Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

Riepilogo

Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.

Abstract

Lo studio della risposta al danno al DNA (DDR) è un campo complesso ed essenziale, che è diventato più importante solo a causa dell'uso di farmaci mirati alla DDR per il trattamento del cancro. Questi bersagli sono poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), che avviano varie forme di riparazione del DNA. L'inibizione di questi enzimi utilizzando inibitori PARP (PARPi) raggiunge una letalità sintetica conferendo una vulnerabilità terapeutica nelle cellule carenti di ricombinazione omologa (HR) a causa di mutazioni nel cancro al seno di tipo 1 (BRCA1), BRCA2 o partner e localizzatore di BRCA2 (PALB2).

Le cellule trattate con PARPi accumulano rotture a doppio filamento di DNA (DSB). Queste rotture vengono elaborate dal meccanismo di resezione finale del DNA, portando alla formazione di DNA a singolo filamento (ss) e alla successiva riparazione del DNA. In un contesto carente di BRCA1, la resezione rinvigorente del DNA attraverso mutazioni in inibitori della resezione del DNA, come 53BP1 e DYNLL1, causa resistenza al PARPi. Pertanto, essere in grado di monitorare la resezione del DNA nel cellulo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e lo sviluppo di nuove strategie per superare la resistenza al PARPi. Le tecniche basate sull'immunofluorescenza (IF) consentono il monitoraggio della resezione globale del DNA dopo il danno al DNA. Questa strategia richiede l'etichettatura del DNA genomico a impulsi lunghi con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU). Dopo il danno al DNA e la resezione finale del DNA, il DNA a singolo filamento risultante viene specificamente rilevato da un anticorpo anti-BrdU in condizioni native. Inoltre, la resezione del DNA può anche essere studiata utilizzando marcatori del ciclo cellulare per differenziare tra le varie fasi del ciclo cellulare. Le cellule nella fase S/G2 consentono lo studio della resezione finale all'interno di HR, mentre le cellule G1 possono essere utilizzate per studiare l'unione finale non omologa (NHEJ). Un protocollo dettagliato per questo metodo IF accoppiato alla discriminazione del ciclo cellulare è descritto in questo documento.

Introduzione

La modulazione dei fattori di riparazione del DNA è un metodo in continua evoluzione per la terapia del cancro, in particolare negli ambienti tumorali carenti di riparazione del DNA DSB. L'inibizione di specifici fattori di riparazione è una delle strategie ingegnose utilizzate per sensibilizzare le cellule tumorali agli agenti dannosi per il DNA. Decenni di ricerca hanno portato all'identificazione di varie mutazioni dei geni di riparazione del DNA come biomarcatori per le scelte di strategia ^terapeutica1. Di conseguenza, il campo della riparazione del DNA è diventato un hub per lo sviluppo di farmaci per garantire una vasta gamma di trattamenti, potenziando il concetto di medicina personalizzata.

I DSB vengono riparati da due percorsi principali: NHEJ e ^HR2. La via NHEJ è soggetta a errori, legando rapidamente le due estremità del DNA con poca o nessuna elaborazione finale del DNA e coinvolgendo la proteina chinasi (DNA-PKcs), il complesso Ku70/80, le proteine 53BP1 e ^RIF13. Al contrario, HR è un meccanismo fedele avviato da ^BRCA14. Un passo essenziale nella riparazione delle risorse umane è il processo di resezione dell'estremità del DNA, che è la degradazione delle estremità rotte che porta al DNA a singolo filamento (ss) con estremità 3'-OH. BRCA1 facilita il reclutamento delle proteine a valle che formano il resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, che sono coinvolte nella resezione del DNA da 5' a ^3'5.

La resezione finale iniziale viene effettuata attraverso l'attività endonucleasi di MRE11, consentendo un'ulteriore elaborazione da parte delle nucleasi DNA2 ed EXO1. Gli sbalzi di ssDNA generati vengono rapidamente rivestiti dalla proteina di replicazione A (RPA) per proteggerli da ulteriori elaborazioni. Successivamente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 si impegnano a mediare lo spostamento di RPA e l'assemblaggio del nucleofilamento RAD51 necessario per il meccanismo di riparazione diretto all'omologia. Un buon equilibrio tra l'uso di NHEJ e HR è necessario per il mantenimento ottimale dell'integrità genomica. La scelta del percorso dipende dalla fase del ciclo cellulare. L'HR viene utilizzato preferenzialmente durante le fasi da S a G2 in cui la resezione del DNA è al più alto livello e i cromatidi fratelli sono disponibili per garantire una corretta riparazione.

La poli (ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP-1) è una delle prime proteine reclutate nel DSB. Regola sia l'attività di resezione che l'assemblaggio di effettori a valle coinvolti nel ^NHEJ5,6. PARP-1 è anche necessario per la riparazione della rottura a singolo filamento del DNA durante la ^{replicazione7,8}. A causa del suo importante ruolo nella riparazione del DNA, gli inibitori PARP (PARPi) sono usati come terapie contro il cancro. In diversi tumori con deficit di HR, il trattamento con PARPi porta a una risposta letale sintetica a causa dell'incapacità delle cellule carenti di HR di riparare il danno accumulato attraverso un percorso ^{alternativo9,10}. Attualmente ci sono quattro PARPi approvati dalla FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (chiamato anche BMN 673), che vengono utilizzati per vari trattamenti per il cancro al seno e alle ^ovaie11. Tuttavia, la resistenza PARPi è comune e una potenziale causa sorge attraverso la riacquisizione della competenza ^HR12. La perdita o l'inibizione di PARP-1 in presenza di irradiazione disregola il meccanismo del resettosoma, portando all'accumulo di tratti ssDNA più ^lunghi13. Pertanto, uno studio approfondito della resezione del DNA in vivo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e il successivo sviluppo di nuove strategie per trattare il cancro e superare la resistenza al PARPi.

Ci sono stati diversi metodi impiegati per rilevare gli eventi di resezione del ^DNA5. Uno di questi metodi è la classica tecnica basata su IF che consente la colorazione indiretta e la visualizzazione del DNA resecato dopo DSB indotto da stress utilizzando un anticorpo anti-RPA. Etichettare il DNA genomico con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) e rilevare solo ssDNA è una misura diretta degli eventi di resezione del DNA. Aggira il monitoraggio dell'RPA, che è coinvolto in più processi cellulari come la replicazione del DNA. Nel metodo qui descritto, le cellule incubate con BrdU per un singolo ciclo cellulare consentono a BrdU di essere incorporato in un filamento del DNA cellulare replicante. Dopo la resezione, la colorazione IF viene eseguita in condizioni che consentono il rilevamento di BrdU solo nella forma ssDNA, con l'uso di un anticorpo anti-BrdU. Questo anticorpo può accedere solo ai nucleotidi BrdU esposti e non rileverà quelli integrati nel DNA a doppio filamento. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, il DNA resecato può essere visualizzato sotto forma di focolai puntati brdU / ssDNA. L'intensità nucleare di questi fuochi può essere utilizzata come lettura per quantificare la resezione a seguito di danno al DNA. Questo documento descrive passo dopo passo i processi di questo metodo, che può essere applicato alla maggior parte delle linee cellulari di mammiferi. Questo metodo dovrebbe essere di ampia utilità come un modo semplice per monitorare la resezione finale del DNA nel cellulo, come prova di concetto.

Protocollo

1. Coltura cellulare, trattamenti e preparazione del coverslip

NOTA: Tutte le placcature cellulari, le trasfezioni e i trattamenti, a parte l'irradiazione, dovrebbero avvenire sotto una cappa sterile di coltura cellulare.

1. Giorno 1
   1. In una piastra a 6 pozzetti, posizionare un singolo coperchio in ciascun pozzetto per tutte le condizioni necessarie. Piastra ~ 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico, come desiderato.
      NOTA: In caso di trasfezione, si consiglia di eseguire una trasfezione inversa al momento della placcatura, oppure è possibile eseguire una trasfezione in avanti diverse ore dopo la placcatura per consentire l'aderenza. Una trasfezione inversa si ottiene aggiungendo la miscela di trasfezione al coverslip prima che le cellule vengano aggiunte; quindi, la trasfezione inizia prima che le cellule inizino ad aderire. Una trasfezione in avanti, al contrario, è l'aggiunta della miscela di trasfezione post-aderenza alla superficie di solito il giorno successivo. Tuttavia, è possibile farlo lo stesso giorno, a condizione che venga dato abbastanza tempo affinché le cellule aderiscano.
   2. Per questo metodo, utilizzare 4 pozzi: Pozzo 1: controllo del siRNA (chiamato siCTRL); Pozzo 2: siRNA contro PARP-1 (siPARP-1); Bene 3: non trattato; Pozzo 4: Cellule da trattare con 5 μM BMN673 1 h prima dell'irradiazione.
      NOTA: In questo protocollo, tutti i test sono stati condotti in condizioni irradiate (vedere paragrafo 1.3).
   3. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di _CO2 durante la notte, sebbene il protocollo di trasfezione consenta fino a 3 giorni di incubazione. Il tempo di incubazione prima del trattamento con BrdU dipenderà dall'efficienza di trasfezione del siRNA. Se non c'è trasfezione, l'incubazione per 16 ore è sufficiente per consentire l'aderenza al coverslip e una certa crescita cellulare.
      NOTA: le condizioni dell'incubatore possono essere modificate in base alla linea cellulare utilizzata.
2. Giorno 2
   1. Aggiungere BrdU ad una concentrazione finale di 10 μM nel terreno di coltura appropriato e incubare per 16 ore (un ciclo cellulare).
      NOTA: La soluzione di BrdU è preparata in dimetilsolfossido; la soluzione madre utilizzata è di 10 mM ed è conservata in aliquote a -20 °C.
3. Giorno 3
   1. Irradiare le piastre con una dose totale di 5 Gy di irradiazione a raggi X (variare la dose di irradiazione a seconda del tipo di irradiatore, ad esempio, piccoli irradiatori animali vs irradiatori da banco). Vedere la tabella dei materiali per la marca e il modello di irradiatore utilizzato.
   2. Riportare le piastre nell'incubatore e rilasciare le celle per 3 ore.
   3. Durante il periodo di incubazione di 3 ore, preparare i due tamponi, A e B, e il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: I tamponi A e B e il saccarosio devono essere preparati freschi il giorno della fissazione, utilizzando una soluzione di saccarosio fresco per prevenire la contaminazione.
      1. Preparare il buffer A (Pre-Extraction Buffer), secondo l'ordine (30 ml) descritto nella Tabella 1.
         NOTA: Il saccarosio 1M deve essere preparato il giorno dell'uso per evitare contaminazioni.
      2. Preparare il tampone B (Cytoskeleton Stripping Buffer) secondo l'ordine descritto nella Tabella 1 (30 ml).
         NOTA: il tampone B deve essere preparato nell'ordine citato per evitare la precipitazione di Tween-20 e della soluzione di desossicolato di sodio.
      3. Preparare il 4% di PFA, 2 ml per condizione (10 ml), sotto una cappa chimica (Tabella 1).

2. Pre-estrazione e fissazione

NOTA: Tutte le pre-estrazioni e le fissazioni vengono eseguite con i coperchi rimanenti nella piastra di coltura tissutale su ghiaccio o a 4 °C; il coperchio viene sollevato solo nell'ultima fase di montaggio (vedi discussione).

1. Pre-estrazione
   1. Aspirare il mezzo, lavare accuratamente le cellule due volte con 1x PBS e rimuovere il PBS. Aggiungere 2 mL di Tampone di Pre-estrazione A e incubare immediatamente a 4 °C per 10 min.
      NOTA: è importante che il tempo di incubazione nel buffer A non venga esteso. L'incubazione prolungata nei tamponi di pre-estrazione comporterà un aumento del numero di cellule staccate dal coverslip. In alternativa, invece dell'incubazione a 4°C, l'incubazione può essere fatta su ghiaccio.
   2. Rimuovere il buffer A attraverso l'aspirazione.
      NOTA: non lavare le coperture dopo aver rimosso il tampone A. Procedere al passaggio successivo.
   3. Aggiungere 2 mL di Cytoskeleton Stripping Buffer B e incubare immediatamente a 4 °C per 10 min. Aspirare accuratamente il tampone B e lavare accuratamente le cellule una volta con 1x PBS. Aspirare con cura il PBS 1x.
2. Fissazione
   1. Fissare le celle aggiungendo 2 ml di PFA al 4% sotto il cappuccio chimico.
      NOTA: il PFA è tossico e deve essere manipolato sotto un cappuccio chimico.
   2. Incubare le celle a temperatura ambiente per 20 min. Lavare le coperture due volte con 1x PBS e aspirare l'eccesso.
   3. Coprire i coverslip con metanolo freddo al 100% e incubare i coverslips a -20 °C per 5 minuti. Lavare due volte con 1x PBS.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I coverslip possono essere conservati a 4 °C in 1x PBS e la piastra avvolta in un foglio di alluminio, se necessario. Le cellule non devono essere conservate più di 5 giorni prima di continuare il protocollo IF.

3. Permeabilizzazione

1. Incubare le cellule con 2 mL di 1x PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 a temperatura ambiente per 15 min. Lavare le coverslip tre volte con 2 mL di 1x PBS.

4. Immunocolorazione

1. Fase di blocco
   1. Preparare abbastanza tampone di blocco fresco (3% BSA in 1x PBS) per utilizzare 2 ml per coverslip.
      NOTA: Preparare un ulteriore tampone bloccante di 5 ml per produrre le soluzioni anticorpali.
   2. Aggiungere 2 ml di tampone bloccante a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
2. Incubazione di anticorpi primari
   1. Preparare la soluzione anticorpale primaria in un tampone di blocco fresco: BrdU RPN202 1:1000 e antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip.
      NOTA: Per preservare l'anticorpo, è possibile utilizzare un volume più piccolo, 75-100 μL per un coverslip 22 x 22 mm, 50-75 μL per un coverslip 18 x 18 mm.
   2. Su ogni coverslip, aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale primaria. Coprire le coperture con un quadrato di parafilm usando una pinzetta e posizionare con attenzione il parafilm per non creare bolle.
   3. Coprire la piastra in un foglio di alluminio e incubare l'anticorpo primario durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
   4. Rimuovere i quadrati parafilm e lavare i coverslip tre volte con 2 ml di PBS sterile 1x.
3. Incubazione di anticorpi secondari
   1. Preparare una soluzione anticorpale secondaria sufficiente in un tampone di blocco fresco: diluizione secondaria fluorescente A11011 (per BrdU) anti-topo 488 (per BrdU) 1:800 e diluizione secondaria fluorescente A11011 (per PCNA) anti-coniglio 568 1:800.
      NOTA: I colori utilizzati possono essere modificati in base alle esigenze sperimentali. Il marchio specifico utilizzato può essere trovato nella Tabella dei materiali.
   2. Aggiungere su ogni coverslip 100 μL di soluzione anticorpale secondaria, coprire i coverslip con un quadrato di parafilm usando una pinzetta e posizionare con attenzione il parafilm senza bolle.
   3. Incubare l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora con la piastra ricoperta di foglio di alluminio.
   4. Lavare le coverslip tre volte con 2 mL di 1x PBS.
4. Colorazione nucleare
   1. Preparare un volume di 2 mL per coverslip di 1x PBS contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ad una concentrazione finale di 1 μg/mL (1:1000).
   2. Aggiungere su ogni coverslip 2 mL della soluzione DAPI. Incubare i coverslip a temperatura ambiente per 10 minuti con la piastra ricoperta di foglio di alluminio. Lavare le coperture due volte con 1x PBS.
   3. Coprire le coperture con 1x PBS e utilizzare un ago o una pinzetta fine per sollevare la coverslip dal fondo del pozzo. Asciugare accuratamente il liquido in eccesso picchiettando delicatamente un bordo su un tovagliolo di carta.
      NOTA: fare attenzione a non far cadere la diapositiva o lasciare che la superficie piana con le celle aderenti tocchi la carta.
   4. Montare i coperchi su guide utilizzando 10-20 μL di supporti di montaggio specifici per IF.

5. Acquisizione e analisi delle immagini

NOTA: l'acquisizione di immagini può essere eseguita su diversi tipi di microscopi fluorescenti. È stato utilizzato un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo di olio 63x; vedi la Tabella dei materiali per la marca e il modello. Gli Z-stack non sono necessari, anche se possono essere utili a seconda della linea cellulare e del livello di colorazione mitocondriale.

1. Analisi delle immagini
   1. Per ogni immagine, creare più file tiff; unire tutti i piani, ma mantenere separati i canali di colore. Importare questi file in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) e analizzarli utilizzando la pipeline Speckle Counting (Video supplementare 1).
   2. Caricare le immagini (Figura supplementare S1A).
      1. Per iniziare a creare il progetto, caricare la pipeline di conteggio delle macchie nel programma e le immagini da analizzare nell'area fornita.
      2. Utilizzare il modulo NamesAndTypes per assegnare un nome significativo a ciascuna immagine con cui altri moduli faranno riferimento ad essa-C01: Representing BrdU Channel; C02: Rappresentare il canale PCNA; C03: Rappresenta il canale DAPI.
         NOTA: questi identificatori dipenderanno dal microscopio; dovrebbe esserci un identificatore nel nome del file per distinguere tra i canali.
   3. Identificare quale file verrà utilizzato per identificare i nuclei e denominarlo (modificare questo nome come richiesto) (vedere figura supplementare S1B e figura supplementare S1C).
      1. Selezionare il diametro dell'oggetto compreso tra 50 e 300 unità di pixel, che è l'intervallo di dimensioni accettabile per i nuclei, ma modificare il valore per adattarlo ai nuclei nell'immagine.
         NOTA: è possibile che 50 sia un valore troppo grande e impedisca l'identificazione di nuclei più piccoli; allo stesso modo, 300 può consentire di contare grandi raggruppamenti di nuclei come 1.
      2. Scartare gli oggetti al di fuori dell'intervallo di diametri per garantire che vengano conteggiati solo quelli che corrispondono ai criteri.
      3. Scartare gli oggetti che toccano i bordi per rimuovere le celle che potrebbero trovarsi solo parzialmente nel campo.
      4. Applicare la soglia per adattarla alle immagini specifiche. Si notino le seguenti impostazioni come esempio. Modificare il fattore di correzione della soglia in base alla rigorosità della strategia di soglia. Altre impostazioni includono la strategia di soglia: Globale; metodo di soglia: Otsu; soglia di due o tre classi: due classi; scala di livellamento della soglia: 1; fattore di livellamento della soglia: 1; limiti inferiore e superiore sulla soglia: 0,0 e 1,0; metodo per distinguere gli oggetti raggruppati: Forma; e metodo per disegnare linee divisorie tra oggetti raggruppati: Propaga.
         NOTA: per ogni parametro, cell profiler fornisce definizioni complementari e possibilità disponibili per l'impostazione della variabile.
   4. Identificare l'oggetto primario per identificare i fuochi (Figura supplementare S2A).
      1. Utilizzare le seguenti impostazioni: selezionare l'immagine di input: Maskedgreen; denominato l'oggetto primario da identificare: BrdUFoci; diametro tipico dell'oggetto: 1-15; scartare l'oggetto al di fuori dell'intervallo di diametro: Sì; scartare l'oggetto toccando il bordo dell'immagine : No; strategia di soglia: adattativa; metodo di soglia: Otsu; soglia di due o tre classi: tre classi; scala di livellamento della soglia: 1; fattore di livellamento della soglia: 3; e dimensione del filtro lisciante: 4.
   5. Misurare l'intensità (Figura supplementare S2B).
      1. Seleziona l'immagine da misurare: OrigGreen.
      2. Clicca su Aggiungi un'altra immagine. Selezionare l'immagine da misurare: PCNA. Selezionare gli oggetti da misurare: Nuclei.
         NOTA: Questo verrà utilizzato per misurare l'intensità di BrdU e PCNA, i dati finali che verranno rappresentati graficamente.

Risultati

In questo protocollo, il saggio basato sulla bromodeossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per misurare quantitativamente la risposta di resezione delle cellule HeLa al danno indotto dall'irradiazione. Le tracce di ssDNA generate vengono visualizzate come focolai distinti dopo la colorazione di immunofluorescenza (Figura 1A). I focolai identificati sono stati quindi quantificati ed espressi come l'intensità totale integrata della colorazione BrdU nei nuclei (Figura 1B

Discussione

Questo documento descrive un metodo che utilizza la colorazione IF per misurare le variazioni nella resezione del DNA nel cellulo. Lo standard attuale per osservare un effetto sulla resezione del DNA è attraverso la colorazione RPA; tuttavia, questo è un metodo indiretto che può essere influenzato dalla replicazione del DNA. In precedenza, è stata descritta un'altra tecnica IF di resezione del DNA basata sull'incorporazione di BrdU per classificare le intensità risultanti nelle cellule BrdU-positive e BrdU-...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit	Molecular probes	A11011	1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Molecular probes	A11001	1:800
Anti PARP1 (F1-23)	Homemade		1:2500
Anti PCNA (SY12-07)	Novus	NBP2-67390	1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)	Abcam	Ab7291	1:100000
anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1:1000
Benchtop X-ray Irradiator	Cell Rad
BMN673	MedChem Express	HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)	Sigma	B5002
BSA	Sigma	A7906
Cell profiler	Broad Institute	V 3.19	https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft	Fisher scientific	13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen Life Technology	D1306
DMEM high glucose	Fisher scientific	10063542
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fetal Bovine serum	Gibco	12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22	Fisher scientific	12 541B
Fluorescent microscope	Leica	DMI6000B	63x immersion objective
HeLa	ATCC	CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V	VWR	51030408	37% CO2
MgCl2	BioShop Canada	MAG520.500
NaCl	BioShop Canada	SOD002.10
Needle
PBS 1x	Wisent Bio Products	311-010-CS
PFA 16%	Cedarlane Labs	15710-S(EM)
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen Life Technology	P-36930
RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
siPARPi	Dharmacon		AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control	Dharmacon		UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sucrose	BioShop Canada	SUC507.5
Tris-base	BioShop Canada	TRS001.5
Trition X-100	Millipore Sigma	T8787-250ML
Tween20	Fisher scientific	BP337500
Tweezers