Ex Vivo Perfusión hepática a través de la vena porta en el ratón

Resumen

El protocolo describe un método sencillo de resección de un hígado de ratón intacto para estudios metabólicos a través de la perfusión de la vena porta.

Resumen

Las enfermedades metabólicas como la diabetes, la prediabetes, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) son cada vez más comunes. Las perfusiones hepáticas ex vivo permiten un análisis exhaustivo del metabolismo hepático mediante resonancia magnética nuclear (RMN), en condiciones nutricionales que pueden ser rigurosamente controladas. Como las simulaciones in silico siguen siendo un medio principalmente teórico para evaluar las acciones hormonales y los efectos de la intervención farmacéutica, el hígado perfundido sigue siendo uno de los bancos de pruebas más valiosos para comprender el metabolismo hepático. Como estos estudios guían los conocimientos básicos sobre la fisiología hepática, los resultados deben ser precisos y reproducibles. El mayor factor en la reproducibilidad de la perfusión hepática ex vivo es la calidad de la cirugía. Por lo tanto, hemos introducido un método organizado y simplificado para realizar perfusiones hepáticas de ratón ex vivo en el contexto de experimentos de RMN in situ . También describimos una aplicación única y discutimos los problemas comunes encontrados en estos estudios. El propósito general es proporcionar una guía sencilla para una técnica que hemos refinado durante varios años que consideramos el estándar de oro para obtener resultados reproducibles en resecciones hepáticas y perfusiones en el contexto de experimentos de RMN in situ . La distancia al centro del campo para el imán, así como la inaccesibilidad del tejido a la intervención durante el experimento de RMN hace que nuestros métodos sean novedosos.

Introducción

Las perfusiones ex vivo son cruciales en el estudio del metabolismo hepático, y la perfusión a través de la vena porta es el estándar para estos estudios. Para estudiar el metabolismo hepático de forma aislada, el hígado debe ser resecado del cuerpo para evitar complicaciones derivadas del metabolismo en otros órganos (es decir, el metabolismo de todo el cuerpo) y para ejercer control sobre la disponibilidad hormonal (insulina, glucagón, etc.). Este enfoque puede ser esencial para comprender los efectos de enfermedades como la diabetes, la EHGNA y la EHNA en el metabolismo hepático, así como los mecanismos de acción de los medicamentos. Este artículo sirve como guía para la resección hepática y la perfusión. Hemos desarrollado un procedimiento simplificado para realizar estos estudios hepáticos metabólicos con suficiente rigor y reproducibilidad. Si la cirugía no se realiza correctamente, existe una pronunciada variabilidad en los datos metabólicos obtenidos. Describimos un método organizado para realizar cateterismo de vena porta y resección hepática en el contexto de estudios metabólicos in situ en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN), tal y como se describe en la literatura 1,2,3,4,5.

Actualmente, no hay literatura que describa una perfusión hepática ex vivo utilizando una columna de vidrio dentro de una RMN. Tampoco hay una publicación de video o texto que proporcione un ejemplo claro de cómo realizar el procedimiento con el hígado de ratón, específicamente, demostrando cómo cateterizar la vena porta, resecar un hígado, transferir y colgar el hígado en una columna de vidrio. Como el ratón modificado genéticamente se utiliza ubicuamente para estudiar el metabolismo hepático, este es un procedimiento esencial que merece una descripción completa. Las cirugías de perfusión hepática no son nuevas, pero este artículo es un método estándar de oro acompañado de un video que demuestra la excelencia técnica descrita en este documento para ayudar a todos los interesados en este procedimiento. El método presentado aquí se aplicaría mejor al metabolismo en tiempo real para detectar la función y la rotación de metabolitos en modelos de enfermedades.

Este método utiliza una columna de vidrio con camisa de agua de 100 cm, que permite que el hígado cuelgue en la parte inferior de la cánula encapsulada por perfusato dentro de un tubo de RMN. El agua caliente en la camisa de vidrio se utiliza para controlar la temperatura de perfusión. Un oxigenador de capa delgada se presuriza con 95% / 5% O₂ / CO₂ para el control del pH. Mediante el uso de tres bombas separadas, se establece la altura de la columna de perfusato, lo que proporciona una presión constante al hígado. Los caudales no se controlan más allá de la aplicación de presión constante (Figura 1). Para confirmar que el hígado está funcionando adecuadamente, se toman mediciones de oxígeno junto con las tasas de flujo. En nuestras manos, este conjunto de condiciones previas conduce a experimentos de RMN altamente repetibles para la evaluación de la función metabólica hepática.

Protocolo

Los experimentos con ratones se manejaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida (número de protocolo # 201909320). La cepa de ratón utilizada fue C57BL/6J; todos los ratones eran machos. Este método es generalmente aplicable para estudios que utilizan otras cepas de ratón estándar también. Esta cirugía es realizada de manera óptima por dos individuos que trabajan juntos.

1. Configuración inicial

1. Hígados perfusos con perfusato que contienen electrolitos de Krebs-Henseleit⁶ (25 mM NaHCO₃, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM cada uno de MgSO₄, KH₂PO₄ y 0.5 mM sodio-EDTA, 1.25 mM CaCl₂), lactato de sodio de 6 mM, piruvato de sodio de 0.6 mM, propionato de sodio de 0.2 mM [^U-13C], 10% (v / v) D₂O, y 0,63 mM de ácidos grasos mixtos (que contienen ácido palmítico (22,1% del total), ácido palmitoleico (5,2%), ácido esteárico (2,7%), ácido oleico (27%), ácido linoleico (37,7%), ácido γ-linolénico (2,4%) y ácido decosahexanoico (2,8%)) junto con albúmina sérica bovina al 2% (p/v). Ajuste el pH final del perfusato a 7.3 usando HCl (y NaOH, si es necesario).

2. Configuración previa a la cirugía

1. Ensamble dos jeringas de 1 ml con una aguja 23G de 19,05 mm de largo. Llene una jeringa con 0,01 ml de 1000 unidades/ml de heparina y 0,19 ml de solución salina (0,9% (p/v) de NaCl en agua; Tabla 1).
2. Llene la segunda jeringa con 0,2 ml de lidocaína al 2% y 0,6 ml de solución salina al 0,9 % (Tabla 1). En otra jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G de 38,1 mm, llenar con el perfusato y mantener a 37 °C.

3. Configuración de la columna de perfusato

1. Coloque la botella de vidrio que contiene 500 ml de perfusato en el baño de agua (Figura 1B). Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura a ~ 42 ° C. La temperatura más alta en el baño de agua permite mantener 37 °C en la columna de perfusión.
2. Una vez que el agua se caliente hasta 42 °C, encienda las dos bombas para hacer circular el perfusato de la botella a través del oxigenador de película delgada y la columna de vidrio de 100 cm con camisa de agua (Figura 1A-E).
3. Encienda el gas oxigenante (95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono) para presurizar el^{oxigenador 7} (Figura 1C). Ajuste la altura de la columna de perfusato para lograr un caudal de 8 ml/min con el catéter conectado (consulte el paso 9 para la medición del caudal)^5,8,9.
   NOTA: La tasa de flujo se refiere a la velocidad a la que el perfusato está siendo expulsado por el hígado.

4. Anestesia del ratón

1. Póngase EPP según lo exija el protocolo IACUC y otras pautas de seguridad apropiadas.
   NOTA: Los siguientes pasos se han optimizado para ratones de 9 a 13 semanas de edad.
2. Coloque el ratón en la cámara de isoflurano. Gire el gas de suministro a 100% de oxígeno, un caudal de 1 L/min, y el isoflurano a 2%¹⁰. Espere hasta que la respiración disminuya y sea constante.
   NOTA: Para que el ratón alcance un plano quirúrgico estable, como lo demuestra una frecuencia respiratoria lenta y constante y la falta de reflejo de pellizco en el dedo del pie, la tasa de flujo de oxígeno se puede ajustar a ~ 1.5 L / min a ~ 3 L / min y la concentración de isoflurano de 1 a 3%. La tasa de entrega de gas portador y concentración de isoflurano depende de la edad y el peso del animal y de factores como el ruido y la luz.
3. Desinfectar el abdomen con alcohol al 70%. Administrar heparina mediante una inyección subcutánea profunda en la capa de grasa abdominal (Figura 2). Coloque el ratón de nuevo en la cámara de anestesia durante 10 minutos.
   NOTA: No se requiere afeitado ya que este procedimiento es terminal.

5. Celiotomía

1. Transfiera el ratón de la cámara de anestesia a la plataforma de cirugía y colóquelo en posición supina (Figura 3).
2. Coloque la nariz del ratón en un cono nasal y pegue las patas con cinta adhesiva. Tenga cuidado de no aplicar ninguna tensión en el cuello que pueda provocar asfixia.
3. Administrar lidocaína mediante inyección subcutánea bilateralmente en la región¹¹ de la cresta ilíaca anterior (Figura 3). Realice una prueba de pellizco del dedo del pie para confirmar la ausencia de todos los reflejos de dolor.
4. Realizar celiotomía para exponer los órganos internos (Figura 4). Haga una incisión de 3 cm de ancho (el ancho de todo el abdomen del ratón).
   NOTA: El ancho cambiará con la edad y la dieta del ratón.
5. Expanda la incisión usando un hemostático que tire de la tracción sujetando el proceso xifoide (Figura 4).

6. Canulación de la vena porta

1. Use un aplicador con punta de algodón para limpiar los intestinos delgado y grueso que cubren la vena porta. Coloque una sutura de seda debajo del arco de la vena porta proximal al hígado (Figura 4A).
2. Dependiendo de la estructura anatómica, colocar la segunda sutura de seda proximal o distal de la vena mesentérica inferior distal del hígado (Figura 4A)^12,13. Use una sutura 2-0 para ambas suturas.
3. Una vez que las suturas estén en su lugar, cannulate la vena porta con un catéter 22G¹⁴ (Figura 4B). Al insertar el catéter, mantenga el bisel apuntado hacia arriba. Ingrese a la vena porta en un ángulo de no más de 15 °.
4. Ate la primera sutura más allá del interventor del catéter. Después de canular la vena porta, anclar el catéter distal de 2-3 mm desde la rama de la vena porta con la sutura de seda (Figura 4B).
   NOTA: El asistente debe rodar los hombros y las muñecas para evitar el desalojo del catéter o el desgarro de la vena porta. Cada sutura requiere dos nudos.
5. A continuación, asegure la parte inferior del catéter con la segunda sutura. Con la ayuda del asistente quirúrgico, ate un nudo con la sutura para asegurar el catéter a la porción distal de la vena porta y el tejido circundante.

7. Resección del hígado después de la canulación de la vena porta

1. Después de asegurar el catéter, inserte una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G de 38,1 mm de largo en el catéter para eliminar las burbujas de sangre y aire.
   NOTA: Por lo general, hay un reflujo de sangre fuera del catéter debido a la presión.
2. Utilice un tubo de silicona I.D. x 5 mm O.D. de 1 mm con una llave de paso fija para acoplar la columna de perfusión (Figura 1A) al catéter permitiendo el flujo del tampón hacia el hígado marcando el inicio de la perfusión. Inicie un temporizador en este punto para marcar el inicio de la perfusión.
3. Alivie el aumento de la presión vascular haciendo una incisión, usando tijeras, en la vena cava inferior.
4. Confirme el flujo de perfusato a través del hígado observando el cambio homogéneo en el color del hígado de rosa / rojo a un amarillo pálido. Una vez que se confirma el flujo, extirpe el estómago, el intestino delgado, el intestino grueso y el riñón derecho del tejido circundante.
5. Con la ayuda del asistente quirúrgico, maniobre el hígado alrededor de la cavidad abdominal y torácica mientras el cirujano corta a través del peritoneo parietal y el tejido torácico para resecar el hígado.
6. Por último, levante el hígado hacia arriba y corte los tejidos conectivos restantes que mantienen el hígado en su lugar con tijeras. Manipule lentamente el hígado para facilitar la vista. Retire cualquier pelaje que se adhiera al hígado enjuagando con perfusato antes de encapsularlo dentro del tubo de RMN.
   NOTA: En este procedimiento, solo se extirpa el hígado. Todos los demás órganos quedan en el cuerpo del animal. El conducto biliar se puede extirpar según el protocolo del experimento. Aunque para este experimento, se dejó en su lugar.

8. Colgar el hígado de la columna

1. Una vez que el cirujano entrega el hígado y el tubo al asistente, el asistente desconecta el tubo del catéter y la columna.
2. Llene el catéter con perfusato hasta que se forme un menisco en la parte superior del catéter. Conecte el catéter a la columna para que el hígado cuelgue y se perfunda.
   NOTA: La perla de perfusato en el catéter proporciona suficiente volumen para que el hígado funcione hasta que se conecte. El catéter conectado al hígado se coloca con presión en la parte inferior de la columna.
3. Atornille un tubo de RMN de 20 mm sobre la columna de vidrio de 100 cm para encapsular el hígado (Figura 5). Para evitar la torsión del hígado y la vena porta, atornille lentamente el tubo de RMN. Si se produce torsión y se detiene el flujo, desenrosque y vuelva a enroscar el tubo de RMN. Esto remediará la oclusión y el flujo regresará.
4. Perfundir el hígado durante 30-60 minutos según los detalles del estudio.
   NOTA: El tiempo se basa en el experimento de perfusión. Para este experimento, se midió el recambio metabólico dentro de los 30 min. La perfusión hepática puede tardar hasta 10 minutos en alcanzar un estado estacionario. El tiempo hasta el estado estacionario comienza una vez que se ha cortado la vena cava inferior y se ha establecido el flujo hepático.

9. Medición de flujo

1. Coloque un bote de pesaje en una balanza de carga superior y ponga a cero la balanza. Coloque el tubo de la bomba de rodillos que extrae perfusato eferente de la RMN en el bote de pesaje y encienda el temporizador.
2. Pesar la masa de líquido acumulada durante 1 min que produce el caudal del hígado. Vuelva a colocar el tubo en el contenedor de residuos/recogida.

10. Medición de oxígeno

NOTA: Las mediciones del medidor de oxígeno se configuraron de acuerdo con las instrucciones del fabricante¹⁵.

1. Coloque el electrodo que contiene 20 μL de solución saturada de KCl al 50% en la cúpula de platino y coloque cinco gotas de 10 μL alrededor del anillo de platino inferior del electrodo.
2. Retire el adhesivo del papel de fumar. Coloque un trozo de membrana de politetrafluoroetileno sobre el papel de cigarrillo.
3. Coloque las dos piezas encima del electrodo. Coloque una pequeña junta tórica alrededor de la parte superior del electrodo. Recorte el papel para colocarlo plano sobre el anillo de platino inferior del electrodo.
   NOTA: Algunos voladizos son aceptables. Es esencial cubrir la plata del electrodo.
4. Coloque la junta tórica más grande en el electrodo. Acople el electrodo a la cámara de agua y apriete la base para mantener el electrodo en su lugar. Encienda el baño de agua y deje calentar hasta 37 °C.
5. Abra el software del medidor de oxígeno. Haga clic en Calibrar > agua saturada de aire. Ajuste la velocidad del agitador a 75 y la temperatura a 37 °C.
6. Llene un vial de 50 ml hasta la mitad con agua y agite vigorosamente durante 2 min. Esta es agua saturada de aire, úsela como 100% estándar. Llene la cámara del medidor de oxígeno con ~ 2 ml de agua y coloque el tapón de dos piezas.
7. Haga clic en Aceptar en la pantalla y permita que la señal se estabilice. Una vez que la señal haya alcanzado una meseta, haga clic en Aceptar. Deseche el líquido en la cámara y séquelo con papel de seda.
8. Repita los pasos 10.6-10.7 pero con 200 mM de sulfito de sodio (0% estándar). Haga clic en Guardar calibración.
   NOTA: No se necesita agitación vigorosa para el estándar de 0%.
9. Durante la perfusión, use dos jeringas de 5 ml. Una jeringa para perfusato circulante (entrada de oxígeno) y la segunda para perfusato eferente del tubo de RMN (salida de oxígeno).
10. Al elaborar perfusato para mediciones de entrada y salida, dibuje 3-4 ml cada vez.
    NOTA: Esta columna tiene tubos de vidrio para permitir el acceso al tubo de RMN para extraer el perfusato que ha fluido a través del hígado.
11. Mida el perfusato circulante, primero como agua en el paso 10.6 y deséchelo en el paso 10.7. Repita los mismos pasos para el perfusato eferente.
12. Realice mediciones de oxígeno cada 10 min.

Resultados

La función hepática se evalúa principalmente por el consumo de oxígeno y la tasa de flujo. Un caudal de 4-8 mL/min y un consumo de oxígeno de 1 μmol/min.g es típico. Estas medidas variarán dependiendo de las condiciones experimentales específicas y las diferencias biológicas.

La cantidad exacta de isoflurano utilizada dependerá del tipo de sistema de anestesia que se utilice, así como del entorno y la edad / peso del ratón. Durante la cirugía, el isoflurano y el gas de administra...

Discusión

Este procedimiento quirúrgico es desafiante y requiere una práctica extensa para lograr resultados reproducibles. El isoflurano y el gas portador deben ajustarse según sea necesario para mantener la viabilidad del animal a través de la mayor cantidad posible del procedimiento quirúrgico. El medio ambiente, la hora del día, la edad, el peso y varios otros factores afectarán la anestesia. El peso, la dieta, la cepa de ratones y la edad podrían afectar la cirugía, ya que la acumulación de grasa puede interferir co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand