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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo utiliza la hinchazón de agarosa como una técnica poderosa y generalizable para incorporar proteínas de membrana integral (IMP) en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV), como se describe aquí para la reconstitución de la proteína receptora de serotonina 1A humana (5-HT1AR), una de las clases de receptores acoplados a proteínas G farmacológicamente importantes.

Resumen

Las investigaciones robustas in vitro de la estructura y función de las proteínas de membrana integral han sido un desafío debido a las complejidades de la membrana plasmática y los numerosos factores que influyen en el comportamiento de las proteínas en las células vivas. Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) son un sistema modelo in vitro biomimético y altamente sintonizable para investigar las interacciones proteína-membrana y sondear el comportamiento de las proteínas de una manera precisa y dependiente del estímulo. En este protocolo, presentamos un método económico y eficaz para fabricar GUVs con el receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR) integrado de forma estable en la membrana. Fabricamos GUV utilizando un método de hinchazón de hidrogel modificado; al depositar una película lipídica sobre una mezcla de agarosa y 5-HT1AR y luego hidratar todo el sistema, se pueden formar vesículas con 5-HT1AR adecuadamente orientado y funcional incorporado a la membrana. Estos GUV se pueden usar para examinar las interacciones proteína-membrana y el comportamiento de localización a través de microscopía. En última instancia, este protocolo puede avanzar en nuestra comprensión de la funcionalidad de las proteínas de membrana integral, proporcionando una visión fisiológica profunda.

Introducción

Las membranas modelo sintéticas son herramientas poderosas en la investigación de las propiedades y funciones fundamentales de las biomembranas. Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) son una de las plataformas más prominentes para estudiar una variedad de propiedades de la membrana plasmática y pueden diseñarse para imitar diferentes condiciones fisiológicas1,2,3,4,5,6,7,8. Está bien establecido que la membrana plasmática y su organización juegan un papel clave en multitud de procesos celulares, como la transducción de señales, la adhesión, la endocitosis y el transporte9,10,11,12,13,14,15.

Los GUV se han fabricado utilizando diversos métodos, incluyendo hidratación suave16, hinchazón de hidrogel17, electroformación18, técnicas microfluídicas19,20,21,22, chorro23 e intercambio de disolventes24,25,26. Debido a los desafíos en el manejo de proteínas integrales de membrana (IMP), las plataformas in vitro para estudiarlas han sido limitadas. Los GUV presentan una plataforma simplificada para estudiar IMP en un entorno que imita su entorno nativo. Aunque han existido varios enfoques para la reconstitución de proteínas en los GUV, surgen desafíos al incorporar proteínas con la orientación correcta y mantener la funcionalidad de las proteínas27.

La reconstitución de proteínas más exitosa en los GUV requiere el método de intercambio de detergente; lo que implica la solubilización de las proteínas de su entorno nativo mediante detergentes, seguido de la purificación de proteínas, y luego la sustitución de las moléculas de detergente por lípidos a través de diversos métodos28. Mientras que los detergentes sirven para estabilizar la estructura terciaria de los IMP durante la purificación, las micelas detergentes son un ambiente relativamente antinatural para estas proteínas, que se estabilizan mejor, particularmente para estudios funcionales, en bicapas lipídicas28,29,30. Además, la incorporación de proteínas transmembrana funcionales en la bicapa lipídica utilizando técnicas tradicionales de fabricación de GUV ha sido difícil debido al tamaño, la delicadeza de estas proteínas y los pasos adicionales de intercambio de detergente que se necesitarían27,31,32,33. El uso de disolvente orgánico para eliminar detergentes provoca la agregación y desnaturalización de proteínas34. Un método mejorado mediado por detergente ha sido prometedor, sin embargo, se necesita precaución para el paso de eliminación de detergente y la optimización podría ser necesaria para proteínas específicas31,35. Además, los métodos que utilizan electroformación podrían restringir la elección de la proteína y pueden no ser adecuados para todas las composiciones lipídicas, especialmente los lípidos cargados31,36,37. Otra técnica que se ha utilizado es la fusión inducida por péptidos de grandes vesículas unilamelares (LUV) que contienen la proteína deseada con GUVs, aunque se encontró que es laboriosa y puede conducir a la inserción de moléculas extrañas: los péptidos fusogénicos33,38,39. Las vesículas gigantes de membrana plasmática (GPPV), que se derivan de células vivas, se pueden utilizar para superar algunos de estos problemas, sin embargo, permiten un control mínimo de la composición lipídica y proteica resultante14,40,41. Por lo tanto, la integración de IMPs en la capa bilipída de GUVs utilizando nuestro método de hinchazón de agarosa modificada presenta un método confiable para examinar más a fondo estas proteínas en el entorno de membrana42,43,44,45.

La señalización y comunicación celular involucra una familia de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteínas G (GPCR); Los GPCR se encuentran entre la mayor familia de proteínas y se asocian con la modulación del estado de ánimo, el apetito, la presión arterial, la función cardiovascular, la respiración y el sueño, entre muchas otras funciones fisiológicas46. En este estudio, utilizamos el receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR) que es un miembro prototípico de la familia GPCR. 5-HT1AR se puede encontrar en el sistema nervioso central (SNC) y los vasos sanguíneos; influye en numerosas funciones como las cardiovasculares, gastrointestinales, endocrinas, además de participar en la regulación del estado de ánimo47. Una gran barrera para la investigación de GPCR surge de su compleja estructura anfifílica, y los GUV presentan una plataforma prometedora para la investigación de diversas propiedades de interés, que van desde la funcionalidad de la proteína, las interacciones lípido-proteína y las interacciones proteína-proteína. Se han utilizado diversos enfoques para estudiar las interacciones lípido-proteína como la resonancia de plasmón de superficie (SPR)48,49, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)50,51, el ensayo de superposición de lípidos proteicos (PLO)51,52,53,54, la espectrometría de masas nativa55, la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)56,57 y el liposoma ensayo de sedimentación58,59. Nuestro laboratorio ha utilizado el enfoque SIMPLIFICADO de GUV para investigar el efecto de las interacciones lípido-proteína en la funcionalidad de la proteína mediante la incapsulación de BODIPY-GTPγS, que se une con la subunidad Giα en el estado activo del receptor. Su unión desengancha el fluoróforo produciendo una señal de fluorescencia que podría detectarse con el tiempo45. Además, varios estudios investigaron las interacciones lípido-proteína y el papel de las proteínas en la detección o estabilización de la curvatura de la membrana60,61, y la utilización de un enfoque FACTIBLE de GUV podría ser una ventaja clave.

Este protocolo demuestra un método sencillo para incorporar GPCR en la membrana de los GUV utilizando un sistema de hidrogel de agarosa modificado17,42. Además, sobre la base de nuestro trabajo anterior, nuestro método podría ser adecuado para imprentas que pueden soportar una exposición a corto plazo a 30-40 °C. Brevemente, extendemos una fina película de agarosa combinada con fragmentos de membrana que contienen el GPCR de interés. Después de la gelificación de esta capa, depositamos una solución lipídica sobre la agarosa y permitimos que el disolvente se evapore. La rehidratación del sistema se realizó entonces con un tampón acuoso, dando como resultado la formación de GUVs con proteína incorporada en la bicapa lipídica.

Protocolo

1. Etiquetado de proteínas

  1. Permita que NHS-Rhodamine, fragmentos de membrana 5-HT1A y una columna de desalinización de espín de 7 K MWCO se equilibren a temperatura ambiente.
  2. Disolver 1 mg de NHS-rhodamine en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Agregue 5 μL de solución de bicarbonato de sodio 1 M para aumentar el pH de la solución de 5-HT1AR a pH 8.
  4. Añadir 3,66 μL de la solución de NHS-rodamina a 50 μL de la solución de 5-HT1AR y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo en un tubo de microcentrífuga.
    NOTA: Asegúrese de tener al menos 10 veces más de molar en exceso de NHS-rhodamine.
  5. Mantenga la mezcla protegida de la luz y coloque el rotador a temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Lave una columna de centrifugado MWCO de 7 k con 200 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (1x PBS) tres veces durante 1,5 min a 1,5 RCF por cada lavado.
  7. Agregue la proteína marcada a una columna y equilibre la cantidad en otro tubo de microcentrífuga.
  8. Gire hacia abajo la proteína marcada una vez durante 5 minutos a 1.5 RCF.
  9. Tome un espectro UV-vis utilizando un espectrofotómetro de nanodrop a 280 nm y 554 nm y calcule la eficiencia de etiquetado siguiendo el manual del fabricante.
  10. Guarde la proteína marcada cubierta a 5 °C hasta su uso posterior. La solución es estable durante aproximadamente una semana después del etiquetado.

2. GUVs con 5-HT 1A incorporado por membrana

  1. Preparación de materiales y reactivos
    1. Permita que la proteína, los lípidos y la BSA (albúmina sérica bovina) se equilibren a temperatura ambiente.
    2. Durante este tiempo, limpie las fundas colocándolas en metanol y sonicando durante 30 min a 40 °C. Asegúrese de que el metanol cubra completamente los cubrehojas y que el nivel de agua en el baño de agua esté por encima del nivel del metanol en el recipiente.
      NOTA: El metanol es tóxico y debe manipularse en la campana química adecuada.
    3. Seque el exceso de metanol en las cubiertas con una suave corriente de aire. Coloque la rejilla de la cubierta cubierta en un horno de 40 °C durante 15 minutos para asegurarse de que el exceso de fundas se seque.
    4. Comience el proceso de limpieza por plasma. Primero, coloque las cubiertas en el limpiador de plasma y cierre la válvula de admisión de aire para evacuar todo el aire dentro de la cámara.
    5. Una vez que la cámara esté bajo vacío, limpie las cubiertas durante 5 minutos con un ajuste de alta potencia de RF y un vacío casi completo, con solo una ligera entrada de aire en la cámara de vacío. Para garantizar el nivel adecuado de plasma, ajuste la abertura de la cámara de vacío de modo que el color resultante del plasma sea un rosa constante y brillante.
      NOTA: Es crucial cuando se usa aire que el plasma permanezca de un color rosa brillante durante la duración del paso del tratamiento con plasma, ya que un color púrpura más oscuro indica que hay una cantidad inadecuada de aire en la cámara y dará como resultado un tratamiento de plasma subóptimo.
    6. Una vez transcurridos los 5 min, apaga la potencia de RF y suelta el vacío.
      NOTA: Al retirarla de la cámara de plasma, asegúrese de que las cubiertas permanezcan cubiertas.
  2. Preparación de hidrogel
    1. Combine 6 mg de agarosa a temperatura de fusión ultra baja con 300 μL de agua ultrapura (es decir, 2% (p/v) de agarosa).
      NOTA: Se utilizará agarosa al 2% para hacer GUV sin proteínas. La solución de agarosa se puede mantener a 45 °C durante dos días.
    2. Combine 9 mg de agarosa a temperatura ultrabaja con 300 μL de agua ultrapura para 3 p/v% de agarosa según lo preparado en la etapa 3.1. Se utilizará agarosa al 3% para hacer GUV incorporados en proteínas.
    3. Vórtice la solución brevemente antes de colocarlos en el bloque de calor de 90 °C durante 10 min. Luego, vórtice el tubo nuevamente antes de transferirlo a un bloque de calor de 45 ° C para mantenerlo en forma fundida hasta su uso posterior.
  3. Mezcla de agarosa y proteínas
    1. Mezclar 21 μL de agarosa al 3% con los 7 μL de fragmentos de membrana 5-HT1AR. Pipete hacia arriba y hacia abajo lentamente muchas veces para garantizar una mezcla adecuada. Luego, incubar a 45 °C durante 1 min.
  4. Hidrogel y deposición de lípidos
    1. Para GUV sin proteínas: Haga una película delgada en fundas recién limpiadas con plasma usando 20 μL de agarosa al 2%. Deje caer rápidamente otra funda en la parte superior de la gota de agarosa y deslice suavemente las hojas de cubierta para hacer una película delgada en ambas hojas.
      NOTA: Este paso es complicado ya que el deslizamiento de la gota debe ocurrir mientras la agarosa todavía está en forma fundida.
    2. Para guV incorporados a proteínas: Pipetee la mezcla de proteína / agarosa hacia arriba y hacia abajo una vez más, y luego deposite 20 μL de la agarosa al 2% en un cubrehojas limpiado con plasma. Siga las instrucciones de fundición deslizante como se describió anteriormente.
    3. Deje que la agarosa se gelifique protegida de la luz durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    4. Deposite los lípidos gota a gota en la parte superior de la capa de agarosa. Utilice un total de 10 μL de 2 mg/ml de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) con 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE) marcado con ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (o mezcla lipídica de interés) en cloroformo en la parte superior de la película de agarosa. Deposite las gotas con una aguja de cromatografía de gases y extienda una gota a la vez a través de una corriente de aire suave.
      NOTA: Se necesita precaución con este paso para hacer una capa relativamente uniforme de lípidos en la parte superior del hidrogel. Además, el cloroformo es tóxico y debe manipularse en una campana química adecuada.
    5. Ensamble las cámaras Sykes-Moore (S-M) colocando una junta tórica en la parte superior de la cubierta y, a continuación, colocando el componente superior de la cámara en la parte superior de la junta tórica. Utilice la llave proporcionada por el fabricante para ensamblar la cámara atornillando los componentes de la cámara para sellar la cámara y evitar cualquier fuga.
      NOTA: La parte superior de la cámara debe apretarse en la junta tórica, pero se debe tener precaución para garantizar que la cubierta permanezca intacta, ya que la cubierta puede agrietarse si la junta tórica no se asienta correctamente en la cámara. Además, asegúrese de que la cámara esté sellada lo suficientemente hermética como para que la cámara no tenga fugas cuando se agrega la solución de hinchazón. Si no se aprieta lo suficiente la cámara, se producirán fugas y pérdida de muestra.
  5. Hinchazón y cosecha de vesículas
    1. Hidrate todo el sistema canalizando suavemente 450 μL de sacarosa de 200 mM en 1x PBS y golpeando suavemente las cámaras para garantizar una cobertura tampón adecuada de las capas de hidrogel-lípido.
      NOTA: La solución de sacarosa se puede reemplazar con un tampón de rehidratación que contiene sondas biológicas de interés.
    2. Coloque las cámaras a 45 °C y cubra la parte superior de la cámara con una funda para evitar la evaporación. Deje que la muestra se hinche, protegida de escombros y luz durante 1 h.
    3. Agregue 100 μL de 1 mg/ml de BSA en agua ultrapura en cada pozo de una placa de 96 pocillos destinada a ser utilizada. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Lavar tres veces con agua ultrapura y una vez con sacarosa de 200 mM en 1x PBS.
    5. Finalmente, agregue 200 mM de glucosa en 1x PBS hasta la adición de la solución de muestra de GUV.
      NOTA: BSA se utilizó para bloquear la adsorción de GUV.
    6. Después de permitir que el hidrogel se hinche, agite suavemente y golpee la cámara para desalojar cualquier GUV que pueda permanecer adherido a la superficie del hidrogel. Luego, pipetee cuidadosamente la solución de sacarosa GUV.
      NOTA: Como paso opcional para garantizar que todas las vesículas estén separadas de la superficie, pipetee suavemente parte de la suspensión de sacarosa sobre la superficie del hidrogel.
    7. Mueva la suspensión a un tubo de microcentrífuga previamente preparado que contenga 700 μL de glucosa de 200 mM en 1x PBS.
      NOTA: El gradiente de densidad conducirá a la sedimentación de las vesículas en la parte inferior del tubo de la centrífuga.
    8. Deje que las vesículas se asienten durante otra hora para asegurarse de que las vesículas puedan hundirse en el fondo del tubo de la microcentrífuga, lo que permite una recolección óptima.
    9. Después de la sedimentación de los GUV en glucosa, transfiera 300 μL desde el fondo del tubo de la centrífuga (las vesículas asentadas) a la placa de 96 pocillos previamente preparada y tratada con BSA para examinar las vesículas bajo el microscopio confocal.
      NOTA: Asegúrese de evitar la parte inferior del tubo de la microcentrífuga para minimizar la cantidad de desechos recolectados en la muestra final.
  6. Revise las muestras bajo el microscopio.
    1. Hacer brillar un láser de 488 nm sobre la muestra (que nos permite visualizar la membrana, ya que la bicapa ha sido etiquetada con ATTO-488-DPPE).
    2. Hacer brillar un láser de 561 nm sobre la muestra (que nos permite visualizar la proteína, ya que ha sido etiquetada con NHS-Rhodamine).
      NOTA: Se necesita precaución al tomar imágenes de la muestra, ya que la fotooxidación puede desestabilizar las vesículas. Las vesículas fueron observadas el mismo día.

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Figura 1: Ilustración de los pasos detallados del protocolo. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Se midió la concentración de proteína y se calculó el grado de etiquetado como la relación molar entre el colorante y la proteína para ser 1:1. Al examinar los GUV utilizando microscopía confocal, pudimos confirmar la formación exitosa y la integración de proteínas de las vesículas. Los lípidos se marcaron con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, y la proteína se marcó covalentemente a través de la modificación del éster NHS de rodamina de las aminas primarias. La Figura 2a y

Discusión

Hemos identificado dos pasos que son críticos para el éxito del protocolo general: el tratamiento con plasma y la deposición de lípidos. La limpieza con plasma de las cubiertas es esencial para garantizar que haya una cobertura y adhesión adecuadas del hidrogel de agarosa a la cubierta de vidrio. La limpieza por plasma logra dos cosas: primero, elimina rastros de materia orgánica de la superficie del vidrio; en segundo lugar, activa la superficie de la cubierta, lo que permite un aumento de la humectabilidad a medi...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Matthew Blosser por su valiosa discusión y consejo. Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Investigación Naval (N00014-16-1-2382) y la Fundación Nacional de Ciencias (PHY-1915017).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscopeNikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-ringsSterling Seal & Supply, Neptune, IN5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device cameraPhotometrics, Huntington Beach, CA Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nmCoherent, Santa Clara, CA488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragmentsPerkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, GermanyAD 488-155
Bench top plasma cleanerHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
bovine serum albumin (BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
chloroform (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
Cholesterol (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear BottomCorning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Germany[no longer sold on main website]
glucoseSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
methanol (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
spinning-disc CSUX confocal headYokogawa,Tokyo, JapanCSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslipsChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
sucroseSigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Sykes-Moore chambersBellco, Vineland, NJ1943-11111
Ultra-low melting temperature agaroseSigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
VWR Analog HeatblockVWR International, Radnor, PA[no longer sold on main website]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

Referencias

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