Fabrikasjon og drift av et kontinuerlig strømnings-, mikroelektroporeringssystem med permeabiliseringsdeteksjon

Denne protokollen beskriver mikrofabrikasjonsteknikkene som kreves for å bygge en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporeringsenhet. Det eksperimentelle oppsettet utfører kontrollerte transfeksjoner på enkeltcellenivå i en kontinuerlig flyt og kan utvides til høyere gjennomstrømning med populasjonsbasert kontroll. En analyse er gitt som viser evnen til elektrisk å overvåke graden av cellemembranpermeabilisering i sanntid.

Nåværende terapeutiske innovasjoner, som CAR-T-celleterapi, er sterkt avhengige av virusmediert genlevering. Selv om den er effektiv, er denne teknikken ledsaget av høye produksjonskostnader, noe som har ført til interesse for å bruke alternative metoder for genlevering. Elektroporering er en elektrofysisk, ikke-viral tilnærming for intracellulær levering av gener og andre eksogene materialer. Ved påføring av et elektrisk felt tillater cellemembranen midlertidig molekylær levering inn i cellen. Vanligvis utføres elektroporering på makroskala for å behandle et stort antall celler. Denne tilnærmingen krever imidlertid omfattende empirisk protokollutvikling, noe som er kostbart når man arbeider med primære og vanskelige å transfekte celletyper. Langvarig protokollutvikling, kombinert med kravet om store spenninger for å oppnå tilstrekkelige elektriske feltstyrker for å gjennomsyre cellene, har ført til utvikling av mikroskala elektroporeringsenheter. Disse mikroelektroporeringsenhetene er produsert ved hjelp av vanlige mikrofabrikasjonsteknikker og gir mulighet for større eksperimentell kontroll med potensial til å opprettholde høy gjennomstrømningskapasitet. Dette arbeidet bygger på en mikrofluidisk-elektroporeringsteknologi som er i stand til å oppdage nivået av cellemembranpermeabilisering på enkeltcellenivå under kontinuerlig strømning. Imidlertid ble denne teknologien begrenset til 4 celler behandlet per sekund, og dermed foreslås og presenteres en ny tilnærming for å øke systemgjennomstrømningen her. Denne nye teknikken, betegnet som cellepopulasjonsbasert tilbakemeldingskontroll, vurderer cellepermeabiliseringsresponsen på en rekke elektroporeringspulserende forhold og bestemmer de best egnede elektroporasjonspulsforholdene for celletypen som testes. Deretter brukes en høyere gjennomstrømningsmodus, hvor denne "optimale" pulsen påføres cellesuspensjonen under transport. Trinnene for å fremstille enheten, sette opp og kjøre mikrofluidiske eksperimenter og analysere resultatene presenteres i detalj. Til slutt demonstreres denne mikroelektroporeringsteknologien ved å levere en DNA-plasmidkoding for grønt fluorescerende protein (GFP) i HEK293-celler.

Nåværende terapeutiske innovasjoner innen biomedisinsk forskning, som CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) celleterapi og genetisk redigering ved hjelp av CRISPR (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repeterende DNA-sekvenser) / Cas9, er sterkt avhengig av evnen til å levere eksogent materiale både vellykket og effektivt inn i det intracellulære rommet¹. I CAR-T-terapi er gullstandarden for å utføre genleveringstrinnet i celleterapiproduksjon ved bruk av virale vektorer². Selv om virusmediert genlevering er en effektiv leveringsmodalitet, har den også flere ulemper. Disse inkluderer produks....

MERK: Brukere bør gå gjennom alle muskel- og skjelettlidelser for materialene og utstyret som brukes i denne protokollen. Egnet PPE skal brukes på hvert trinn og steril teknikk som brukes under eksperimentering. §§ 1-7 omhandler oppbyggingen av innretningen.

1. Enhetsfabrikasjon - Maskedesign

MERK: Se figur 2 for en illustrasjon av mikrofabrikasjonsprosessen. Mikrofabrikasjonstrinnene skal utføres i et renromsmiljø.......

Figur 4 fremhever driftsprinsippene bak deteksjon av enkeltcellemembranpermeabilisering for en enkelt pulsamplitude. Etter initiering av elektroporeringseksperimentet bestemmer celledeteksjonsalgoritmen en optimal terskel for celledeteksjon via en punkt-for-punkt, skråningsbasert deteksjonsmetode. Systemet overvåker deretter kontinuerlig (1) for en signifikant negativ endring i den målte elektriske strømmen, noe som indikerer inngangen til en celle. Dette skyldes den biologiske cellememb.......

Metodikken som presenteres i denne protokollen fokuserer primært på mikrofabrikasjon av en mikrofluidisk enhet som deretter integreres i et spesialisert elektroporeringseksperimentelt oppsett. Begrepet "oppskrift", som ofte brukes når man beskriver detaljene i mikrofabrikasjonsprosessen, antyder viktigheten av å følge / optimalisere hvert trinn for å kunne fremstille en fungerende enhet. Imidlertid kan visse kritiske trinn i prosessen, når de ikke er optimalisert, for eksempel UV-eksponeringstid / energi, PVD-sput.......

Forfatterne ønsker å anerkjenne økonomisk støtte fra National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) og US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) for finansiering av kandidatstudent JJS på fellesskap.