非外傷性脳室内出血げっ歯類モデルにおける頭蓋内圧モニタリング

要約

非外傷性脳室内出血のげっ歯類モデルにおける頭蓋内圧のモニタリングは、現在の文献では一般的ではありません。ここでは、ラットモデル動物における脳室内出血時の頭蓋内圧、平均動脈圧、脳灌流圧を測定する技術を実証する。

要約

脳室内出血の生存者は、しばしば重大な長期記憶障害を残されます。そのため、脳室内出血モデル動物を用いた研究が不可欠である。本研究では、ラットの非外傷性脳室内出血時の頭蓋内圧、平均動脈圧、脳灌流圧を測定する方法を検討しました。実験デザインには、偽、標準的な200μlの脳室内出血、およびビヒクルコントロールグループの3つのSprague Dawleyグループが含まれていました。実質内光ファイバー内圧センサーを導入することにより、すべてのグループで正確な頭蓋内圧測定値が得られました。脳灌流圧は、頭蓋内圧と平均動脈圧値を知って計算しました。予想通り、脳室内出血群とビヒクル対照群は、それぞれ自家血と人工脳脊髄液の脳室内注射中に頭蓋内圧の上昇とその後の脳灌流圧の低下を経験しました。実質内光ファイバー圧力センサーの追加は、正確な頭蓋内圧変化を監視するのに役立ちます。

概要

頭蓋内出血(ICH)の一種である脳室内出血(IVH)は、重大な死亡率と罹患率を伴う壊滅的な病気です。IVHは、頭蓋内脳室内の血液製剤の蓄積として特徴付けられます。孤立したIVHはまれであり、典型的には成人に発生します¹。高血圧性出血、破裂した頭蓋内動脈瘤、または別の血管奇形、腫瘍、または外傷に関連している可能性があります¹。IVHは、二次的な脳損傷と水頭症²の発症につながります。IVHの生存者は、損傷後に重大な機能障害、記憶障害、および認知障害を残すことがよくあります。これらの長期的な認知障害と記憶障害は、ICH³の生存者の44%にも上ると報告されています。別のタイプのICHであるくも膜下出血(SAH)では、生存者の約半数が記憶障害を抱えることがよく知られており、SAHに加えてIVHを患っている人にとっては、転帰は著しく悪化する傾向があります^4,5,6。

IVH後の記憶機能障害の根底にあるメカニズムはまだ解明されていません。機能障害や記憶機能障害のある非外傷性IVHモデルを用いたin vivo研究は、そのような患者の潜在的な治療標的を発見するために不可欠です。IVH後のより重度の記憶と機能障害のある動物モデルは、これらの変化を研究するのに最適です。上級著者の研究室はまた、IVHラットモデルの記憶障害の発症における高頭蓋内圧(ICP)の役割を具体的に調査しています。したがって、IVH中にICPを正確に測定する方法は、調査することが重要でした。今回,IVHラットモデルにおけるICPの精密測定方法について報告する.ICPモニタリングは、以前に外傷性ICHおよびくも膜下出血動物モデルにおいて使用されてきたが、自発的なIVHげっ歯類モデルにおけるICPモニタリングは、文献^7,8において一般的に報告されていない。したがって、本明細書で提示された実験デザインには、Sprague Dawleyラットの3つのグループが含まれていました:偽、標準的な200μlの脳室内出血、およびビヒクル制御。IVH群については、自家脳室内血液注入モデルを用いた。ビヒクル対照動物については、滅菌乳酸リンゲル液の脳室内注射を使用した。ICP、平均動脈圧(MAP)、および脳灌流圧(CPP)を術中に記録され、その結果がここに報告されています。

プロトコル

すべての研究方法と動物の世話/維持は、カリフォルニア大学デービス校の制度的ガイドラインに従って実施されました。カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理使用委員会(IACUC)は、すべての動物使用プロトコルと実験手順を承認しました(IACUCプロトコル#21874)。

1.動物の住居

1. 生後8〜10か月のスプレイグドーリーラットを入手します。実験手順の前に、ラットをビバリウムに収容し、餌と水を自由に摂取して12時間の明暗サイクルを行った後、ケージで一般的な適応のために少なくとも1週間待ちます。.

2.麻酔と術前処置

1. ラットを4%イソフルランで4分間麻酔する。挿管プラットフォーム上で仰臥位でラットを歯で吊るし、気管内カニューレと喉頭鏡を使用して気管内に挿管します。
2. 麻酔および挿管されたラットを人工呼吸器(2%イソフルランおよびO2 / N2キャリアガス)に置きます。後脚のつまみなどの痛みを伴う刺激に対する反応が観察されない場合、ラットは適切に麻酔されます。.
3. 直腸体温計を挿入して、温度を継続的に監視します。
4. 滅菌技術を使用してすべての手術手順を実行します。頭と大腿部の髪をクリップし、手術前にベタジンと70%アルコールの3つの交互のスクラブで皮膚を準備します。
5. ラットを人工呼吸器から一時的に取り外し、10mLシリンジに接続されたPE-50チューブで分泌物を吸引することにより、蓄積した呼吸器分泌物を吸引します。
6. 滅菌人工涙液眼軟膏でラットの目を保護します。
7. 頭皮切開の前に、局所ブピバカイン(~0.1 mLの0.25%溶液)を皮膚および皮下組織に注射します。.

3.手術プロトコル

1. 脳室内針と頭蓋内圧(ICP)モニターの配置
   1. ラットを定位フレームの腹臥位に置き、ラットを耳にバーします。
   2. 15枚刃のメスで正中線に沿って1.5cmの頭皮を切開します。
   3. 止血のためにガーゼで穏やかな圧力をかけます。
   4. 滅菌綿チップアプリケーターを使用して、ブレグマのランドマークが見えるまで骨膜を頭蓋骨から分離します。
   5. 定位固定装置を使用してブレグマを見つけてマークアウトし、ブレグマの横方向1.4 mmと後方0.9 mmの2つの両側のバリ穴の位置をマークします。
   6. ハンドヘルドドリルを使用して、右半球と左半球にこれらの2つの小さな(最大2 mm)頭蓋バリ穴を作成します。余分な骨片を滅菌乳酸リンゲル溶液で灌漑します。
   7. 右半球で、22Gのガイドカニューレをバリ穴の高さに配置し、28Gの針をカニューレを通して右側脳室の深さ(ブレグマに対して4.6 mm)に挿入してIVHを作成します。
   8. 光ファイバ圧力センサーを読み出しユニットに接続します。読み出しユニットの電源を入れ、選択したユニットがmmHgであることを確認します。次に、読み出しユニットがゼロを読み取るまで、ラクテッドリンガー溶液を入れた小さなビーカーに先端を沈めて、センサーをプライミングします。乳酸リンガー溶液でゼロにすると、すべて挿入するように設定されます。
   9. 左半球で、圧力センサーを皮質に2〜3 mmの深さまでそっと挿入し、リアルタイムのICPモニタリングを行います。
2. 大腿動脈カニュレーションと平均動脈圧(MAP)モニターの挿入
   1. ICPモニターを挿入した後、ラットの下部胴体を回して、左大腿部と鼠径部に簡単にアクセスできるようにします。
   2. 滅菌製剤と局所ブピバカイン投与の後、15枚羽根のメスで後肢を1.5cmの皮膚切開を行います。
   3. 左大腿動脈を最初に止血剤で表面的に解剖し、次に顕微鏡下で細かい先端を持つ鉗子を使用してより深い層を解剖します。隣接する動脈の位置を特定するのに役立つ濃い青色の大腿静脈を特定します。
   4. 3-0シルク縫合糸を使用して遠位大腿動脈を縛り、大腿動脈の近位部分に一時的な金属クリップを置きます。
   5. 読み出しユニットに接続された2番目の光ファイバー圧力センサーをすでにプライミングします。圧力センサーをポリエチレン(PE-50)チューブに挿入し、それをTuohyBorstに挿入して閉じます。Tuohy Borstを、一方の端が1 mLシリンジに接続された3ウェイ活栓に接続し、もう一方の端にPE-50チューブを備えた22G針を接続します。
   6. 顕微鏡下で、マイクロハサミで2mmの大腿動脈切開を行い、残りのセットアップに接続されたPE-50チューブでカニューレ挿入します。
3. 脳室内注射
   1. 1 mLシリンジを使用して500 μLの血液を吸引し、3方向活栓を回して圧力センサーにMAPを読み取ります。
   2. PE-50チューブに接続された28Gの脳室内針を、IVH動物用の吸引血液とビヒクル対照動物用の乳酸リンガーでプライミングします。次に、この針をガイドカニューレに右側脳室の深さまで挿入します。
   3. 100 μL/分の速度で、1 mLシリンジを親指でポンピングすることにより、血液または滅菌乳酸リンゲル溶液(200 μL)を右脳室に注入します。これに先立って、および心室内注射中に、ICP、動脈血圧、および直腸温度を監視および記録します。
   4. 注入後の ICP 値と MAP 値を監視および記録します。
4. クロージャ
   1. 脳室内注射が完了したら、大腿動脈に挿入した圧力センサーを含むPE-50チューブを引き出し、出血を防ぐために一時的なクリップを大腿動脈に適用します。
   2. 3-0シルク縫合糸を使用して大腿動脈の近位部分を結びます。
   3. 3-0シルクを使用して中断された方法で大腿骨切開を閉じます。
   4. 脳室内針とICPモニターでガイドカニューレを取り外します。
   5. バリ穴を骨ワックスで塞ぎます。
   6. 中断された方法で3-0シルク縫合糸で頭蓋切開を閉じます。
   7. 局所ブピバカインを切開部に塗布し、術後に0.35 mLのカルプロフェン(5 mg / kg)を注射します。.動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
   8. ラットが監督下で手術後に完全に回復し、回復後に餌と水に自由にアクセスできるホームケージに戻します。

4.術後管理

1. 術後7日間、すべての術後動物を毎日チェックして、回復、神経学的状態、行動、体重、および切開を監視します。
2. 0.35 mLのカルプロフェン(5 mg / kg)を、手術時および^術後1日目と2^日目に皮下注射で投与します。.
3. 術^後7 日目に滅菌方法で縫合糸を取り外します。

結果

頭蓋内圧、平均動脈圧、脳灌流圧
ICPとMAPの両方がすべての動物で術中にモニターされました(図1)。ラットは生後8〜10ヶ月で、平均体重は495±17gでした。リアルタイムのICPグラフも収集されました(図2)。偽群を除くと、ICPはIVHおよびビヒクル対照群の脳室内注射中に有意に増加しました(図3)。ICPは、車両?...

ディスカッション

この研究では、非外傷性IVHラット動物モデルでICP、MAP、およびCPPを測定するメカニズムを調査しました。結果は以下の群から記録された:偽、VH 200μL、およびビヒクル対照(人工脳脊髄液脳室内注射)動物。この実験デザインは、ICPのスパイクがより重大な二次脳損傷、したがってIVH動物モデルの記憶障害に寄与する可能性があると仮定したため、IVH注射中にICPを監視する方法を調査するために?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% bupivacaine	Hospira, Inc.	409115901
1 mL syringe	Covetrus	60734
10% providine iodine solution	Aplicare	MSD093947
20 mL syringe	Covidien	8881520657
22 G needles	Becton Dickinson	305155
28 G intraventricular needles	P technologies	8IC313ISPCXC	C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection
3-0 silk suture	Henry Schein, Inc.	SP116
3-way-stopcock	Merti Medical Systems	M3SNC
4% paraformaldehyde	Fisher Chemical	30525-89-4
AnyMaze software	Any-Maze behavioral tracking software		Stoelting CO, USA
Artificial ointment	Covetrus	48272
Blood collection vials with EDTA	Becton Dickinson	367856
Bone wax	CP Medical, Inc.	CPB31A
Carprofen	Zoetis, Inc.	54771-8507-1
Centrifuge	Beckman	BE-GS6R	Model GS-6R
Cotton tip applicators	Covetrus	71214
Drill	Dremel	1600A011JA
Fiberoptic pressure sensors with readout units	Opsens Medical	OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC	Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system
Forceps		11923-13, 11064-07
Gauze	Covetrus	71043
Guillotine	World Precision Instruments	51330
Heating pad with rectal thermometer	CWE, Inc.	08-13000 ,08-13014	TC1000 Temperature controller
Hemostats		13013-14,  13008-12
Isoflurane	Covetrus	29405
Lactated ringers	Baxter Healthcare Corp.	Y345583
Laryngoscope	American Diagnostic Corporation	4080
Metal clip	Fine Scientic Tools	18056-14
Micro scissors	Fine Scientic Tools	15007-08
Microscope	Leica	model L2
Needle driver		12003-15
Polyethylene tubing	Thermo Fisher Scientific	14-170-12B	PE-50 tubing
Rats	Envigo		Sprague Dawley rats 8–10 months old
Scalpel		10010-00
Scissors		14090-11
Stereotaxic instrument	Kopf instruments		Model 940 with ear bars
Syringe pump	KD Scientific	780100	Model 100 series
Tuohy Borst	Abbott	23242
Ventilator	Harvard rodent ventilator	55-0000	Model 683