Cultivo de organoides del cáncer de vejiga como herramientas de medicina de precisión

Resumen

Los organoides derivados del paciente (DOP) son una herramienta poderosa en la investigación traslacional del cáncer, que refleja tanto la heterogeneidad genética y fenotípica de la enfermedad como la respuesta a las terapias personalizadas contra el cáncer. Aquí, se detalla un protocolo consolidado para generar DOP de cáncer de vejiga primario humano en preparación para la evaluación de análisis fenotípicos y respuestas a medicamentos.

Resumen

Las plataformas actuales de pruebas terapéuticas in vitro carecen de relevancia para la fisiopatología tumoral, generalmente empleando líneas celulares de cáncer establecidas como cultivos bidimensionales (2D) en plástico de cultivo de tejidos. Existe una necesidad crítica de modelos más representativos de la complejidad tumoral que puedan predecir con precisión la respuesta terapéutica y la sensibilidad. El desarrollo del cultivo tridimensional (3D) ex vivo de organoides derivados de pacientes (PDO), derivados de tejidos tumorales frescos, tiene como objetivo abordar estas deficiencias. Los cultivos de organoides se pueden utilizar como sustitutos tumorales en paralelo al tratamiento clínico de rutina para informar las decisiones terapéuticas mediante la identificación de posibles intervenciones efectivas e indicando terapias que pueden ser inútiles. Aquí, este procedimiento tiene como objetivo describir estrategias y un protocolo detallado paso a paso para establecer PDO de cáncer de vejiga a partir de tejido clínico fresco y viable. Nuestros protocolos bien establecidos y optimizados son prácticos para configurar cultivos 3D para experimentos utilizando material de partida limitado y diverso directamente de pacientes o material tumoral de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Este procedimiento también puede ser empleado por la mayoría de los laboratorios equipados con equipos estándar de cultivo de tejidos. Los organoides generados utilizando este protocolo se pueden utilizar como sustitutos ex vivo para comprender tanto los mecanismos moleculares que sustentan la patología urológica del cáncer como para evaluar los tratamientos para informar el manejo clínico.

Introducción

El cáncer de vejiga es el cáncer del tracto urinario más prevalente y la décima neoplasia maligna humana más común en todo el mundo¹. Abarca un espectro de enfermedad genéticamente diverso y fenotípicamente complejo². Las formas uroteliales no invasivas musculares de cáncer de vejiga (NMIBC) son los diagnósticos de cáncer de vejiga más comunes (70%-80%), y estos cánceres muestran una heterogeneidad biológica considerable y resultados clínicos variables ^2,3,4. Los pacientes con NMIBC generalmente experimentan un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad (50-70%) y un tercio de los cánceres progresarán y se convertirán en cáncer de vejiga invasivo muscular (MIBC) significativamente más ^agresivo.2. Aunque las tasas de supervivencia a 5 años para NMIBC son altas (>90%), estos pacientes deben someterse a un tratamiento clínico a largo plazo⁵. Por otro lado, el MIBC localmente avanzado (irresecable) o metastásico generalmente se considera incurable⁶. En consecuencia, el cáncer de vejiga tiene uno de los costos de tratamiento de por vida más altos dentro de la atención del cáncer y es una carga significativa tanto para el individuo como para el sistema de salud ^3,7. Las aberraciones genéticas subyacentes en la enfermedad avanzada hacen que el manejo terapéutico del cáncer de vejiga sea un desafío clínico, y las opciones terapéuticas para los tumores uroteliales invasivos solo han mejorado recientemente desde la aprobación de inmunoterapias para NMIBC avanzado y de alto riesgo ^8,9. Actualmente, la toma de decisiones clínicas se ha guiado por características clínicas e histopatológicas convencionales, a pesar de que los tumores individuales de cáncer de vejiga muestran grandes diferencias en la agresividad de la enfermedad y la respuesta a la terapia¹⁰. Existe una necesidad urgente de acelerar la investigación de modelos clínicamente útiles para mejorar la predicción del pronóstico individual del paciente y la identificación de tratamientos efectivos.

Los organoides tridimensionales (3D) muestran un gran potencial como modelos tumorales debido a su capacidad para autoorganizarse y recapitular la arquitectura in vivo intrínseca y el perfil farmacogenómico del tumor original, y su capacidad para reflejar la funcionalidad celular nativa del tejido original del que se derivaron 11,12,13 . Aunque las líneas celulares de cáncer de vejiga establecidas están fácilmente disponibles, son relativamente rentables, escalables y fáciles de manipular, las líneas celulares in vitro en gran medida no logran imitar el espectro de diversas alteraciones genéticas y epigenéticas observadas en los cánceres clínicos de vejiga^12,14 y todas se establecieron y mantuvieron bajo condiciones de cultivo adherentes 2D. Además, las líneas celulares derivadas de tumores de vejiga primarios y metastásicos albergan una divergencia genética significativa del material tumoral original. ^8,15.

Un enfoque alternativo es utilizar modelos de ratón genéticamente modificados e inducidos por carcinógenos. Sin embargo, si bien estos modelos recapitulan algunas de las cascadas oncogénicas naturales involucradas en la neoplasia humana (revisadas en refs 16,17,18), carecen de heterogeneidad tumoral, son costosas, representan mal el cáncer de vejiga invasivo y metastásico, y no son viables para las pruebas de drogas a término rápido, ya que los tumores pueden tardar muchos meses en desarrollarse ^14,19 . Los modelos de cáncer derivados de pacientes (incluidos los organoides, el cultivo celular primario reprogramado condicionalmente y los xenoinjertos) brindan oportunidades invaluables para comprender los efectos del tratamiento farmacológico antes del tratamiento clínico²⁰. A pesar de esto, pocos grupos utilizan rutinariamente estos modelos proximales del paciente debido al acceso limitado al tejido primario fresco del paciente y la amplia optimización requerida para generar de manera reproducible condiciones de cultivo de organoides derivados del paciente (DOP). En un entorno in vivo, las células oncogénicas pueden interactuar y comunicarse con varias composiciones de los constituyentes circundantes, incluidas las células estromales, las células inmunes infiltrantes de tejido y la matriz¹². Del mismo modo, para las DOP cultivadas en formato 3D, la complejidad celular / matriz se puede personalizar para incluir otros componentes relevantes. Los DOP se pueden generar rápidamente y, a menudo, se pueden pasar extensamente o criopreservar para su uso posterior, a pesar de tener una vida útil finita 21,22,23. La farmacodinámica (es decir, la respuesta a un fármaco) se puede evaluar mediante múltiples lecturas, incluida la viabilidad y morfología de los organoides, y la caracterización de objetivos inmunohistoquímicos o cambios transcripcionales.

Aquí, se describen los procedimientos para el establecimiento de organoides de cáncer de vejiga a partir de material de paciente recolectado de la resección transuretral del tumor de vejiga (TURBT) o la extirpación quirúrgica de la vejiga (cistectomía radical). El método para generar DOP está ilustrado, utilizando materiales y herramientas de laboratorio húmedos fácilmente disponibles. Los criterios de valoración incluyen cambios en las características morfológicas celulares y la viabilidad. Estos se midieron mediante microscopía de fluorescencia, ensayos de viabilidad in vitro (integridad metabólica y de la membrana celular) y análisis histopatológicos. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para establecer las PDO de cáncer de vejiga humana a partir del material clínico obtenido durante la cirugía electiva.

Protocolo

Los pacientes han dado su consentimiento para este estudio después de su ingreso bajo el equipo de Urología en el Hospital Princess Alexandra, Brisbane, Australia. Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y dentro de las directrices éticas e institucionales (número de ética HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).

NOTA: Como criterios de elegibilidad, los pacientes tenían ≥ 18 años con cáncer y eran capaces de comprender y dar su consentimiento. Aquellos que no pudieron dar su consentimiento informado fueron excluidos. Se excluyeron los que tenían un idioma primario distinto del inglés, ya que no era posible proporcionar intérpretes debido a consideraciones logísticas y presupuestarias. También se excluyeron los pacientes cuyos tumores no eran accesibles a la biopsia o que era poco probable que estuvieran disponibles en cantidad adecuada después de la patología de rutina.

1. Preparación del medio organoide

NOTA: El medio organoide para el cáncer de vejiga humana requiere factores de crecimiento que ayuden en la supervivencia, el crecimiento y la expansión continua de los organoides derivados del material clínico disociado (Tabla 1). Para obtener detalles completos de cada suplemento utilizado en este procedimiento, consulte la Tabla de materiales.

1. Descongele los ingredientes congelados en hielo o en un refrigerador a 2-8 °C. Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación y trabaje a partir de alícuotas congeladas (almacenadas a -20 °C).
2. Medio basal: Prepare el medio basal complementando el F-12 (adDMEM/F12) de Modified Eagle Medium/Ham de Dulbecco avanzado con HEPES (10 mM) y glutamina (2 mM). Esto también se utiliza como medio de transporte y durante los pasos de lavado de organoides.
   NOTA: DMEM / F-12 avanzado se utiliza como medio basal para ayudar en la expansión de organoides en presencia de suero limitado; sin embargo, requiere suplementación con HEPES y L-glutamina.
3. Centrifugar brevemente el factor de crecimiento de fibroblastos 10 (FGF-10), el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), el factor de crecimiento epitelial (EGF), SB202190, la prostaglandina E2 (PGE2) y A 83-01 antes de abrirlos para garantizar que los componentes estén en la parte inferior del vial.
4. Medio organoide completo: Complementar el medio basal con medios condicionados por noggin- y R-spondin 1 humanos a una concentración final de 5% v/v, EGF humano (50 ng/mL), FGF-2 humano (5 ng/mL), FGF-10 humano (20 ng/mL), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nicotinamida (10 mM), N-acetilcisteína (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) y una formación antibiótica de amplio espectro a la concentración indicada por el fabricante.
5. Guarde los medios organoides a 4 °C en la oscuridad y úselos dentro de las 2 semanas (1 mes como máximo). No congelar. Evite la exposición prolongada a fuentes de luz.
   NOTA: El medio organoide se prepara sin suero; sin embargo, el suero y la penicilina/estreptomicina podrían complementarse de usuario a usuario según sea necesario.

2. Un día antes del procedimiento descrito en 3

1. Descongelar la membrana basal reducida del factor de crecimiento (BME; ver Tabla de materiales) durante la noche durante al menos 12 h antes de su uso en un refrigerador o cámara frigorífica a 4 °C. Si es necesario, dispense BME en alícuotas de 1 ml en un tubo de un solo uso de polipropileno de 1,5 ml para evitar ciclos de congelación-descongelación.
2. Coloque las puntas de pipeta filtradas en un refrigerador o cámara frigorífica a 4 °C.
   NOTA: Esta sección se refiere a las puntas de pipeta que se utilizarán al manipular BME para evitar la polimerización prematura y reducir el recubrimiento de BME en la superficie de las puntas.
3. Esterilizar todo el equipo quirúrgico necesario para el procedimiento.

3. Generación de organoides tumorales de vejiga

NOTA: Este es un paso inicial para el establecimiento de DOP a partir de tumores de pacientes primarios. Este procedimiento está adaptado para los tejidos del cáncer de vejiga a partir de métodos establecidos por Gao et ^al.24.

1. Utilice una campana de riesgo biológico de clase II para preparar el espécimen. Recupere hielo seco y húmedo e imprima la hoja de procesamiento de muestras de paciente (archivo suplementario).
2. Llame al personal de investigación a la sala de operaciones cuando la resección quirúrgica esté casi completa.
   NOTA: Confirme que el paciente cumple con los criterios de elegibilidad y ha firmado el formulario de consentimiento del participante. El tejido se proporciona para la investigación solo si excede los requisitos para la evaluación histopatológica clínica.
3. Recolectar una muestra de tumor fresca macroscópicamente viable de la cirugía. Asegúrese de que la muestra esté sumergida en el medio de transporte (ya sea 1x adDMEM/F12 o 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco) en un tubo cónico estéril de 50 ml o en un frasco de muestra de orina durante el tránsito.
   NOTA: En algunos centros clínicos, el tejido puede necesitar ser transportado a un laboratorio de patología para ser asignado a la investigación. En estas circunstancias, se recomienda que se agreguen antibióticos y antimicóticos al medio de transporte. El tejido se puede almacenar a 4 °C en medio basal durante un máximo de 24 h después de la cirugía y aún así generar cultivos organoides viables.
4. Registre los detalles de la muestra, incluido el peso del tejido (g o mg), la descripción de la muestra y los detalles sobre cualquier muestra de sangre y orina en la Hoja de procesamiento de muestras del paciente (Archivo suplementario).
5. Retire con cuidado el medio de transporte y reemplácelo con 10 ml de medios basales. Permita que el tejido tumoral se asiente por gravedad.
   NOTA: El medio de transporte se considera como residuo clínico y debe recogerse en un contenedor de residuos debidamente etiquetado en una cantidad adecuada de solución de descontaminación. Una vez que el líquido ha sido descontaminado químicamente, se puede eliminar de acuerdo con las pautas institucionales para residuos peligrosos.
6. Extraer el tejido tumoral con fórceps y colocarlo en una placa de Petri estéril de 90 mm (Figura 2A). Registre el peso del tejido en mg o g en la hoja de procesamiento de muestras clínicas y en la rejilla de disección (Figura 2B).
7. Extraiga el tejido no canceroso (incluido el tejido adiposo) y las regiones necróticas macroscópicamente visibles utilizando pinzas estériles y una cuchilla de bisturí desechable montada en el mango del bisturí (Figura 2C). Lave las piezas del tumor 1-2 veces con 1x DPBS frío. Recoger las piezas tumorales y transferirlas a una nueva placa de Petri estéril de 90 mm.
   NOTA: Como las cuchillas de bisturí son afiladas, tenga cuidado al cortar manualmente. El tejido adiposo adyacente al tumor se puede identificar por áreas claramente blandas, gelatinosas y pálidas inmediatamente adyacentes al perímetro visual del tumor. El tejido adiposo macroscópico y las regiones focalmente oscuras que representan áreas de necrosis requerirán un juicio personal al diseccionar de una biopsia de tumor de vejiga por escisión.
8. Tome una fotografía, dibuje un diagrama de tejido y planifique la disección de tejidos en una cuadrícula de procesamiento clínico (Figura 2B y Figura 2C).
   NOTA: Es importante mantener un registro visual y un bosquejo aproximado de las características individuales del tumor macroscópico y la disección para cada caso específico.
9. Diseccionar piezas de tejido tumoral y asignarlas para análisis histopatológicos (Figura 2D) y moleculares (Figura 2E).
   1. Para análisis histológicos: Coloque aproximadamente 50 mg de tejido tumoral en un casete de histología plástico desechable etiquetado (Figura 2D). Sumerja el casete histológico en un recipiente con un volumen de 5x a 10x de formalina tamponada neutra (NBF) al 10%. Incubar durante la noche en RT.
   2. Retire el 10% de NBF y reemplácelo con etanol al 70% (p/p) al día siguiente para almacenarlo a 4 °C hasta que el tejido pueda procesarse utilizando el protocolo de procesamiento de tejidos de rutina
   3. Para análisis moleculares: Congelar al menos una pieza tumoral de^{1-3 mm 3} en un criovial de 1,5 ml libre de RNasa/DNasa utilizando nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C (Figura 2E).
10. Dispensar 5 ml de medio organoide (Tabla 1) en la placa de Petri de 90 mm que contiene la(s) pieza(s) tumoral(es) restante(s).
11. Picar mecánicamente el tejido lo más finamente posible (0.5-1 mm³ piezas o menos) con una hoja de bisturí estéril # 10.
    NOTA: Los fragmentos más grandes o trozos enteros de tejido (>3 mm³) tardarán considerablemente más en digerirse y disminuirán la viabilidad de la muestra. Omita el paso anterior si el tejido está desagregado y los fragmentos son lo suficientemente pequeños como para pipetear con una punta de pipeta serológica de 5 ml.
12. Transfiera el tejido finamente picado a un tubo cónico de 50 ml y agregue 4 ml de medio organoide, 1 ml de 10x colagenasa/hialuronidasa y 0,1 mg/ml de desoxirribonucleasa 1 (DNasa 1) para evitar la aglomeración celular.
    NOTA: La solución enzimática debe estar recién preparada cada vez. Aumente el volumen del medio para que sea aproximadamente 10 veces la cantidad visible de fragmentos tumorales para muestras grandes.
13. Incubar el tejido tumoral picado y la solución enzimática durante 1-2 h en un agitador o rotador orbitario (150 rpm) en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) para disociar fragmentos en una suspensión celular y descomponer los colágenos. Esto se puede comprobar con análisis histológicos (Figura 3A).
    NOTA: Si la cantidad de tejido es grande o no se observa una disociación obvia después de 1-1.5 h, aumente el tiempo de incubación verificando el nivel de disociación cada 30 min. El momento para este paso depende de la muestra y debe determinarse empíricamente cada vez. Una solución notablemente más clara con fragmentos de tejido indiscernibles para el ojo (o muy pocos fragmentos) indica una digestión exitosa.
14. Terminar la digestión con la adición de 2x volumen (20 mL) de medio basal a la muestra.
15. Centrifugar la muestra a 261 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT), aspirar y desechar el sobrenadante.
16. Para lisar los glóbulos rojos contaminantes (glóbulos rojos), resusped el gránulo obtenido del paso anterior en 5 ml de tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK). Incubar el tubo en RT durante 3 min o hasta que se vea la lisis completa de los glóbulos rojos (la suspensión se vuelve clara).
    NOTA: Si los glóbulos rojos no se observan como un pequeño grupo rojo en el pellet, este paso puede omitirse.
17. Agregue 20 ml del medio basal en el tubo. Centrifugar el tubo a 261 x g durante 5 min en RT y aspirar el sobrenadante.
18. En este paso, coloque una alícuota de 10 ml de medio organoide 2x y 1x en un baño de agua a 37 ° C para calentar.
19. Filtre la muestra a través de un colador reversible prehúmedo de 100 μm en un nuevo tubo de 50 ml para eliminar el material insoluble grande.
    NOTA: El material grande no digerido (>100 μm) recogido por el filtro puede contener células de interés y puede cultivarse en placa de Petri de 90 mm o placa de cultivo celular de 6 pocillos en medio organoide para derivar cultivos 2D (Figura 1 (paso 5) y Figura 3B).
20. Filtrar el eluido a través de un colador reversible pre-húmedo de 37 μm para recolectar células individuales y pequeños grupos para el aislamiento de células individuales e inmunes (Tubo 37-1; Figura 1 (paso 6) y Figura 3B).
    NOTA: El rendimiento de las células tumorales durante este paso puede aumentar al pasar la suspensión de células filtradas a través del colador nuevamente.
21. Invertir el colador de 37 μm y utilizar 10 ml de medios basales para recoger racimos pequeños y de tamaño moderado (37-100 μm) (tubo 70-1; Figura 3B).
22. Recargue cada uno de los nuevos tubos de 50 ml (tubos 70-1 y 37-1) con DPBS a 40 ml. Centrifugar la suspensión a 261 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el sobrenadante.
23. Agregue 10 ml de medios basales al tubo 37-1 y cuente las células utilizando tinte de exclusión azul tripano y un contador de células automatizado (según las especificaciones del fabricante). Determinar el número de celdas y la viabilidad de las celdas.
24. Centrifugar el resto de la muestra a 261 x g durante 5 min a RT. Aspire el medio y reemplácelo con solución de congelación celular o medios basales que contengan 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
25. Coloque las muestras en crioviales de 1,5 ml y guárdelas en un recipiente de congelación celular. Transfiera inmediatamente el recipiente a un congelador de -80 °C para una velocidad óptima de enfriamiento. Después del almacenamiento durante la noche en el congelador a -80 ° C, transfiera los crioviales al almacenamiento criogénico en fase líquida o en fase aire (-196 ° C) para su almacenamiento a largo plazo.
26. Resuspend células del tubo 70-1 con 500 μL de medio organoide 2x precalentado.
    NOTA: La densidad de siembra debe ser alta para una propagación organoide exitosa. El volumen del medio organoide y, posteriormente, de la BME debe modificarse empíricamente en función del número de células aisladas de la etapa de filtración. Este paso proporciona un punto de partida relevante basado en estudios en nuestro laboratorio.
27. Agregue BME a las células (en una proporción de 1: 1 con 2x medio organoide) con puntas de pipeta de filtro estéril P1000 heladas y mezcle suavemente para suspender las células. Pipete rápida y cuidadosamente 100 μL de células reconstituidas / mezcla BME a los pocillos de una placa plana de fondo plano de 96 pocillos de fijación ultra baja. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante 20-30 min para solidificarse.
28. Agregue una proporción de 1: 2 de medio organoide 1x sobre la suspensión de células BME dependiendo del volumen evaluado empíricamente. En el punto de partida correspondiente, agregue 50 μL de 1x medio organoide sobre 100 μL de células reconstituidas / mezcla BME.
29. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante 20 minutos para equilibrar.
30. Saque la placa de cultivo celular de la incubadora y enséñela en un soporte de muestra en el escenario de un microscopio. Evalúe los organoides visualmente bajo contraste de fase o ajustes de campo brillante.
    NOTA: Las imágenes se adquieren mejor mediante un microscopio de contraste de fase invertido equipado con óptica de interferencia diferencial (DIC), cámara digital y software asociado para observar la formación de PDO esféricas en preparación para el análisis de punto final.
    1. Si se ven distintos grupos, coloque la placa de cultivo celular en una cámara de microscopio calentada electrónicamente en el escenario (37 ° C, 5% de CO₂) para obtener imágenes de células vivas durante las primeras 24-72 h.
    2. Asegúrese de que el collar calefactado flexible esté unido a la lente para reducir la deriva térmica y que el humidificador esté lleno de dH₂O.
    3. Realice la imagen inicial utilizando una lente de objetivo 4x o 10x (N.A. 0.30, W.D. 15.2 mm). Lapso de tiempo cada 5-10 minutos en la configuración de contraste de fase.
    4. Verifique el aislamiento exitoso caracterizado por la aparición de >10 organoides autoorganizados por pozo después de un período de 24-72 h.
    5. Permita que los cultivos continúen hasta por dos semanas si el número de organoides es bajo (Figura 3C).
31. Recargue el medio cada 2-3 días usando 50 μL de medio organoide precalentado para reponer los factores de crecimiento agotados y el volumen general.
32. Adquiera imágenes (como se describe en el paso 3.30) en los días 1, 2 y 3 (series de lapso de tiempo) y en los días 5, 7 y 10 antes de la transmisión (si corresponde).
    NOTA: Los organoides (observados como estructuras generalmente redondas donde no se pueden ver los bordes de las células individuales) generalmente se pasan de 7 a 10 días después de la configuración, dependiendo del éxito del aislamiento. Antes o después de la transmisión, los organoides pueden tratarse con citotóxicos o agentes terapéuticos durante un máximo de 6 días y la respuesta al fármaco se puede medir mediante ensayos de viabilidad celular y citotoxicidad. Alternativamente, los organoides pueden ser recuperados de BME (usando 1 mg/mL dispasa) y criopreservados (biobancados), preparados para pruebas moleculares, o incrustados y evaluados histológicamente (Figura 4).

Resultados

Los organoides 3D se establecieron con éxito a partir de tejidos TURBT y cistectomía de pacientes con cáncer de vejiga humana. Brevemente, esta técnica destaca una rápida formación de estructuras multicelulares 3D que son viables y adecuadas para otros análisis de punto final, como la evaluación histológica, la caracterización molecular (por inmunohistoquímica o PCR cuantitativa en tiempo real) y el cribado de fármacos. Durante el procedimiento (Figura 1), los diversos eluidos du...

Discusión

Si bien los protocolos organoides 3D derivados del tejido del cáncer de vejiga aún están en su infancia, son un área de investigación activa e investigación clínica. Aquí, se detalla un protocolo optimizado para establecer con éxito las PDO de cáncer de vejiga que son adecuadas para especímenes NMIBC y MIBC. Este flujo de trabajo se integra paralelamente en los ensayos clínicos hospitalarios y considera la acumulación de muestras de biobancos, incluido el procesamiento de muestras histológicas y los bancos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL cryogenic vial	Corning	430487
1.5 mL Eppendorf tubes	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	polypropylene single-use tube
100 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27270
100 mm petri dish	Corning	430167
10x Collagenase/ Hyaluronidase	STEMCELL Technologies	#07912
37 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tube	Corning	CLS430829-500EA
6-well plate	Corning	CLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)	Sigma-Aldrich	CLS3474-24EA
A 83-01	BioScientific	2939	Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis buffer	STEMCELL Technologies	#07850
adDMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Base medium
Animal-free recombinant EGF	Sigma	518179	Growth factor
Automated cell counter (TC20)	Bio-rad	1450102
B27 additive	Gibco	17504044	Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting Slides	Bio-rad	1450015
Centrifuge	Eppendorf	EP022628188
Computer system
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	#07930	Cell freezing solution
Dispase II, powder	Thermofisher	17105041	To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1	STEMCELL Technologies	#07900
DPBS	Thermofisher	14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)	Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128	Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)	Invitrogen	35050061	Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPES	Gibco	15630-080	All-purpose buffer
Histology cassette	ProSciTech	RCH44-W
Human FGF-10	Peprotech	100-26-25	Growth factor
Human FGF-2	Peprotech	100-18B-50	Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)	In Vitro Technologies	356231	Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing container	ThermoFisher	5100-0001	cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma	A7250	Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	SIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscope	Nikon	MFA510BB
NIS-Elements Advanced Research	Nikon	MQS31000
Noggin conditioned media	In-house		BMP inhibitor
Pipetboy acu 2	Integra	155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
Primocin	Jomar Bioscience	ant-pm2	Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	support proliferation of cells
Rotary tube mixer	Ratek	RSM7DC
R-spondin 1 conditioned media	In-house		WNT signalling regulator
SB202190	Jomar Bioscience	s1077-25mg	Selective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handle	Livingstone	WBLDHDL03
Scalpels, #11 blade	Medical and Surgical Requisites	EU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste Bags	Medical Search	SU09125X16
Urine specimen jar
Y27632	Jomar Bioscience	s1049-10mg	Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells