Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Riepilogo

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Abstract

Allo stato stazionario, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) rimangono in gran parte quiescenti e si ritiene che dipendano prevalentemente dalla glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Tuttavia, in condizioni di stress come infezioni o perdita di sangue, le HSC diventano proliferative e producono rapidamente cellule progenitrici a valle, che a loro volta si differenziano ulteriormente, producendo infine cellule del sangue mature. Durante questo processo di transizione e differenziazione, le HSC escono dalla quiescenza e subiscono rapidamente un passaggio metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa (OxPHOS). Varie condizioni di stress, come l'invecchiamento, il cancro, il diabete e l'obesità, possono avere un impatto negativo sulla funzione mitocondriale e quindi possono alterare la riprogrammazione metabolica e la differenziazione delle HSC e dei progenitori durante l'ematopoiesi. Preziose informazioni sulle funzioni glicolitiche e mitocondriali di HSC e progenitori in condizioni normali e di stress possono essere ottenute attraverso la valutazione del loro tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e del tasso di consumo di ossigeno (OCR), che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente.

Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in popolazioni di cellule derivate dal midollo osseo di topo, che includono sia cellule staminali ematopoietiche che cellule progenitrici primitive (HSPC), utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare le cellule negative al lignaggio dal midollo osseo del topo, spiega l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e le concentrazioni di 2-deossi-D-glucosio (2-DG, un analogo del glucosio che inibisce la glicolisi) e vari farmaci mirati a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A) utilizzati in questi saggi e descrive le strategie di trattamento farmacologico. In questi saggi possono essere misurati i parametri chiave del flusso glicolitico, come la glicolisi, la capacità glicolitica e la riserva glicolitica e i parametri OxPHOS, come la respirazione basale, la respirazione massima, la perdita di protoni, la produzione di ATP, la capacità respiratoria di riserva e l'efficienza di accoppiamento. Questo protocollo consente misurazioni ECAR e OCR su HSPC non aderenti e può essere generalizzato per ottimizzare le condizioni di analisi per qualsiasi tipo di cella di sospensione.

Introduzione

L'ematopoiesi è il processo mediante il quale vari tipi di cellule del sangue mature con funzioni altamente specializzate sono formate da HSC¹. Le HSC sono in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in varie popolazioni progenitrici multipotenti e specifiche del lignaggio. Questi progenitori alla fine producono cellule di lignaggi linfoidi, mieloidi, eritroidi e megacariociti. Per mantenere la loro capacità di auto-rinnovamento, le HSC rimangono in gran parte quiescenti e, come altre cellule staminali tissutali, si ritiene che si basino sulla glicolisi piuttosto che sull'OxPHOS mitocondriale per la produzione di ATP ^2,3. L'ingresso nel ciclo cellulare porta a una migliore respirazione e OxPHOS, con conseguenti livelli elevati di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono dannosi per il mantenimento e la funzione HSC³. La divisione cellulare ripetuta può quindi portare a una ridotta capacità di auto-rinnovamento delle HSC e, in definitiva, al loro esaurimento.

Nell'emopoiesi adulta, le HSC subiscono principalmente una divisione cellulare asimmetrica, durante la quale una delle cellule figlie mantiene il potenziale HSC e continua a fare affidamento sul metabolismo glicolitico. L'altra cellula figlia diventa una cellula progenitrice primitiva che perde la capacità di auto-rinnovamento ma prolifera e alla fine dà origine a cellule ematopoietiche funzionali differenziate⁴. Quando le HSC si differenziano per produrre progenitori a valle, si pensa che si verifichi un passaggio dalla glicolisi al metabolismo mitocondriale per fornire l'energia e gli elementi costitutivi necessari per supportare questa rapida transizione⁵, come suggerito dalle osservazioni che le HSC possiedono massa mitocondriale inattiva 6,7,8,9 . Al contrario, l'attività mitocondriale (indicata dai livelli di ROS collegati) è molto più alta nei progenitori impegnati nel lignaggio rispetto alle HSC ^9,10,11. I cambiamenti metabolici che si verificano durante la prima fase dell'ematopoiesi suggeriscono quindi un ruolo diretto e cruciale dei mitocondri nella regolazione del destino HSC.

I mitocondri disfunzionali presenti in varie condizioni di stress, come l'invecchiamento, il cancro, il diabete e l'obesit๲, possono interferire con la capacità di auto-rinnovamento HSC, inducendo uno squilibrio nella differenziazione HSC / progenitore producendo quantità eccessive di ROS, compromettendo la produzione di ATP e / o alterando altri processi metabolici ^9,12,13 . Le perturbazioni nell'omeostasi metabolica nel differenziamento HSC/progenitore potrebbero avere un impatto significativo sull'ematopoiesi, contribuendo potenzialmente allo sviluppo di anomalie ematologiche¹³. Date le influenze critiche della glicolisi e dell'OxPHOS mitocondriale sulla staminalità e la differenziazione dell'HSC, è interessante studiare sia i parametri metabolici in condizioni normali che di stress. Preziose informazioni sulla funzione glicolitica e mitocondriale delle HSC e delle cellule progenitrici possono essere ottenute valutando la loro ECAR e OCR, che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente.

L'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse è un potente apparato dotato di due sonde per pozzo per misurare contemporaneamente ECAR e OCR in cellule vive e quindi può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale, in risposta a vari substrati o inibitori. La cartuccia di analisi utilizzata con l'analizzatore contiene porte di iniezione per contenere fino a quattro farmaci per l'iniezione automatica durante il test. Uno schema di un tipico test di stress della glicolisi è mostrato nella Figura 1A. Il test inizia con la misurazione dell'ECAR delle cellule, incubate in mezzo di prova da stress di glicolisi contenente glutammina ma non glucosio o piruvato. Ciò rappresenta l'acidificazione che si verifica a causa delle attività non glicolitiche delle cellule ed è riportata come acidificazione non glicolitica. Questo è seguito dall'iniezione di glucosio a una concentrazione saturante. Attraverso la glicolisi, il glucosio nella cellula viene convertito in piruvato, che viene ulteriormente metabolizzato nel citoplasma per produrre lattato, o nei mitocondri per produrre CO₂ e acqua.

La conversione del glucosio in lattato provoca la produzione netta e il successivo rilascio di protoni nel mezzo extracellulare, con conseguente rapido aumento dell'ECAR 14,15,16. Questo cambiamento stimolato dal glucosio in ECAR è riportato come glicolisi in condizioni basali. La seconda iniezione consiste in oligomicina (un inibitore dell'ATP sintasi, noto anche come complesso V¹⁷), che inibisce la produzione mitocondriale di ATP. Durante l'inibizione dell'OxPHOS mediata dall'oligomicina, le cellule sovraregolano al massimo la glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Ciò provoca un ulteriore aumento dell'ECAR, rivelando la massima capacità glicolitica delle cellule. La differenza tra la capacità glicolitica massima e la glicolisi basale è indicata come riserva glicolitica. Infine, viene iniettato 2-DG, che provoca un calo significativo dell'ECAR, di solito vicino ai livelli di acidificazione non glicolitica. 2-DG è un analogo del glucosio che si lega in modo competitivo all'esochinasi, con conseguente inibizione della glicolisi¹⁸. Pertanto, la diminuzione indotta da 2-DG nell'ECAR conferma ulteriormente che la glicolisi è effettivamente la fonte di ECAR osservata dopo iniezioni di glucosio e oligomicina.

La Figura 1B mostra lo schema per un tipico test di stress mitocondriale. Il test inizia con la misurazione OCR al basale delle cellule, incubate in mezzo di prova da stress mitocondriale contenente glucosio, glutammina e piruvato. A seguito di misurazioni OCR basali, l'oligomicina viene iniettata in questo test, che inibisce il complesso V, riducendo così il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC)¹⁷. Di conseguenza, l'OCR è ridotto in risposta all'iniezione di oligomicina e questa diminuzione dell'OCR è legata alla produzione mitocondriale di ATP. La seconda iniezione consiste in carbonile cianuro-4 (trifluorometossico) fenilidrazone (FCCP), un protonoforo e un disaccoppiatore di OxPHOS¹⁷ mitocondriale. FCCP collassa il gradiente protonico mitocondriale consentendo il flusso di protoni attraverso la membrana interna mitocondriale. A causa dell'iniezione FCCP, il flusso di elettroni attraverso l'ETC viene depresso e il complesso IV consuma ossigeno al massimo livello. La differenza tra OCR massimo e OCR basale è indicata come capacità respiratoria di riserva, che è una misura della capacità della cellula di rispondere all'aumento della domanda di energia in condizioni di stress. Infine, viene iniettata una miscela di due inibitori ETC (rotenone, un inibitore del complesso I e antimicina A, un inibitore del complesso III¹⁷), che arresta completamente il flusso di elettroni e l'OCR diminuisce a un livello basso. L'OCR misurato dopo l'iniezione di rotenone e antimicina A corrisponde all'OCR non mitocondriale guidato da altri processi all'interno delle cellule. L'OCR non mitocondriale consente il calcolo della respirazione basale, della perdita di protoni e della respirazione massima.

La respirazione basale rappresenta la differenza tra OCR basale e OCR non mitocondriale. La perdita di protoni si riferisce alla differenza tra oCR dopo iniezione di oligomicina e OCR non mitocondriale. La respirazione massima rappresenta la differenza tra oCR dopo iniezione di FCCP e OCR non mitocondriale. L'efficienza di accoppiamento è calcolata come percentuale del tasso di produzione di ATP rispetto alla frequenza di respirazione basale. Questo documento di metodo fornisce un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in HSPC negativi alla linea utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XFe96. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare gli HSPC negativi al lignaggio del topo, spiega l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e delle concentrazioni di vari farmaci utilizzati nei saggi di flusso extracellulare e descrive le strategie di trattamento farmacologico.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali vertebrati sono stati approvati ed eseguiti in conformità con i regolamenti del Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan.

1. Giorno prima del test (tempo totale: ~ 10 min)

1. Idratazione della cartuccia del sensore (tempo di passaggio: ~10 min)
   1. Aprire il kit di analisi del flusso extracellulare e rimuovere la cartuccia del sensore e il gruppo della piastra di utilità. Salva i piani guida di carico per utilizzarli il giorno successivo.
   2. Separare manualmente la cartuccia del sensore (la parte verde superiore con coperchio) dalla piastra di utilità (micropiastra inferiore a 96 pozzetti) e posizionarla capovolta accanto alla piastra di utilità.
   3. Utilizzando una pipetta multicanale, riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con 200 μL di calibrante, incluso con il kit di analisi del flusso.
   4. Riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità, assicurandosi di immergere completamente i sensori nel calibrante.
   5. Posizionare la cartuccia del sensore assemblata e la piastra di utilità con il calibrante in un incubatore non CO₂ a 37 °C durante la notte. Per evitare l'evaporazione del calibrante, assicurarsi che l'incubatore sia adeguatamente umidificato. Se si utilizza un normale incubatore a forno per incubazioni non CO₂ a 37 °C, posizionare un becher aperto contenente acqua all'interno dell'incubatore per umidificarlo. Se disponibile, utilizzare una stazione di preparazione XF per tutte le incubazioni diverse dal CO₂ a 37 °C.
      NOTA: In alternativa, la cartuccia del sensore può essere idratata durante la notte con 200 μL per pozzetto di acqua ultrapura sterile in un incubatore non CO₂ a 37 °C. Sostituire l'acqua con 200 μL per pozzetto di calibrante preriscaldato a 37 °C, almeno 45-60 minuti prima di caricare le porte di iniezione il giorno del test.

2. Giorno del test (Tempo totale: ~9 h 30 min)

NOTA: il tempo totale sopra indicato include le durate cumulative dei passaggi 2.1-2.4 oltre al passaggio 2.5 o 2.6.

1. Preparazione di micropiastre rivestite di adesivo cellulare (Tempo di passaggio: ~1 h 30 min)
   NOTA: eseguire tutti i passaggi in un armadio di biosicurezza.
   1. Preparare 2,5 mL della soluzione adesiva cellulare (22,4 μg/mL, vedere la Tabella dei materiali) per micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti sciogliendo 56 μg dell'adesivo cellulare in un volume appropriato di bicarbonato di sodio 0,1 M sterilizzato con filtro (pH 8,0) e aggiungendo immediatamente 1 N idrossido di sodio a metà del volume di materiale adesivo cellulare utilizzato. Vortice o pipetta su e giù per mescolare.
   2. Aprire la micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (inclusa nel kit di analisi del flusso) ed erogare 25 μL della soluzione adesiva cellulare preparata sul fondo di ciascun pozzetto. Coprire la micropiastra con il coperchio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno della cappa.
   3. Dopo l'incubazione, rimuovere e scartare la soluzione adesiva cellulare in eccesso utilizzando una pipetta multicanale o un aspiratore e lavare ciascun pozzetto due volte con 200 μL di acqua ultrapura sterile. Asciugare all'aria la piastra, con il coperchio rimosso, all'interno della cappa per 30-45 min.
      NOTA: le micropiastre di coltura cellulare rivestite con adesivo cellulare possono essere conservate fino a una settimana a 4 °C. Le micropiastre precoattate conservate a 4 °C devono essere lasciate riscaldare a temperatura ambiente all'interno della cappa prima della semina delle celle.
2. Preparazione del mezzo di analisi (tempo di passo: ~ 30 min)
   1. Preparazione del mezzo di prova di stress della glicolisi
      1. Integrare 100 mL di base media (vedere la Tabella dei materiali) con 1 mL di 200 mM di L-glutammina.
         NOTA: La concentrazione finale di L-glutammina nel mezzo di analisi è di 2 mM.
      2. Riscaldare il mezzo integrato con L-glutammina a 37 °C a bagnomaria.
      3. Regolare il pH del mezzo caldo a 7,4 con 1 N NaOH.
      4. Filtrare il mezzo con un filtro da 0,2 μm e mantenerlo a 37 °C fino al momento dell'uso.
   2. Preparazione del mezzo di prova di stress test mitocondriale
      1. Integrare 100 mL del mezzo base con 0,45 g di glucosio, 1 mL di 200 mM di L-glutammina e 1 mL di 100 mM di piruvato di sodio.
         NOTA: Il mezzo di analisi finale contiene 25 mM di glucosio, 2 mM di L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio.
      2. Glucosio caldo, L-glutammina e il mezzo integrato con piruvato di sodio a 37 °C a bagnomaria.
      3. Regolare il pH del mezzo caldo a 7,4 con 1 N NaOH.
      4. Mezzo filtrante sterilizzante con un filtro da 0,2 μm e conservare a 37 °C fino al momento dell'uso.
3. HSPC negativi alla derivazione del topo di raccolta (tempo di passaggio: ~ 3 h)
   1. Preparare il tampone di dosaggio integrando la soluzione salina bilanciata di Hank con siero bovino fetale al 4%. Preparare 1x tampone di arricchimento diluendo il 5x stock con acqua distillata sterile. Tenere entrambi i tamponi sul ghiaccio fino all'uso.
   2. L'eutanasia umana dei topi usando CO₂ seguita da lussazione cervicale e rimuovere gli arti posteriori con le forbici. Rimuovere con cura tutti i tessuti dalle ossa e tagliare le estremità da entrambi i lati del femore e della tibia usando le forbici. Scovare le cellule del midollo osseo dal femore e dalla tibia usando il tampone del saggio. Passare le cellule lavate attraverso un filtro sterile da 70 μm, centrifugare il filtrato a 200 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   3. Lisare i globuli rossi risospendendo il pellet cellulare in 500 μL di tampone ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Dopo la lisi per 1 minuto su ghiaccio, lavare i campioni aggiungendo 1 mL di tampone di dosaggio e centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
   4. Dopo il lavaggio, incubare i campioni con un cocktail di anticorpi biotinilati diretti contro CD2 (diluizione 1:200), CD3 (diluizione 1:200), CD5 (diluizione 1:200), CD8 (diluizione 1:200), Ter-119 (diluizione 1:200), B220 (diluizione 1:200) e Gr-1 (diluizione 1:800) per 45 minuti su ghiaccio in un volume totale di 500 μL di tampone di analisi.
   5. Lavare i campioni con 1 mL di tampone di dosaggio con centrifugazione come sopra.
   6. Lavare i campioni con 1 mL di 1x tampone di arricchimento con centrifugazione come sopra.
   7. Incubare i campioni con 20 μL di nanosfere di streptavidina e 100 μL di tampone di arricchimento 1x su ghiaccio per 15 min.
   8. Lavare i campioni con 1 mL di 1x tampone di arricchimento con centrifugazione come sopra.
   9. Risospesare i campioni in 2,5 ml di tampone di arricchimento 1x. Metterli su un magnete di separazione per 5 minuti. Raccogliere i supernatanti separatamente in tubi conici da 15 ml.
   10. Sospendere i campioni separati da magneti in un ulteriore tampone di arricchimento da 2,5 mL e riposizionarli sul magnete di separazione per 5 minuti. Raccogliere e combinare i supernatanti alle collezioni precedenti in tubi conici da 15 ml dal punto 2.3.9.
       NOTA: i supernatanti contengono le frazioni cellulari negative al lignaggio.
   11. Centrifugare i tubi conici da 15 mL contenenti le celle selezionate negativamente per 5 min a 200 × g a 4 °C.
   12. Risospesciare i pellet di cellule in 1 mL di tampone di saggio e contare il numero di cellule usando il tripano blu manualmente o tramite un contatore di celle automatizzato come una contessa 3.
       NOTA: Seguendo l'approccio sopra descritto, ~6 × 10⁶ HSPC negativi alla linea dovrebbero essere prontamente purificati dagli arti posteriori di un singolo topo. Se i reagenti, come il tampone del saggio, il tampone di arricchimento 1x e il cocktail di anticorpi specifici del lignaggio, vengono preparati il giorno prima dell'esperimento, ci vogliono circa 2,5-3 ore per arricchire gli HSPC di 4 topi. Ci vorrebbero altri 10 minuti per ogni mouse oltre questo numero.
4. Cellule di semina in micropiastre rivestite con adesivo cellulare (Tempo di passaggio: ~1 h)
   1. Centrifugare le celle dal passo 2.3.12 a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare nel mezzo di saggio appropriato (mezzo di prova di stress di glicolisi o mezzo di prova di stress mitocondriale). Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Ripetere il passaggio 2.4.2. Rimuovere il surnatante e risospese le cellule nel mezzo di saggio riscaldato appropriato alla concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule per 50 μL o 5 × 10⁶ per mL.
   4. Pipetta 50 μL della sospensione cellulare lungo il lato di ciascun pozzetto della micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti rivestita con adesivo adesivo a temperatura ambiente. Pipettare 50 μL del mezzo di saggio nei pozzetti di misura di fondo angolari. Utilizzare una pipetta multicanale per la placcatura delle celle per garantire la coerenza.
   5. Creare una piastra di bilanciamento della centrifuga aggiungendo 50 μL di acqua per pozzetto di una micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti non rivestita.
   6. Centrifugare le celle nella piastra a 200 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Non frenare. Trasferire la piastra in un incubatore non CO₂ a 37 °C per 25-30 minuti per assicurarsi che le celle siano completamente attaccate. Confermare visivamente al microscopio che le cellule sono stabilmente aderenti alla superficie della micropiastra.
      NOTA: Poiché ~6 × 10⁶ HSPC negativi alla linea possono essere raccolti dagli arti posteriori di un singolo topo, gli HSPC isolati da 4 topi (~ 2,4 × 10⁷ cellule) sono necessari per riempire un'intera piastra a 96 pozzetti se lo scopo è quello di schermare più interventi ex vivo in parallelo. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di studiare l'impatto di un'alterazione genetica o di un intervento sui parametri metabolici delle HSPC in vivo, allora gli HSPC isolati da più coppie di topi di controllo e di prova possono essere analizzati in più repliche tecniche in parallelo utilizzando una singola piastra.
5. Esecuzione di test di stress di glicolisi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare (Tempo di passaggio: ~ 3 h 30 min)
   1. Cartuccia sensore di carico con composti iniettabili
      1. Preparare soluzioni da 100 mM di glucosio, 20 μM di oligomicina e 500 mM di 2-DG in mezzo di prova da stress per test di glicolisi preriscaldato (pH 7,4).
         NOTA: Tutte le soluzioni composte per iniezione sono realizzate a una concentrazione di 10x. Le concentrazioni finali del pozzo sono 10 mM per il glucosio, 2 μM per l'oligomicina e 50 mM per il 2-DG (vedi Tabella 1).
      2. Rimuovere la cartuccia del sensore idrato dall'incubatore non CO₂ a 37 °C dal punto 1.1.5. Rimuovere le bolle d'aria dal calibrante nella piastra di utilità sollevando la cartuccia del sensore dal calibrante e sostituendola sulla stessa piastra di utilità con il calibrante.
      3. Posizionare la guida di carico A/D piatta (inclusa nel kit di analisi del flusso extracellulare) sulla parte superiore della cartuccia del sensore, orientandola in modo che la lettera "A" si trovi nell'angolo in alto a sinistra per garantire che solo le porte A siano disponibili per il caricamento. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 20 μL di 100 mM di soluzione di glucosio nelle porte A.
      4. Sostituire la guida di carico A/D piatta con la guida di carico B/C piatta, orientandosi in modo che la lettera 'B' si trovi nell'angolo in alto a sinistra per garantire che solo le porte B siano disponibili per il caricamento. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 22 μL di soluzione di oligomicina da 20 μM nelle porte B.
      5. Riorientare la guida di carico B/C in piano per individuare la lettera 'C' nell'angolo in alto a sinistra per le porte di carico C. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 25 μL di soluzione 2-DG da 500 mM nelle porte C.
      6. Rimuovere ed eliminare i piatti della guida di carico.
         NOTA: È importante che ogni serie di porte di tutti i 96 pozzetti, compresi quelli dei pozzetti di fondo, sia caricata completamente con lo stesso volume del composto di iniezione.
   2. Creazione, calibrazione e misurazione di modelli
      1. Creare o caricare il modello per il test di stress della glicolisi sul controller. Immettere i dettagli relativi alle strategie di iniezione, alle condizioni di trattamento e ai tipi di cellule e premere genera gruppi. Vai alla mappa della piastra e assegna i pozzetti a ciascun gruppo da analizzare. Assegnare i 4 pozzetti angolari per le misurazioni di fondo.
      2. Nel protocollo, assicurarsi che la calibrazione e l'equilibrio siano controllati nella fase di inizializzazione .
      3. Per la misurazione al basale e le misurazioni dopo ogni iniezione (glucosio, oligomicina e 2-DG), impostare il numero di cicli di misurazione su 3 e Mescolare - Attendere - Misurare i tempi su 3 min - 0 min - 3 min (vedere Tabella 2).
      4. Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore caricata e idratata, immersa nel calibrante nella piastra di utilità. Posizionalo sul vassoio di lavoro dell'analizzatore di flusso extracellulare e inizia la corsa.
         NOTA: Il primo passo è la calibrazione, che di solito richiede ~ 20 minuti.
      5. Estrarre la micropiastra contenente le cellule dall'incubatore non CO₂ a 37 °C dal passaggio 2.4.6 dopo che 25-30 minuti di incubazione sono finiti. Senza disturbare le cellule, aggiungere lentamente 130 μL del mezzo di prova della glicolisi preriscaldata (pH 7,4) per pozzetto per portare il volume medio in ciascun pozzetto a 180 μL e riportare la piastra all'incubatore non CO₂ a 37 °C per ulteriori 15-20 minuti.
         NOTA: è preferibile un tempo di incubazione totale di 45-60 minuti dopo la centrifugazione.
      6. Al termine della calibrazione, sostituire la piastra di utilità con la micropiastra di analisi (senza coperchio) contenente le celle. Premere La piastra della cella di carico per avviare le misurazioni, che richiederanno ~ 1,5 ore per il completamento del test.
      7. Al termine delle misurazioni, raccogliere la micropiastra di dosaggio contenente le cellule e rimuovere il mezzo di analisi senza disturbare le cellule. Lavare una volta delicatamente con 250 μL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato senza spostare le cellule.
      8. Aggiungere 10 μL di tampone di lisi RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5% Na desossicolato, 0,1% dodecilsolfato di sodio, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), integrato con 1x cocktail inibitore della proteasi, a ciascun pozzetto e agitare la piastra su uno shaker per 10 min. Congelare l'intera piastra a -80 °C.
      9. Scongelare la piastra ed eseguire un test di misurazione delle proteine per la normalizzazione dei dati seguendo le istruzioni del produttore.
      10. Recupera e analizza i dati. Aprire il file di dati utilizzando Wave Desktop Software. Fare clic su Normalizza e incollare i valori di normalizzazione per ciascun pozzetto. Fare clic su Applica per normalizzare i dati. Fare clic su Esporta e selezionare il generatore di report di stress test di glicolisi per esportare i dati analizzati in un generatore di report. In alternativa, esportare i dati in un'applicazione esterna.
          NOTA: In alternativa, il contenuto totale di DNA nucleare in ciascun pozzo può essere utilizzato per normalizzare i dati. Un colorante fluorescente, come CyQuant che si lega all'acido nucleico, può essere utilizzato per valutare il contenuto totale di DNA nucleare per pozzo.
6. Esecuzione di uno stress test mitocondriale utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare (Tempo di passaggio: ~ 3 h 30 min)
   1. Cartuccia sensore di carico con composti iniettabili
      1. Preparare soluzioni di oligomicina da 20 μM, FCCP da 20 μM e 5 μM di rotenone + 5 μM di antimicina A in mezzo di prova di stress test mitocondriale preriscaldato (pH 7,4).
         NOTA: Tutte le soluzioni composte per iniezione sono realizzate a una concentrazione di 10x. Le concentrazioni finali del pozzo sono 2 μM per l'oligomicina, 2 μM per FCCP e 0,5 μM ciascuna per rotenone e antimicina A (vedere Tabella 3).
      2. Rimuovere la cartuccia del sensore idrato dall'incubatore a 37 °C dal punto 1.1.5 e rimuovere le bolle d'aria come descritto in precedenza al punto 2.5.1.2.
      3. Seguendo i passaggi da 2.5.1.3 a 2.5.1.6, erogare 20 μL di oligomicina da 20 μM nelle porte A, 22 μL di 20 μM FCCP nelle porte B e 25 μL di una miscela di 5 μM di rotenone e 5 μM di antimicina A nelle porte C.
         NOTA: È importante che ogni serie di porte di tutti i 96 pozzetti, compresi quelli dei pozzetti di fondo, sia caricata completamente con lo stesso volume di composto di iniezione.
   2. Creazione, calibrazione e misurazione di modelli
      1. Creare o caricare il modello per lo stress test mitocondriale sul controller. Immettere i dettagli relativi alle strategie di iniezione, alle condizioni di trattamento e ai tipi di cellule e premere genera gruppi. Vai alla mappa della piastra e assegna i pozzetti a ciascun gruppo da analizzare. Assegnare i 4 pozzetti angolari per le misurazioni di fondo.
      2. Nel protocollo, assicurarsi che la calibrazione e l'equilibrio siano controllati nella fase di inizializzazione.
      3. Per la misurazione al basale e le misurazioni dopo ogni iniezione (oligomicina, FCCP e rotenone + antimicina A), impostare il numero di cicli di misurazione su 3 e Mescolare - Attendere - Misurare i tempi a 3 min - 0 min - 3 min (vedere Tabella 4).
      4. Avviare la corsa per eseguire la calibrazione come nel passaggio 2.5.2.4.
      5. Aggiungere 130 μL del mezzo di prova mitocondriale prebellico (pH 7,4) e nel passaggio 2.5.2.5.
      6. Avviare le misurazioni; recuperare e analizzare i dati come nei passaggi da 2.5.2.6 a 2.5.2.10. Esportare i dati analizzati nel generatore di rapporti di stress test mitocondriale o in un'applicazione esterna.

Risultati

Utilizzando questo protocollo, il numero di cellule e le concentrazioni di vari farmaci mirati a OxPHOS (utilizzati nei saggi di flusso extracellulare) sono stati ottimizzati per misurare ECAR e OCR di HSPC isolati da topi C57BL/6 di 24 settimane. In primo luogo, è stato eseguito il test di stress della glicolisi per ottimizzare il numero di cellule e la concentrazione di oligomicina. In questo test è stato utilizzato un numero variabile di HSPC per pozzo che va da 5 × 10⁴ a^2,5 × 10 5. Come most...

Discussione

Questo documento di metodo descrive un protocollo ottimizzato per la valutazione della bioenergetica cellulare (glicolisi e OxPHOS) negli HSPC di topo utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse. Questo dispositivo è un potente strumento che misura contemporaneamente l'ECAR e l'OCR delle cellule vive, che sono metriche della glicolisi e della respirazione mitocondriale, rispettivamente. Pertanto, può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale. Inoltre, la piattaforma basat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate