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要約

乳がん脳転移細胞の薬物および放射線応答を器官型脳スライスモデルでリアルタイムに測定するためのプロトコルを紹介します。本方法は、脳微小環境界面内での乳癌からの脳転移に対する様々な治療の治療効果を ex vivo 方式で調査するための定量的アッセイを提供する。

要約

脳転移は、これらの腫瘍が治療が困難であり、臨床転帰不良と関連しているため、女性にとって乳癌の重篤な結果である。乳癌脳転移(BCBM)増殖の前臨床マウスモデルは有用であるが高価であり、脳実質内での生細胞および腫瘍細胞浸潤を追跡することは困難である。ここに提示されるのは、頭蓋内注射された乳癌脳シーククローンサブラインを含む異種移植マウスからの ex vivo 脳スライス培養のためのプロトコールである。 MDA-MB-231BR ルシフェラーゼタグ付き細胞をNu/Nu雌マウスの脳に頭蓋内注射し、腫瘍形成後、脳を単離、スライス、 エクスビボで培養した。腫瘍スライスを画像化して、ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を同定し、脳実質におけるそれらの増殖および浸潤を最大10日間モニターした。さらに、このプロトコルは、電離放射線または化学療法による治療後の腫瘍細胞の増殖および浸潤挙動を画像化するためのタイムラプス顕微鏡の使用を記載している。治療に対する腫瘍細胞の応答は、ライブイメージング顕微鏡、生物発光強度の測定、およびBCBM細胞を含む脳スライスの組織学の実施によって視覚化することができる。したがって、この エキソビボ スライスモデルは、脳微小環境内の個々の患者の乳癌脳転移増殖を標的とするようにパーソナライズされた薬物を同定するために、新規治療薬を単独で、または放射線と組み合わせて迅速に試験するための有用なプラットフォームであり得る。

概要

乳がんの脳転移(BCBM)は、原発性乳房腫瘍から脳に細胞が広がると発症します。乳がんは、肺がんに次いで脳転移の2番目に頻繁な原因であり、転移は患者の10〜16%で起こる1。残念なことに、患者の>80%が脳転移診断後1年以内に死亡し、神経機能障害のために生活の質が損なわれているため、脳転移は依然として不治の病のままです2。より効果的な治療選択肢を特定することが急務です。単層二次元または三次元培養モデルは、実験室で治療薬を試験する際に最も一般的に使用される方法である。しかし、それらは、腫瘍表現型および増殖の主要な要因である複雑なBCBM微小環境を模倣していない。これらのモデルは有用であるが、腫瘍の複雑な間質相互作用、固有の代謝要求、および腫瘍の不均一性を捉えていない3。腫瘍間質相互作用と微小環境の不均一性をより忠実に再現するために、我々のグループと他のグループは、患者由来の腫瘍細胞(原発性または転移性)または癌細胞株を用いて有機型脳転移「スライス」培養物を生成し始めている4,5,6。古典的なin vitroシステムと比較して、この短期のex vivoモデルは、大型動物コホートにおける前臨床評価の前に新しい治療法をスクリーニングするためのより関連性の高い条件を提供する可能性がある。

エクスビボモデルは、主に様々な癌の成功した治療法の同定のために構築され、首尾よく使用されてきた。評価には数日が必要であり、さらに患者固有の薬物スクリーニングに合わせて調整することができます。例えば、ヒト膀胱および前立腺癌エクスビボ組織は、ドセタキセルおよびゲムシタビンの用量依存的な抗腫瘍応答を示している7。同様の結腸直腸癌のエクスビボ組織が、化学療法薬オキサリプラチン、セツキシマブ、およびペムブロリズマブ8をスクリーニングするために開発された。この用途は、間質環境と膵管腺癌の遺伝子型および表現型特性との間の本質的な相互作用を考慮して、膵臓癌において広く使用されている9,10。さらに、このような有機型モデルが、頭部、頸部、胃、および乳房腫瘍における同様のスクリーニングのために開発されている11、12。

ここで、異種移植乳癌脳転移性腫瘍細胞のエクスビボ脳スライスモデルをそれらの微小環境において生成させている。マウスに乳癌脳転移性脳栄養性MDA-MB-231BR細胞13を大脳皮質頭頂葉-TNBC転移14、15の共通部位に頭蓋内注射し、腫瘍を発症させた。脳スライスを、これらの異種移植動物から生成し、16、17に記載のように器官型培養物としてエクスビボで維持した。この新規なエクスビボモデルは、脳実質内のBCBM細胞の成長の分析を可能にし、脳微小環境内の腫瘍細胞に対する治療薬および放射線効果の試験に使用することができる。

プロトコル

このプロトコルは、ドレクセル大学医学部施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従っています。Nu/Nu無胸腺雌マウス(6〜8週齢)を本研究に使用した。

1. 腫瘍細胞の頭蓋内注射

  1. 滅菌インジケータを含む滅菌パウチで、オートクレーブの乾燥サイクル下ですべての機器(ピンセット、はさみ、縫合はさみ、ハンドドリル)を滅菌します。複数の動物に対して手術を行う場合は、加熱ビーズ滅菌器(最大3倍)を使用して動物間のツールを滅菌してください。
  2. ユーザーの動物ケアプロトコル(例えば、イソフルラン(誘導用4%、維持1〜2%)に従ってマウスを麻酔し、手術開始前に鎮痛(皮下、0.1mg / kgブプレノルフィンSR-LABの0.1mL)を投与する。つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。
  3. マウスを定位フレームに入れ、標準的なイヤーバーを使用して頭を固定します(図1A)。眼科用軟膏を目に塗布する。
  4. 切開前にヨウ素綿棒と70%エタノールを繰り返し交互に塗布(3倍)して、頭部の表面を滅菌する。
  5. 外科用メスを使用して、マウスの脳を2つの対称的な半分に分割して頭蓋骨を露出させる虚線に対してわずかに斜めの角度で皮膚を通る1cmの正中線切開を行う。綿棒で血を拭きます。
  6. 皮膚を横方向にそらして注射部位を露出させる:右側2mm、ブレグマ(+2平側(+2ML)、+1吻側/尾側(+1RC)を参照して前方に1mm)。
  7. バービット(0.73 mm)を使用して頭蓋骨+2ML、+1RCをブレグマに貫通し、わずかな圧力とねじれ運動を使用して穴を開けます。
  8. 脳注射器を使用して、最初にシリンジを脳に深さ3.5mm挿入することにより、滅菌1x PBSに100,000個のMDA-MB-231BR(GFP-ルシフェラーゼを安定発現する)細胞/μL溶液5 μLを注入する。
  9. シリンジを2分間落ち着かせます。それを約1mm引き上げ、2分後、体積の前半をゆっくりと注入する。
  10. 残りを注入する前にさらに2分間待ってから、最終注射の3分後にシリンジをゆっくりと引きます。
    注:低速注射は、体積が脳組織によく吸収され、シリンジを引っ張った後に漏れを生じさせないようにするために経験的であり、癌細胞が意図した部位の外側に増殖する可能性がある。
  11. 頭蓋骨の注射部位に骨ワックスを塗布し、ポリプロピレン縫合糸を使用して組織を縫合する。マウスは麻酔の除去後5分以内に回復する。
  12. 手術直後の行動を約10分間、3時間後、翌日に監視し、生理食塩水注射、柔らかい食べ物などの特別な治療が迅速な回復に役立つかどうかを判断します。
  13. イメージングシステム上の生物発光イメージングを介して腫瘍の成長を監視します。
    1. このためには、まず、イメージングシステムの酸素とイソフルランをオンにします。両方をイメージングボックスの外側の別々のチャンバに分配できるようにします。
    2. 次に、ソフトウェアの電源を入れ、機器を初期化し、マウス本体全体を視覚化してキャプチャするための適切なオプションを選択します。
  14. イソフルランでマウスを別々のチャンバーに入れ、つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。マウスに200 μLの30 mg/mLルシフェリンを腹腔内に注射する。
  15. マウスの胃を、酸素とイソフルランを供給した画像チャンバーの鼻先に移す。チャンバーをロックし、2分間の露光を選択してイメージングを開始します。
  16. ソフトウェアのROI(関心領域)ツールを使用して、腫瘍の生物発光シグナルを定量化します。
  17. 腫瘍のサイズを分析するには、円の形状ツールを選択し、腫瘍の形状とサイズの周りに合わせます。ROIを測定し、合計測定値を報告します。
  18. 脳スライスを生成する前に、固形腫瘍の増殖を12〜14日間(またはルシフェラーゼが約7.0 x106 単位に達するまで)許可する(図1B)。
    注:注射する細胞の数を増やすと、腫瘍の増殖が速くなります。したがって、脳スライスの生成は12日より早く起こり得る。一方、腫瘍が大きくなると、14日間増殖させるとGFP+スライスが増えます。14日後、マウスの健康は急速に悪化し始める。したがって、動物の健康モニタリングは、10日間の時点以降に1日1回に増加し、痛みおよび/または不快感の徴候を示すマウスはスライスを生成するために使用されるべきである。

2.脳スライスを生成する

メモ: 脳の分離後に、滅菌層流フードで手順を実行します。典型的には、MDA-MB-231BR細胞を注射した1匹のマウスから腫瘍細胞(ルシフェラーゼシグナル)を含む35〜40個の個々のスライスを生成することが可能である(図1C)。

  1. オートクレーブ内のすべての手術器具を滅菌する。滅菌層流フードに組織スライサーを置き、すべてのツールと器具を70%エタノールで洗浄します。
  2. 頭蓋内MDA-MB-231BR細胞注射後12〜14日後に、1.2に記載されているように、ユーザーの動物ケアプロトコルに従ってマウスを麻酔する。つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。
  3. 280 mM スクロース、5 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、20 mM グルコース、10 mM HEPES、5 mM Na+-アスコルビン酸塩、3 mM チオ尿素、2 mM Na+、29 mM ピルビン酸で構成される氷冷(4°C)スクロース-ACSFに脳を素早く(45秒以内に)除去して配置する。pH=7.3。
  4. 鋭利で滅菌されたメスまたはカミソリの刃を使用して、脳の底部を含むすべての側面から腫瘍を含まない脳の余分な部分を切り取ります。
  5. 脳の形を完璧でない立方体に持ってきて、スライスを容易にするために60mmの皿蓋の上のACSF濡れろ紙の上に平らに座ります。
    注:腫瘍が成長した可能性が低い脳の余分な組織は、スライス前に除去され、主にGFP +スライスを生成し、器具の表面上で安定し、スライスによって引き起こされる振動によって動揺しない脳の形状を作り出す。
  6. プリウェット(ACSF付き)ろ紙を数枚切断プラットフォーム上に置き、ブロックされた組織をこの上に置きます。
  7. 付属の定規で装置のカットサイズを2または2.5単位に設定して、組織を200〜250μmのセクションにスライスします。
    メモ: 最大 350 μm または 100 μm の薄さのスライスは実行可能です。<200μmのスライスの場合は、ビブラトームまたは圧縮トームを使用します。
  8. ペイントブラシ(クロテン)を使用して、脳のスライスをスクロースACSFを含む皿に移し、27G針を使用して光学顕微鏡下でスライスを分離する。
  9. 蛍光顕微鏡下でGFP陽性スライスを同定し、滅菌1mLの切断ピペット(広い開口部)を使用して、2〜3mLの成人スライス培地(Neurobasal medium A、2% B12サプリメント、1%N2サプリメント、1%グルタミン、0.5%グルコース、10U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン)を含む新しい60mmディッシュに移す。
    注:脳表面上に増殖する腫瘍細胞を含む脳スライス(おそらく注射細胞漏出などによる)は除外される。
  10. 3~5枚のスライスを、各30 mm、0.4 μmの孔径の組織培養インサート上に、互いに成長できない距離で6ウェルプレートに移す。
  11. P1000ピペットを用いてインサートの表面から過剰の培地を取り出し、各インサートの下に1mLの成体マウススライス培地を加え、スライスする前にインキュベーター内の培地を平衡化します。
  12. イメージング前に、組織を37°C、5%CO2、 および95%湿度で24時間インキュベートする。

3. スライスのIVISイメージング

注: ルシフェラーゼおよび阻害剤の添加手順は、滅菌層流フード内で行います。

  1. インサートの下の培地に30 mg/mLルシフェリン溶液5 μLをピペットで入れ、インサートを鉗子で持ち上げ、ウェル内の培地にルシフェリンを添加した後、ウェルに戻します。
  2. 固定カメラの下の機器の撮像チャンバ内に蓋付きの6ウェルプレートを置き、チャンバドアをロックします。
  3. ソフトウェアを開き、計測器を初期化します。
  4. 画像ごとに 1 つのウェルのみの視覚化とキャプチャを可能にするカメラ設定を選択します。ステージを上に移動し(視野5cm)、カメラの真下に撮影する必要がある井戸を置きます。
  5. イメージング時間を、腫瘍が放出するルシフェラーゼの強度に応じて最も適切なものに設定します(10秒から5分まで変化します)。まず10秒に設定し、信号が低い場合は増やしますが、実験が終了するまですべての時点と条件について一貫性を保ちます(図1D)。
  6. ROIツール(円形状ツール)を使用し、腫瘍の形状と大きさの周りにそれを合わせ、ROIを測定し、スライス上の各腫瘍の生物発光シグナルを定量化するために総測定値を報告する。
  7. プレートを滅菌層流フードに戻し、鉗子を使用してインサートをウェルからわずかに持ち上げます。
  8. 培地を吸引し、1mLの新鮮な培地と交換し、インサートをウェルに戻す。
  9. スライスをインヒビター、代謝産物などの各種化合物で処理する実験では、1.5 mLチューブ内の1.2 mLの脳スライス培地に適切な濃度の試薬を調製し、スライスを含むウェルに1 mLを移します。
  10. 研究期間中、このプロセスを48時間ごとに繰り返します。

4. 生体外 脳スライスにおける腫瘍増殖のライブイメージング

注: インサートには、ライブイメージング中に培地を追加することはできないため、実験の長さを持続させるのに十分な培地 (1.5 mL) をインサートに供給してください。

  1. 6ウェルプレートをインキュベーター内の自動顕微鏡プレートホルダー(37°C、5%CO2、 湿度95%)の上に置きます。
  2. ソフトウェアを開き、最初の象限の明視野をオンにして、スライスを表示するために必要な露出を調整します。スライスの位置(座標「xy」)を見つけるには、2番目の象限で「xy」でナビゲートして、顕微鏡の座標「xyz」を制御します。
  3. この実験に使用したラボウェアとして6ウェルプレートを選択します。ROIマップエディタを選択し、新しいROIを選択してその位置を登録し、そのROIを追加して保存する。
  4. 他の井戸の他のすべての関心領域についても同じ手順を繰り返します。すべてのROIを追加したら、すべてのROIを保存します。
  5. [プロトコル]で、[既存のクリア]を選択し、[集録]で[タイムラプス]を選択してから、目的のチャネル(この場合はGFP)を選択します。
  6. フォーカス設定で オート フォーカスをオフにし、すべてのスライスの適切な フォーカス に手動で調整します。最後に、 明視野強度 と 蛍光チャンネルの励起 と 露光時間を 適切なレベルに調整します。
  7. 48 時間の間、15 分ごとに画像を取得するようにプロトコルを設定します。
  8. プロトコルを保存して実行します。実験の終了時に、保存されたファイルには、ROIごとにキャプチャされた明視野画像とGFP画像の両方が含まれます。
  9. ビデオ内の画像を組み合わせるには、関心のあるすべての画像の名前を同じ名前に変更し、その後に2進数を付けて、キャプチャされた順序で整理します(ROI1(1)、RO1(2) など)。
  10. ImageJを開き、[ファイル]をクリックして画像 >インポートし、画像シーケンス>インポートします。リストに表示されるファイル名を選択し、ビデオ用に選択されたファイルを識別するために表示される [ファイル名を含む] ボックスにファイル名の内容を書き込みます。
  11. 結合された画像を 「ファイル」>「名前を付けて保存」> AVI に保存します。

5. MTSアッセイと生体外 脳組織の免疫組織化学

  1. MTSアッセイ
    1. 組織の縁に沿って各スライスの下の組織培養膜を切断することによってスライスを切除し、まだ膜に付着したままの組織を96ウェルプレートに移す。
    2. 培養培地および0.01%トリトン(1x)と1:5の比率で混合したMTS試薬を、各ウェルに120μLの総容量で組織に溶液を浸透させるために加える。
    3. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を、脳スライスを生存不能にするための薬剤として使用し、したがって、この実験のための陽性対照とする。MTSアッセイを進める前に、目的の脳スライスをRT(室温)で1時間、または4°Cで一晩浸漬する。
    4. MTS試薬をスライスに4時間反応させ、ウェルからスライスを取り出し、スライスを基準として持たない空のウェルを含むすべての条件について490nmでの吸光度を測定します。
    5. デジタルノギス定規で測定した組織スライス面積の関数として測定値を報告します。
  2. 免疫組織化学製剤
    1. メンブレンインサート表面に付着した脳スライスを10%ホルマリンに4°Cで一晩浸漬する。
    2. 埋め込み、処理、ブロッキングを行い、組織の染色されていないスライドを生成します。標準的な免疫組織化学染色プロトコルを使用して、H&E、Ki-67、γ-H2AX、CC3、GFAP、GFP、DAPI を染色する

6. 生体外 脳スライスにおける腫瘍の照射

  1. 腫瘍に6Gy(310kVpのX線)を照射する。
    注:6 Gyの総線量を得るために入力された単位は、前述のようにR単位(Victoreen電気計を使用して測定)とシンブル、空気密度、およびcGy/Rの補正を考慮した後、3522単位です18。露光時間は130.9秒です。
  2. 0.25 mm Cu + 1 mm Al添加ろ過、50 cm SSD、125 cGy/分を使用してください。
  3. 一次標準に対して較正されたインザビームイオン化チャンバによって線量測定を行う。
  4. 湿度、温度、気圧を毎日修正します。

結果

MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を、上記で説明したように4~6週齢のNu/Nuマウスの右半球に頭蓋内注射し(図1A)、12~14日間増殖させ、その間、腫瘍の成長を生物発光イメージングによってモニターした(図1B)。他のグループ19で報告されているように、100,000個のがん細胞を頭蓋内に注射しましたが、20,000個の細胞20個...

ディスカッション

この研究は、外植異種移植片脳腫瘍のための新規なex vivo 脳培養方法を確立する。我々は、マウスの脳に頭蓋内注射されたBCBM細胞MDA-MB-231BR細胞が 、エクスビボ 脳スライス中で生存および増殖し得ることを示す。この研究はまた、頭蓋内注射されたU87MG膠芽腫(GBM)細胞を試験し、これらの癌細胞が脳スライスで生き残り、増殖することも見出した(データは示されていない)。この?...

開示事項

著者は宣言する財政的な矛盾はありません。

謝辞

ジュリア・ファーナン、ケイラ・グリーン、ティツィアナ・デアンジェリスの技術支援に感謝します。この研究は、ペンシルベニア州ユニバーサル研究強化助成金プログラム(MJR、JGJ)、UO1CA244303(MJR)、R01CA227479(NLS)、R00CA207855(EJH)、およびW.W. Smith Charitable Trusts(EjH)によって部分的に支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe, slip tipBD309659
30 G1/2 NeedlesBD305106
6-well platesGenessee25-105
Automated microscope and LUMAVIEW softwareEtalumaLS720
B27 (GEM21)Gemini Bio-Products400-160
Beaker 50 mLFisher10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0Electron Microscopy Sciences66100-50
Bone WaxModoMedDYNJBW25
Brain injection SyringeHamilton Company80430
CaCl2Fisher ScientificBP510-250
Cleaved caspase 3 AntibodyCell Signaling14220S
DAPIInvitrogenP36935
D-Luciferin Potassium SaltPerkin Elmer122799
Double edge razor bladeVWR55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cmFisher09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0Electron Microscopy Sciences66100-20
ForcepsFine Science Tools11251-20
Gamma-H2AX antibodyMillipore05-636
GFAP antibodyThermo Fisher13-0300
GFP antibodySanta CruzSC-9996
GlucoseSigma AldrichG8270
Glutamine (200 mM)Corning cellgrow25-005-Cl
H&E and KI-67Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill BitsAmazonYCQ2851920086082DJ
HEPES, free acidFisher ScientificBP299-1
Just for mice Stereotaxic FrameHarvard Apparatus (Holliston, MA, USA).72-6049, 72-6044
KClFisher ScientificS271-10
Large surgical scissorsFine Science Tools14001-18
MDA-MB-231BR cellsKindly provided by Dr. Patricia SteegRef 14
MgCl2·6H2OFisher ScientificM33-500
Mice imaging devicePerkin ElmerIVIS 200 system
Mice imaging softwareCaliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).Living Image Software
Microplate ReaderTecan Spark
Mounting solutionInvitrogenP36935
MTS reagentPromega CellTiter 96 Aqueous One Solution(Cat:G3582)
N2 supplementLife Technologies17502-048
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
Nu/Nu athymic miceCharles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
ParaformaldehydeAffymetrix19943
Pen/StrepLife Technologies145140-122
Polypropylene SutureMedex supplyETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticksDME Supply USACat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100)Fine Science Tools10011-00
Scalpel handle #3Fine Science Tools10003-12
Sodium PyruvateSigma AldrichS8636
Spatula/probeFine Science Tools10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))VWR55411-060
SucroseAmresco57-50-1
Surgical ScalpelExelint InternationalD29702
Tissue ChopperBrinkman(McIlwain type)
Tissue culture insertsMilliporePICMORG50 or PICM03050
X-ray machinePrecision 250 kVp

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