w/v) geben und auflösen.
6. Mischen Sie die vorgewärmten 25, 20, 10, 5 und 2% w/v CNC-PBS-Gemische mit der heißen Agarose/D-Mannitol-Lösung in separaten konischen Rohren im Verhältnis 1:1, um endgültige CNC-Konzentrationen von 12,5, 10, 5, 2,5 und 1% w/v in den Hydrogelmischungen zu erhalten.
7. Wenn Sie schnell arbeiten, fügen Sie 500 μL/Well der oben genannten Lösungen, die in Schritt 2.6 vorbereitet wurden, in vierfacher Ausfertigung zu einer 24-Well-Kulturplatte hinzu und lassen Sie sie bei Raumtemperatur 30 min stehen, um die Polymerisation zu erleichtern (Abbildung 2B).
8. Schichten Sie vorsichtig 1000 μL der BMMC-Suspension mit einer Dichte von 1,1 × ¹⁰⁶ Zellen / ml mit einem Mikropipettor auf die Hydrogelsubstrate und vermeiden Sie es, das Gel mit der Pipettenspitze zu berühren, da dies die Geloberfläche beschädigt und Partikel erzeugt.
9. Inkubieren Sie die BMMCs auf den Hydrogelsubstraten in einem sterilen Inkubator (5% _CO2, befeuchtete Atmosphäre) bei 37 °C für 18 h.

3. Durchflusszytometrische Analysen

1. Durchflusszytometrische Analyse der BMMC-Lebensfähigkeit durch PI-Ausschluss
   1. Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium, das BMMCs enthält, von der Oberseite des CNC / Agarose / D-Mannitols, vermeiden Sie das Gel und übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 ml Mikrofugenröhrchen.
   2. Waschen Sie die BMMCs zweimal mit PBS (pH 7,4) mit 0,5% w/v Rinderserumalbumin bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und resuspenieren Sie in 180 μL PBS-0,5% w/v BSA auf eine Enddichte von 1,5 × ¹⁰⁶ Zellen/ml. Übertragen Sie die Zellen auf eine 96-Well-Rundbodenplatte.
      HINWEIS: Filtern Sie alle PBS-0,5% w/v BSA-Lösungen zweimal mit einem Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm und lagern Sie sie bei 4 °C.
   3. 20 μL PBS-0,5% w/v BSA oder 10x PI (100 μg/ml), hergestellt in PBS-0,5% w/v BSA, zu den Zellen auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml geben und entweder 1 h bei 4 °C oder 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Erfassen Sie Fluoreszenzdaten mit einem Durchflusszytometer, das mit einem Argon-Ionenlaser (488-514 nm) und einem Bandpassfilter ausgestattet ist, um die Detektion der Fluoreszenzemission bei 578 nm zu ermöglichen. Erfassen Sie 20.000 Ereignisse pro Probe bei einem Durchfluss von 30 μL/min bei Raumtemperatur. Analysieren Sie die Daten wie unten beschrieben (Abschnitte 3.2.7-3.2.10).
2. Durchflusszytometrische Analyse von BMMCs für Kit (CD117) und FcεRI-Oberflächenrezeptorexpression
   1. Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium, das BMMCs enthält, von der Oberseite des CNC / Agarose / D-Mannitols, vermeiden Sie das Gel und übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 ml Mikrofugenröhrchen.
   2. BMMCs zweimal mit gefiltertem PBS-0,5% BSA bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur waschen und in 180 μL PBS mit 0,5% w/v BSA (1,5 × ¹⁰⁶ Zellen/ml) resuspendieren. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf eine 96-Well-Rundbodenplatte.
   3. Den Zellen werden 20 μL 10x Antikörper-Arbeitslösungen zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,06 μg/ml CD117 (c-Kit)-Phycoerythrin (PE) bzw. 0,06 μg/ml FcεRIα-Allophycocyanin (APC) zu erreichen.
      HINWEIS: Die 10x Antikörper-Arbeitslösungen müssen in filtriertem PBS-0,5% w/v BSA hergestellt werden.
   4. 20 μL 10x Isotyp-Kontrollarbeitslösungen, die entweder Ratten-IgG2b κ-Isotyp-Kontroll-PE oder armenischen Hamster-IgG-Isotyp-Kontroll-APC enthalten, werden hinzugefügt, um Vertiefungen zu trennen, die Zellen enthalten, die nicht mit einem der Antikörper-Fluorophor-Konjugate in Schritt 3.2.3 gefärbt wurden.
      HINWEIS: Die Isotyp-Kontrollen, Ratten-IgG2b κ-Isotyp-Kontroll-PE und armenischer Hamster IgG-Isotyp-Kontroll-APC dienen zur Kontrolle der unspezifischen Bindung von Antikörpern an das BMMC. Da BMMCs keine hohen FcR-Spiegel exprimieren, wird mit Isotyp-Kontrollantikörpern selten eine hohe Hintergrundfluoreszenz nachgewiesen. Bereiten Sie die 10x Isotype Control Working Solutions in filtersterilisiertem PBS-0,5% w/v BSA vor.
   5. Inkubieren Sie die 96-Well-Rundbodenplatte für 1 h bei 4 °C im Dunkeln.
   6. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μL frisches PBS-0,5% mit BSA-Puffer in jede Vertiefung geben und bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu berühren; lassen Sie etwas Überstand zurück, um sicherzustellen, dass das Zellpellet ungestört bleibt.
   7. Nach dem Waschen resuspend Zellen in 100 μL 0,5% w/v BSA, 0,05% w/v Natriumazid in PBS (pH 7,4), das zweimal mit einem 0,2 μm porengroßen Spritzenfilter sterilfiltriert wurde. Erfassen Sie Fluoreszenzdaten in den PE- und APC-Detektorkanälen mit einem Durchflusszytometer, wie oben in Schritt 3.1.3 beschrieben.
   8. Analysieren Sie Daten mit einer Software, die in der Lage ist, durchflusszytometrische Datendateien mit der Erweiterung ".fcs" anzuzeigen und zu analysieren.
   9. Beginnen Sie mit der Analyse, indem Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) entlang der x-Achse und die Seitenstreuung (SSC) entlang der y-Achse und das Tor für die konservierte Zellpopulation mit einem FSC-Bereich von _log10 1,5-5,0 und einem SSC-Bereich von _log10 0,75-3,25 in den unbehandelten und nicht gefärbten Zellen darstellen, wie in Abbildung 3A(i),(ii) dargestellt.
      HINWEIS: Dies dient dazu, sicherzustellen, dass Zelltrümmer mit niedrigen FSC- und SSC-Werten aus der Analyse eliminiert werden. Mastzellen sind normalerweise sehr granulare (hohe SSC) Zellen und groß (hoher FSC) im Vergleich zu anderen immunologischen Zelltypen wie Monozyten und Lymphozyten.
   10. Als nächstes generieren Sie FSC- vs. SSC-Punktdiagramme und Histogrammprofile von unbehandelten Proben, die mit den Farbstoff-, Antikörper- oder Isotypkontrollen gefärbt wurden, und erhalten die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in den PE- oder APC-Kanälen entsprechend dem Emissionsspektrum des spezifischen Antikörper-Fluorophor-Konjugats oder Farbstoffs, der verwendet wird. Wenden Sie den gleichen Satz von Gattern und Parametern auf alle BMMC-Proben an, die mit verschiedenen CNC/Agarose/D-Mannitol-Substraten inkubiert und mit den entsprechenden Isotypkontrollen, Antikörpern oder Farbstoffen gefärbt wurden; MFIs erhalten.
       HINWEIS: Im Wesentlichen sollten die FSC- vs. SSC-Punktdiagramme der unbehandelt gefärbten Proben nicht von unbehandelten/nicht gefärbten Proben zu unterscheiden sein, die in Schritt 3.2.9 erhalten wurden, um sicherzustellen, dass das Färbeverfahren die Zellgröße (gemessen durch FSC) oder granularität (gemessen durch SSC) nicht verändert (Abbildung 3A(i),(ii)).
   11. Berechnen Sie die durchschnittlichen MFIs und den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für jede Stichprobe aus 4 unabhängigen Experimenten, gefolgt von der Generierung von Graphen mit einem softwarepaket für die statistische Analyse.
   12. Bereiten Sie Histogramm-Overlays in der Software zur Analyse der durchflusszytometrischen Daten vor (Abbildung 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D Bioprinting von FNC/Natriumalginat-Hydrogel-Substraten

HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete 3D-Bioprinter ist ein pneumatisches Extrusionssystem, das mit zwei unabhängigen, temperaturgesteuerten Druckköpfen ausgestattet ist. Die Biomaterialtinte, die zum 3D-Biodruck der Hydrogelgerüste verwendet wird, besteht aus (a) hochhydratisierter fibrillerer Nanocellulose (FNC), die kollagen morphologisch ähnlich ist, (b) Natriumalginat und (c) D-Mannitol. Es wird als sterile Hydrogel-Suspension in 3 ml Kartuschen geliefert, an denen sterile konische Bioprinting-Düsen mit Luer-Lock (22, 25 oder 27 G) angebracht werden können.

1. Verwenden Sie dieses Protokoll mit den Druckköpfen und dem Druckbett bei Raumtemperatur, wo die Raumtemperatur 20-25 °C beträgt.
2. Lagern Sie die Tintenpatronen aus Biomaterial bei 4 °C, um die Stabilität des Hydrogel-Verbundwerkstoffs zu erhalten. Bevor Sie mit dem 3D-Biodruck beginnen, nehmen Sie eine Patrone (3 ml) aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausgleichen.
3. Einbau einer Bioink Kartusche auf den INKREDIBLE+ 3D Bioprinter
   1. Entfernen Sie die blauen Endkappen von der 3-ml-Tintenpatrone aus Biomaterial (Abbildung 5B(i)), und befestigen Sie eine sterile konische Bioprinting-Düse mit 22 G (blau) am Luer-Lock-Ende der Bioink-Kartusche.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die gewünschte konische Bioprinting-Düse vor dem Einsetzen der Kartusche und der Durchführung der nachfolgenden Kalibrierungsschritte an der Biotintenpatrone anzubringen, da dies zu einer unsachgemäßen Kalibrierung der z-Achse des 3D-Bioprinters führt.
   2. Schließen Sie den Luftdruckzufuhrschlauch für Druckkopf 1 (PH1, links) an das gegenüberliegende Ende der Patrone an, und setzen Sie die Patrone mit der angeschlossenen konischen Biodruckdüse in den vertikalen Steckplatz von PH1 ein (Abbildung 5A(ii)).
   3. Setzen Sie die Patrone fest in PH1 ein, wobei die konische Bioprinting-Düse unter den Druckkopf reicht. Ziehen Sie die Schraube am PH1 im Uhrzeigersinn fest, bis sie fingerfest ist, um die Bioink-Patrone zu verriegeln. Beachten Sie, dass 3D-Bioprinting mit PH2 durchgeführt werden kann, der leer bleibt.
4. Kalibrierung der x-y-z-Achsen des 3D-Bioprinters
   1. Schalten Sie den 3D-Bioprinter ein und starten Sie die Bioprinter-Software auf einem PC, der über ein USB 2.0-Kabel mit dem 3D-Bioprinter verbunden ist.
   2. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche VERBINDEN , um die Software mit dem 3D-Bioprinter zu synchronisieren.
      HINWEIS: Die Synchronisierung ist erfolgreich, wenn die Ultraviolett-Leuchtdioden des Druckkopfs ein- und ausgeschaltet wird und der HEPA-Filterlüfter ein- und wieder eingeschaltet wird. Die Software muss mit dem 3D-Bioprinter synchronisiert werden, bevor die Bioprinter-Achsen und die Startpunktkalibrierung wie in den folgenden Schritten beschrieben werden.
   3. Beachten Sie vier Optionen im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters: (i) PREPARE BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU und (iv) STATUS SCREEN. Wählen Sie die Option PREPARE BIOPRINT aus, scrollen Sie dann nach unten und wählen Sie die Option HOME AXES aus.
      HINWEIS: Der 3D-Biodrucker bewegt dann die Druckkopfbaugruppe nach hinten und links, um die y- bzw. x-Achse zu kalibrieren. Danach, wenn die Druckköpfe in der äußersten linken Position pausiert sind, hebt der Bioprinter das Druckbett an, bis der Z-Achsen-Kalibrierschalter (auf dem Druckbett) Kontakt mit der konischen Bioprinting-Düse aufnimmt, die auf Druckkopf 1 installiert ist
   4. Beobachten Sie nach erfolgreicher Kalibrierung der x-y-z-Achsen das leichte Absenken des Druckbetts und die Verlagerung der Druckköpfe über den Mittelpunkt des Druckbetts (Abbildung 5A(i)).
5. Startpunktkalibrierung des Bioprinters für das Bioprinting in 24-Well-Platten
   1. Entfernen Sie eine sterile 24-Well-Kulturplatte aus der versiegelten Plastikverpackung und markieren Sie einen Punkt von am Mittelpunkt von Vertiefung D1 auf der Unterseite der Platte mit einem Permanentmarker. Entfernen Sie die Plattenabdeckung, und legen Sie die 24-Well-Kulturplatte auf das Druckbett mit vertiefung D1 in der vorderen linken Ecke des Druckbetts.
   2. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü die Option DIENSTPROGRAMMMENÜ und dann ACHSE VERSCHIEBEN aus. Bewegen Sie die Druckköpfe in 1-mm-Schritten entlang der x- und y-Achse, bis sich die konische Bioprinting-Düse von PH1 direkt über dem Punkt befindet, der unter Vertiefung D1 markiert ist. Passen Sie bei Bedarf die Position der konischen Bioprinting-Düse über dem Punkt ab, indem Sie die Druckköpfe in Schritten von 0,1 mm bewegen.
   3. Zeichnen Sie die x- und y-Koordinaten der konischen Bioprinting-Düse auf, wenn Sie sich direkt über der Mitte der Vertiefung D1 befinden, wie auf dem Bedienfeldbildschirm des 3D-Biodruckers angegeben.
      HINWEIS: Im Falle des hier verwendeten INKREDIBLE+ 3D-Bioprinters lauten die x- und y-Koordinaten wie folgt: x : -46,5 und y : -27,5. Diese Koordinaten dienen als Ausgangspunkt in der Mitte der Vertiefung D1 für das Bioprinting in einer 24-Well-Platte.
   4. Als nächstes heben Sie das Druckbett in Schritten von 1 mm an, bis der Boden der Vertiefung D1 fast die konische Biodruckdüse berührt, die in Druckkopf 1 installiert ist. Feinabstimmung der Bewegung des Druckbetts in Schritten von 0,1 mm, falls erforderlich (Abbildung 5A(ii)). Wählen Sie dann im MENÜ DIENSTPROGRAMME die Option Z-AXIS-KALIBRIERUNG aus und wählen und bestätigen Sie die Option Z-KALIBRIERUNG SPEICHERN .
   5. Kehren Sie zum Hauptmenü zurück und wählen Sie die Option BIOPRINT VORBEREITEN . Scrollen Sie nach unten zu und wählen Sie die Option KALIBRIEREN Z .
      HINWEIS: Der 3D-Bioprinter senkt nun das Druckbett ab, wenn die Kalibrierung der z-Achse erfolgreich ausgeführt wurde (Abbildung 5A(iii)).
6. Aktualisieren der 24-Well-Platten-G-Code-Datei mit korrekten Startpunktkoordinaten
   1. Öffnen Sie die mitgelieferte 24-Well Plate Geometric Code (G-Code) Datei in der Bioprinter Software (Supplemental File 1).
      HINWEIS: Diese 24-Well-G-Code-Datei kodiert den Druck von 2-schichtigen 5 x 5 x 1 mm geradlinigen Konstrukten in jeder Vertiefung (Abbildung 5C(i),(iii)). Die mitgelieferten G-Code-Dateien können mit jeder 3D-Bioprinting-Software verwendet werden.
   2. Beachten Sie, dass Zeile 1 der G-Code-Datei G0 X-50.0 Y-33.5 lautet; Center Position von D1 gut. Aktualisieren Sie die x- und y-Koordinaten in Zeile 1 mit den in Schritt 4.5.3 erhaltenen Werten, d.h. Zeile 1 sollte jetzt G0 X-46.5 Y-27.5 lauten; Center Position von D1 gut. Speichern Sie die Datei unter einem neuen Namen.
      HINWEIS: Dieses Verfahren dient zur Kalibrierung der G-Code-Datei, so dass der Druck in der Mitte der Vertiefung D1 basierend auf den x,y-Koordinaten des verwendeten 3D-Biodruckers beginnt. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die 24-Well-Platten-G-Code-Datei für den Druck mit jedem Extrusions-3D-Bioprinter zu kalibrieren. Für die Zwecke dieser Studie wurde nur die linke Hälfte der 24-Well-Platte gedruckt, d.h. die Vertiefungen A1-3, B1-3, C1-3 und D1-3. Eine separate G-Code-Datei, die das Drucken von 2-schichtigen 5 x 5 x 1 mm geradlinigen Konstrukten in einem 3 x 4-Raster codiert, wird ebenfalls bereitgestellt (Ergänzende Datei 2, Abbildung 5C(ii)).
7. Einstellung des Extrusionsdrucks für Druckkopf 1 (PH1)
   1. Stellen Sie sicher, dass die pneumatische Pumpe fest mit dem hinteren Luftansauganschluss des INKREDIBLE+ 3D-Biodruckers verbunden ist, und schalten Sie die pneumatische Pumpe ein.
   2. Ziehen Sie den vorderen Steuerknopf auf der rechten Seite des INKREDIBLE+ 3D-Biodruckers heraus.
      HINWEIS: Der vordere Steuerknopf passt den Druck für PH1 an, während der hintere Steuerknopf den Druck für PH2 anpasst.
   3. Beachten Sie, dass die digitalen Manometer für PH1 und PH2 auf der Vorderseite des Biodruckers jeweils fast 0 kPa ablesen. Drehen Sie den vorderen Steuerknopf langsam im Uhrzeigersinn, bis der auf dem linken Messgerät für PH1 angezeigte Druck 12 kPa erreicht (Abbildung 5A(iii)).
   4. Legen Sie ein gefaltetes Seidenpapier oder ein Stück wasserdichte Dichtungsfolie unter die Druckdüse der installierten Patrone und achten Sie darauf, die Druckdüse nicht zu berühren.
   5. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters die Option PREPARE BIOPRINT aus.
   6. Navigieren Sie zu UND WÄHLEN SIE PH1 EINSCHALTEN aus. Beachten Sie, dass die Biomaterialtinte aus der Druckdüse zu extrudieren beginnt. Erhöhen Sie bei Bedarf den Extrusionsdruck, indem Sie den Steuerknopf im Uhrzeigersinn drehen, bis die Biomaterialtinte in einem kontinuierlichen Filament extrudiert ist, und zeichnen Sie die neue Druckeinstellung auf. Arbeiten Sie schnell, um die Verschwendung von Biomaterialtinte zu vermeiden.
   7. Wählen Sie PH1 AUSSCHALTEN aus, um die Extrusion der Biomaterialtinte zu stoppen, entfernen Sie das Seidenpapier oder die Folie, die die extrudierte Biomaterialtinte enthält, aus dem Druckbett und schließen Sie die Bioprinter-Tür.
      HINWEIS: Der 3D-Bioprinter schaltet die Luftdruckzufuhr zu PH1 während des Druckens automatisch ein, wie in der G-Code-Datei angegeben.
8. 3D-Bioprinting von geradlinigen Hydrogelsubstraten im 24-Well-Plattenformat
   1. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Biodruckers die Option DIENSTPROGRAMME MENU. Navigieren Sie zu und wählen Sie DISABLE SD PRINT, wodurch die Bioprinter-Software G-Code-Dateien zum Drucken an den 3D-Bioprinter übertragen kann.
   2. Klicken Sie in der Bioprinter-Software auf die Schaltfläche LOAD und wählen Sie die aktualisierte 24-Well-Platten-G-Code-Datei aus, die in Schritt 4.6.2 gespeichert wurde.
   3. Wählen Sie im rechten Bedienfeld der Software die Registerkarte DRUCKVORSCHAU und klicken Sie auf die Schaltfläche DRUCKEN , um mit dem Biodruck in Bohrloch D1 zu beginnen.
      HINWEIS: Wenn Sie die G-Code-Datei der 3 x 4-Gitterbohrlochplatte verwenden, endet der Biodruck in Vertiefung A3 der 24-Well-Platte (Abbildung 5C(ii),D), im Gegensatz zu Vertiefung A6, wenn eine vollständige 24-Well-Platte gedruckt wird.
   4. Nach Abschluss des Bioprintings der geradlinigen Konstrukte decken Sie die 24-Well-Platte mit ihrem Deckel ab und bringen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II.
   5. Tauchen Sie jedes geradlinige Konstrukt in zwei Tropfen steriler 50 mM _{CaCl2-Lösung} (Abbildung 5B(ii)) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
      HINWEIS: Dies dient dazu, die Alginat-Polymerketten ionisch mit den ^Ca2+- Ionen zu vernetzen und es den geradlinigen Konstrukten zu ermöglichen, ihre strukturelle Integrität zu erhalten.
   6. Die _{CaCl2-Lösung} vorsichtig aus jedem Konstrukt absaugen und einmal in 1 ml 1x PBS (pH 7,4) abspülen, um überschüssiges _CaCl2 zu entfernen (Abbildung 5D).
   7. Um eine Austrocknung der biogedruckten Hydrogelkonstrukte zu verhindern, halten Sie die 3D-biogedruckten geradlinigen Konstrukte in frischen 1x PBS, bis die BMMCs bereit sind, auf die Konstrukte gesät zu werden (Abbildung 5D).

5. Inkubation von BMMCs auf 3D-biogedruckten geradlinigen Gerüsten und Lebensfähigkeitstests

1. Inkubation von BMMCs auf 3D-biogedruckten geradlinigen Hydrogelgerüsten
   1. Samen Sie Aliquots von BMMCs auf die 3D-biogedruckten geradlinigen Gerüste in dreifacher Ausführung für vier verschiedene Zeiträume, z. B. 6, 18, 24 und 48 h, so dass alle Behandlungen gleichzeitig beendet werden. Verwenden Sie BMMCs, die in leeren Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung für die gleiche Dauer wie unbehandelte Kontrollen ausgesät werden.
   2. Aseptisch BMMCs aus einem T175 ^{cm2-Kulturkolben} in ein steriles 50-ml-Konusröhrchen überführen und die BMMCs bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur pelletieren.
   3. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 ml frischem vollständigem RPMI-Medium, das 20 ng / ml IL-3 enthält, und berechnen Sie die Dichte der lebenden Zellen, indem Sie ein Aliquot von Trypanblau gefärbten BMMCs mit einem Hämacytometer zählen.
   4. Basierend auf der in Schritt 5.1.3 berechneten Zelldichte wird ein 6 ml Aliquot der BMMC-Suspension bei einer Enddichte von 1 × ¹⁰⁶ Zellen/ml hergestellt.
   5. Für den 48-stündigen Inkubationsaufbau aspirieren Sie PBS aus den Vertiefungen A1-3, die die 3D-biogedruckten geradlinigen Hydrogelgerüste enthalten, und pipettieren Sie 1 ml BMMC-Suspension (1 × ¹⁰⁶ Zellen / ml) in jedes Bohrloch. Außerdem pipettieren Sie 1 ml BMMC-Suspension (1 × ¹⁰⁶ Zellen / ml) in die Vertiefungen A4-6 ohne biogedruckte Konstrukte, um als unbehandelte Kontrolle zu dienen. Inkubieren Sie die verbleibenden Vertiefungen, die biogedruckte Gerüste (B1-3, C1-3, D1-3) in RPMI ohne Zusatzstoffe enthalten, um eine Austrocknung zu verhindern, bis der geeignete Zeitpunkt für die Aussaat mit BMMC für die Behandlungsdauern von 24, 18 und 6 h erreicht ist. Füllen Sie die Vertiefungen ohne biogedruckte Gerüste (B4-6, C4-6, D4-6) mit 1 ml PBS, bis der geeignete Zeitpunkt für die Aussaat mit den BMMCs für die 24-, 18- und 6-h-Zeitpunkte erreicht ist.
   6. Inkubieren Sie die 24-Well-Platte bei 37 °C in einer 5% CO2-befeuchteten Atmosphäre.
   7. Für den 24-stündigen Inkubationsaufbau aspiratieren Sie bereits vorhandenes Kulturmedium/Puffer aus den Vertiefungen B1-6 und säen 1 ml BMMC-Suspension (1 × ¹⁰⁶ Zellen/ml) in diese Vertiefungen. Bringen Sie die Platte zum Inkubator zurück.
   8. Für den 18-stündigen Inkubationsaufbau aspiratieren Sie bereits vorhandenes Kulturmedium/Puffer aus den Vertiefungen C1-6 und säen 1 ml BMMC-Suspension (1 × ¹⁰⁶ Zellen/ml) in diese Vertiefungen. Bringen Sie die Platte zum Inkubator zurück.
   9. Für den 6-stündigen Inkubationsaufbau aspiratieren Sie bereits vorhandenes Kulturmedium/Puffer aus den Vertiefungen D1-6 und säen 1 ml BMMC-Suspension (1 × ¹⁰⁶ Zellen/ml) in diese Vertiefungen. Bringen Sie die Platte zum Inkubator zurück.
   10. Geben Sie zur Beendigung der Inkubation Proben aus jedem Bohrloch der 24-Well-Platte für (i) PI-Färbung und -Analyse mittels Durchflusszytometrie, (ii) XTT-Zelllebensfähigkeitstest und (iii) LDH-Freisetzungsassay ab. Stellen Sie daher sicher, dass eine runde 96-Well-Platte und die erforderlichen 1,5 ml Mikrofugenröhrchen rechtzeitig vor dem Endpunkt der Inkubation markiert werden.
2. Zellprobenahme für XTT-Stoffwechselassay
   1. Resuspendieren Sie die BMMCs im Kulturmedium in jedem Bohrloch gründlich und achten Sie darauf, die 3D-biogedruckten Hydrogelgerüste nicht zu beschädigen und zu fragmentieren.
   2. Aseptisch 40 μL der homogenen BMMC-Suspension aus jeder Vertiefung in sterile 1,5 ml Mikrofugenröhrchen mit 760 μL frischem vollständigem RPMI-Medium (Endvolumen = 800 μL) überführen und kurz mischen.
   3. Dosieren Sie 100 μL der verdünnten BMMC-Suspensionen in dreifacher Ausfertigung in eine flache 96-Well-Mikrotiterplatte, die für die Aufzeichnung von Absorptionsmessungen (siehe Materialtabelle) auf einem Mikroplattenspektrophotometer geeignet ist.
   4. Dosieren Sie 50 μL XTT-Arbeitslösung in jede Vertiefung, die die BMMC-Zellsuspension enthält, unter Verwendung einer Mehrkanal-Mikropipette.
      HINWEIS: Bereiten Sie die XTT-Arbeitslösung vor, indem Sie 5 ml XTT-Reagenz mit 100 μL Elektronenkopplungsreagenz mischen. Tauen Sie diese Komponenten ab -20 °C in einem 37 °C warmen Wasserbad unmittelbar vor Gebrauch auf.
   5. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 °C in einer 5% CO2-befeuchteten Atmosphäre für 24 h.
   6. Am Ende der Inkubation die 96-Well-Platte aus dem Inkubator entfernen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Aufzeichnung der Absorptionswerte auf einem Mikroplattenspektrophotometer bei 450 nm mit Hintergrundsubtraktion bei 650 nm.
3. Überstandsprobenahme für Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay
   1. Die verbleibenden BMMC-Suspensionen (960 μL) aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte in Mikrofugenröhrchen überführen und die Zellen bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur pelletieren.
   2. Pipettieren Sie drei 100 μL Aliquots des Zellkulturüberstandes aus jedem Mikrofugenröhrchen in eine 96-Well-Mikrotiter-Flachbodenplatte. Verwerfen Sie die übrig gebliebenen Überstände aus jedem Mikrofugenröhrchen und bewahren Sie die BMMC-Pellets zur weiteren Färbung mit PI in den Abschnitten 5.4.1-5.4.8 auf.
   3. 50 μL der LDH-Arbeitslösung werden in jedes 100 μL Aliquot überstanden pipettiert.
      HINWEIS: Zur Herstellung von LDH-Assay-Reagenzien siehe Supplemental File 3 .
   4. 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. 50 μL 1 M Essigsäure in jede Vertiefung pipettieren, um die Reaktion zu stoppen.
   6. Aufzeichnung der Absorptionswerte auf einem Mikroplattenspektrophotometer bei 490 nm mit Hintergrundsubtraktion bei 680 nm.
4. Durchflusszytometrische Analyse der BMMC-Lebensfähigkeit mittels Propidiumiodid (PI)-Ausschluss
   1. Resuspendieren Sie die BMMC-Pellets in den Flow-Wash-Puffer (PBS [pH 7,4] mit 0,5% w/v BSA) und pelletieren Sie die Zellen bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Wiederholen Sie den Waschschritt mit Flow-Wash-Puffer noch einmal.
   3. Resuspend jedes BMMC-Pellet in 400 μL Durchflusswaschpuffer.
      HINWEIS: Es wird insgesamt 24 resuspendierte BMMC-Proben geben: 12 BMMC-Proben, die auf biogedruckten Hydrogelsubstraten inkubiert werden (4 Zeitpunkte in dreifacher Ausführung) und 12 BMMC-Proben, die in Vertiefungen ohne biogedruckte Konstrukte inkubiert werden (4 Zeitpunkte in dreifacher Ausführung).
   4. In einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden werden 20 μL Flow-Wash-Puffer in die Vertiefungen A1-12 und B1-12 pipettiert. In derselben Mikrotiterplatte werden 20 μL 10x PI-Färbelösung (100 μg/ml PI im Durchflusswaschpuffer) in die Vertiefungen C1-12 und D1-12 pipettiert.
   5. Dosieren Sie 180 μL der 12 BMMC-Proben, die auf biogedruckten Hydrogelsubstraten inkubiert wurden, in die Vertiefungen A1-12 (eine Probe pro Vertiefung). Dosieren Sie 180 μL der 12 BMMC-Proben, die ohne biogedruckte Hydrogelsubstrate inkubiert wurden, in die Vertiefungen B1-12 (eine Probe pro Vertiefung). Verwenden Sie die BMMC-Proben, die in die Vertiefungen A1-12 und B1-12 abgegeben werden, als nicht gefärbte Kontrollen für jede Behandlungsbedingung (insgesamt 24 Kontrollen).
   6. Dosieren Sie 180 μL der 12 BMMC-Proben, die auf biogedruckten Konstrukten inkubiert wurden, in die Vertiefungen C1-12 (eine Probe pro Vertiefung). Dosieren Sie 180 μL der 12 BMMC-Proben, die ohne biogedruckte Konstrukte inkubiert wurden, in die Vertiefungen D1-12 (eine Probe pro Vertiefung).
      HINWEIS: Die BMMC-Proben in den Vertiefungen C1-12 und D1-12 werden mit einer endgültigen effektiven PI-Konzentration von 10 μg/ml (insgesamt 24 gefärbte Proben) gefärbt.
   7. Die Platte entweder für 1 h bei 4 °C oder 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   8. Am Ende der Inkubationszeit werden die Proben direkt von der Mikrotiterplatte auf einem Durchflusszytometer analysiert, wie zuvor in Abschnitt 3.1 beschrieben.

Ergebnisse

Eine der wichtigsten Eigenschaften einer erfolgreichen Biomaterialtinte oder eines Kultursubstrats ist die Biokompatibilität. In erster Linie darf das Substrat keinen Zelltod induzieren. Es gibt mehrere mikrotiterbasierte und durchflusszytometrische Methoden zur Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit und Nekrose; Diese Methoden sind jedoch nicht für die Analyse von Zellen geeignet, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind. In diesem Protokoll wird die oben genannte Einschränkung umgangen, indem die BMMCs auf das ...

Diskussion

Die Herstellung von biomimetischen 3D-Geweben erfordert die erfolgreiche Verschmelzung der Biotinte, die Komponenten der extrazellulären Matrix nachahmt, mit der zellulären Komponente(n), um physiologische Analoga von In-vivo-Geweben zu erzeugen. Dies erfordert die Verwendung von Primärzellen und nicht von transformierten Zellen bei der Herstellung physiologischer biomimetischer Gewebe. Primäre immunologische Zellen, wie Mastzellen, sind jedoch besonders anfällig für zytotoxische Wirkungen und phänotypisc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A
Acetic Acid (glacial)	Sigma Aldrich	AX0074-6
Agarose (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)	Thermo Fisher Scientific	17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)	Sigma Aldrich	N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)	BD	309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in	BD	305111
BioLite 24 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	930-186
BioLite 96 Well Multidish	Thermo Fisher Scientific	130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented	Thermo Fisher Scientific	130-191
Biosafety Cabinet Class II	Microzone Corp., Canada	BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur)	EMD Millipore Corporation	2930-100GM
C
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory	000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)	Thermo Fisher Scientific	12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)	CELLINK LLC	IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL	CELLINK LLC	CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps	CELLINK LLC	CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC	CELLINK LLC	Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER	CELLINK LLC	S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G	CELLINK LLC	NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G	CELLINK LLC	NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G	CELLINK LLC	NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)	Sigma Aldrich	11465015001
Centrifuge (Benchtop)	Eppendorf	5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate	Sigma Aldrich	CLS3370
CO2 Incubator	Binder GmbH, Germany	9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter	A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)	Fisher Scientific	44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile	Corning	352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)	Thermo Fisher Scientific	17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	12484028
FlowJo Software	Becton Dickinson & Co. USA	Version 10.6.2
G
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)	VWR	15170-208
HEPES Sodium Salt	Fisher Scientific	BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT)	Sigma Aldrich	I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
Lithium L-lactate	Sigma Aldrich	L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)	Sigma Aldrich	M8640
Microtubes (1.7 mL clear)	Axygen	MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear)	Axygen	MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)	Millipore	ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)	Thermo Fisher Scientific	725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)	Thermo Fisher Scientific	12-4031-82
Recombinant Murine IL-3	PeproTech, Inc.	213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)	GE Healthcare	SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)	Fisher Scientific	NC9913213
Sodium Azide, 500 g	Fisher Scientific	BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma Aldrich	252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)	Sigma Aldrich	93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0