Un approccio sperimentale per studiare gli effetti della luce artificiale di notte sugli animali liberi: implementazione, risultati e indicazioni per la ricerca futura

Riepilogo

La luce artificiale di notte (ALAN) ha effetti biologici di vasta portata. Questo articolo descrive un sistema per manipolare ALAN all'interno di nidi durante il monitoraggio del comportamento, costituito da luci a LED accoppiate a una batteria, un timer e una videocamera a infrarossi con capacità audio. I ricercatori potrebbero impiegare questo sistema per esplorare molte domande in sospeso riguardanti gli effetti di ALAN sugli organismi.

Abstract

Gli animali si sono evoluti con modelli naturali di luce e oscurità. Tuttavia, la luce artificiale viene sempre più introdotta nell'ambiente dalle infrastrutture umane e dalle attività ricreative. La luce artificiale di notte (ALAN) ha il potenziale per avere effetti diffusi sul comportamento animale, sulla fisiologia e sulla forma fisica, che possono tradursi in effetti su larga scala su popolazioni e comunità. Comprendere gli effetti di ALAN sugli animali liberi non è banale a causa di sfide come misurare i livelli di luce incontrati dagli organismi mobili e separare gli effetti di ALAN da quelli di altri fattori di disturbo antropogenico. Qui descriviamo un approccio che ci consente di isolare gli effetti dell'esposizione alla luce artificiale sui singoli animali manipolando sperimentalmente i livelli di luce all'interno delle cassette nido. A tal fine, è possibile utilizzare un sistema costituito da luci a diodi emettitori di luce (LED) aderenti a una piastra e collegate a una batteria e a un sistema timer. La configurazione consente l'esposizione degli individui all'interno di nidi a diverse intensità e durate di ALAN ottenendo contemporaneamente registrazioni video, che includono anche l'audio. Il sistema è stato utilizzato in studi su cinciallegre libere (Parus major) e cinciallegre (Cyanistes caeruleus) per ottenere informazioni su come ALAN influenza i modelli di sonno e attività negli adulti e la fisiologia e le dinamiche dei telomeri nello sviluppo dei nidiacei. Il sistema, o un suo adattamento, potrebbe essere utilizzato per rispondere a molte altre domande di ricerca intriganti, come il modo in cui ALAN interagisce con altri fattori di disturbo e influenza l'equilibrio bioenergetico. Inoltre, sistemi simili potrebbero essere installati all'interno o vicino alle cassette nido, ai nidi o alle tane di una varietà di specie per manipolare i livelli di ALAN, valutare le risposte biologiche e lavorare per costruire una prospettiva interspecifica. Soprattutto se combinato con altri approcci avanzati per il monitoraggio del comportamento e del movimento degli animali liberi, questo approccio promette di produrre contributi continui alla nostra comprensione delle implicazioni biologiche di ALAN.

Introduzione

Gli animali si sono evoluti con i modelli naturali di luce e oscurità che definiscono il giorno e la notte. Pertanto, i ritmi circadiani nei sistemi ormonali orchestrano i modelli di riposo e attività e consentono agli animali di massimizzare la forma fisica ^1,2,3. Ad esempio, il ritmo circadiano negli ormoni glucocorticoidi, con un picco all'inizio dell'attività quotidiana, innesca i vertebrati a comportarsi in modo appropriato durante il periodo di 24 ore attraverso effetti sul metabolismo del glucosio e sulla reattività ai fattori di stress ambientali⁴. Allo stesso modo, l'ormone pineale melatonina, che viene rilasciato in risposta all'oscurità, è integralmente coinvolto nel governo dei modelli di ritmicità circadiana e ha anche proprietà antiossidanti ^5,6. Il trascinamento di molti aspetti della ritmicità circadiana, come il rilascio di melatonina, è influenzato dalla fotoricezione dei livelli di luce nell'ambiente. Pertanto, l'introduzione di luce artificiale nell'ambiente per supportare l'attività umana, la ricreazione e le infrastrutture ha il potenziale per avere effetti di vasta portata sul comportamento, la fisiologia e l'idoneità degli animali liberi ^7,8. In effetti, diversi effetti dell'esposizione alla luce artificiale di notte (ALAN) sono stati documentati ^9,10 e ALAN è stato evidenziato come una priorità per la ricerca sul cambiamento globale nel 21^° secolo¹⁰.

Misurare gli effetti di ALAN sugli animali liberi pone sfide non banali per una serie di motivi. In primo luogo, gli animali mobili che si muovono attraverso l'ambiente sperimentano costantemente diversi livelli di luce. Quindi, come si quantifica il livello di luce a cui sono esposti i singoli animali? Anche se i livelli di luce sul territorio dell'animale possono essere quantificati, l'animale può impiegare strategie di evitamento che influenzano i modelli di esposizione, richiedendo così il monitoraggio simultaneo della posizione dell'animale e dei livelli di luce. Infatti, nella maggior parte degli studi sul campo, la media e la variazione dei livelli di esposizione alla luce sono sconosciute¹¹. In secondo luogo, l'esposizione ad ALAN è spesso correlata con l'esposizione ad altri fattori di disturbo antropogenico, come l'inquinamento acustico, l'esposizione chimica e il degrado dell'habitat. Ad esempio, gli animali che occupano habitat lungo i margini delle strade saranno esposti alla luce dei lampioni, al rumore del traffico veicolare e all'inquinamento atmosferico causato dalle emissioni veicolari. Come si possono quindi isolare efficacemente gli effetti di ALAN dagli effetti delle variabili confondenti? Rigorosi esperimenti sul campo che consentano buone misurazioni sia dei livelli di esposizione alla luce che delle variabili di risposta sono essenziali per valutare la gravità degli effetti biologici di ALAN e per sviluppare efficaci strategie di mitigazione¹¹.

Questo articolo descrive un approccio sperimentale che, sebbene non privo di limiti (vedi sezione di discussione), aiuta a placare, se non eliminare, le difficoltà sopra identificate. L'approccio prevede la manipolazione sperimentale dei livelli di ALAN all'interno delle cassette nido di una specie di uccelli diurni a vita libera, la cinciallegra (Parus major), utilizzando un sistema di luci a diodi emettitori di luce (LED) e una telecamera a infrarossi (IR) installata all'interno di nidi. La configurazione consente l'acquisizione simultanea di registrazioni video, incluso l'audio, che consente ai ricercatori di valutare gli effetti su comportamenti e vocalizzazioni. Le grandi tette utilizzano le cassette nido per l'allevamento e dormono nelle cassette nido tra novembre e marzo. Le femmine dormono anche all'interno delle cassette nido durante la stagione riproduttiva¹². Il sistema è stato anche utilizzato in misura minore per studiare gli effetti di ALAN sulle tette blu (Cyanistes caeruleus). La prima difficoltà, che consiste nel conoscere i livelli di luce incontrati dall'animale, è mitigata in quanto, dato che un individuo è disposto ad entrare nella cassetta nido (o è già nella scatola del nido nel caso di nidiacei immobili), i livelli di luce possono essere determinati con precisione dal ricercatore. La seconda difficoltà, che coinvolge correlazioni con variabili confondenti, può essere controllata utilizzando cassette nido in ambienti simili e / o misurando i livelli di variabili confondenti vicino alle cassette nido. Inoltre, negli uccelli che nidificano in cavità, l'adozione di un approccio sperimentale è potente perché le cassette nido o le cavità naturali possono proteggere i nidiacei e gli adulti da ALAN¹³, il che potrebbe spiegare perché alcuni studi correlativi trovano scarso effetto di ALAN (o rumore antropogenico)¹⁴, mentre gli studi sperimentali trovano più spesso effetti chiari (vedi sotto). Inoltre, è possibile adottare un disegno sperimentale di misure ripetute in cui gli individui fungono da proprio controllo, il che aumenta ulteriormente il potere statistico e la probabilità di rilevare effetti biologici significativi. Le sezioni seguenti: (1) spiegano i dettagli della progettazione e dell'implementazione del sistema, (2) riassumono gli importanti risultati che sono stati finora derivati utilizzando il sistema e (3) propongono direzioni di ricerca future che potrebbero essere perseguite, sia nelle tette che in altri animali.

Protocollo

Tutte le applicazioni di questo sistema agli esperimenti sugli animali sono state approvate dal comitato etico dell'Università di Anversa e condotte in conformità con le leggi belghe e fiamminghe. La metodologia ha aderito alle linee guida ASAB / ABS per l'uso degli animali nella ricerca comportamentale. L'Istituto Reale Belga di Scienze Naturali (Koninklijk Belgisch Instituut voor Natuurwetenschappen; KBIN) ha fornito licenze per tutti i ricercatori e il personale.

1. Creazione del sistema sperimentale

1. Ottenere LED ad ampio spettro da utilizzare nella creazione di ALAN. Prendi le luci a LED da un faro a LED. Utilizzare una singola luce LED o più luci LED (ad esempio, 4) ad ampio spettro per un'illuminazione più diffusa (Figura 1).
   NOTA: Come modifica, i LED con diverse proprietà spettrali (ad esempio, rosso contro blu) potrebbero essere utilizzati ma dovrebbero essere ottenuti da una fonte diversa (vedere il materiale supplementare di Grunst et al. 2019¹⁵ per le proprietà spettrali dei LED utilizzati in studi precedenti che utilizzano questo sistema).
2. Progettare un sistema per montare i LED insieme a una telecamera IR per consentire il monitoraggio comportamentale. I ricercatori possono raggiungere questo scopo in diversi modi.
   1. Opzione 1. Inserire un singolo LED ad ampio spettro nella nest box separatamente in un tubo di plastica adiacente a una telecamera IR montata con adesivo su una piastra di plastica o metallo che si adatta alla nest box (Figura 1A, B).
   2. Opzione 2. Montare una telecamera IR in posizione centrale su una piastra di plastica o metallo e quindi montare le luci a LED in posizioni fisse sulla piastra che circonda la telecamera IR (Fig. 1C).
3. Progettare un mezzo per collegare il sistema a una fonte di alimentazione (batteria) e timer.
   1. Utilizzare un coltello o un trapano per creare boschetti sul lato della scatola del nido attraverso i quali i connettori a filo possono estendersi per collegare il sistema a una batteria Fe (12 V; 120 Wh) e un timer fatto in casa (12 V).
   2. Progettare un involucro in legno verde scuro che corrisponda alla scatola del nido in colorazione, lunghezza e larghezza (ad esempio, le cassette nido utilizzate in studi precedenti avevano le dimensioni: 120 mm x 155 mm x 250 mm ) e con un'apertura laterale tramite una cerniera per ospitare la batteria, il registratore per il video e il sistema timer per i LED (Figura 2; Figura supplementare 1 e figura supplementare 2).
4. Progettare un mezzo attraverso il quale regolare l'intensità di ALAN.
   1. Ottenere un resistore (valore condizionato dalla tensione e dall'illuminazione della batteria) e collegarlo in serie con i LED.
5. Progettare scatole "fittizie" con le stesse dimensioni delle custodie che ospitano il timer e la batteria per l'uso negli uccelli abituati al sistema (cioè, come nella Figura 2A, ma senza l'elettronica interna).
   NOTA: La sezione 2 e la sezione 3 discutono i metodi passo-passo utilizzati per studiare gli effetti di ALAN sull'organismo focale.

Figura 1: Due sistemi costituiti da telecamere IR e luci a LED utilizzate per manipolare ALAN all'interno di cassette nido. (A) Vista dall'alto della scatola nido con piastra che tiene in posizione il sistema precedente. (B) Vecchio sistema con 1 LED ad ampio spettro per manipolare ALAN e telecamera centrale con 10 LED IR (c) Sistema più recente con 4 LED ad ampio spettro e telecamera IR centrale con 4 LED IR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La batteria e l'unità timer fatte in casa utilizzate per manipolare ALAN e il comportamento di registrazione video. (A) L'unità è racchiusa all'interno di una scatola di legno montata sulla parte superiore della scatola nido. (B) Vista dell'elettronica all'interno dell'unità. I connettori si estendono dall'interno della scatola del nido fino all'involucro di legno per collegare l'elettronica alla telecamera IR e ai LED ad ampio spettro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Pianificazione dell'esperimento e regolazione dell'intensità e dei tempi di ALAN

1. Determinare l'intensità luminosa desiderata a cui esporre gli animali.
   1. Considerare attentamente quale intensità luminosa sperimentale utilizzare in modo da produrre risultati significativi che rispondano alla domanda di ricerca. In generale, ciò significherà selezionare un'intensità luminosa ecologicamente rilevante, che gli animali liberi potrebbero incontrare (vedere la Tabella 1 per le linee guida).
2. Regolare le luci a LED sull'intensità luminosa desiderata (ad esempio, 1-3 lux, come utilizzato in studi precedenti; Tabella 1 e Tabella 2).
   1. Prima del posizionamento sul campo, posizionare il sistema su una scatola nido portata in laboratorio per calibrare l'intensità della luce. Collegare i LED alla fonte di alimentazione, come descritto più avanti (sezione 3 del protocollo).
   2. Regolare la luce emessa dai LED all'intensità desiderata (lux) posizionando un esposimetro a livello dell'uccello all'interno della scatola nido (~8 cm dal basso) e regolando contemporaneamente il resistore in serie con i LED.
      NOTA: è possibile ottenere intensità di luce molto basse (ad esempio, livelli di bagliore del cielo rurale; 0,01 lux).
3. Determinare il periodo di tempo in cui esporre gli animali ad ALAN.
   1. Determinare la durata e i tempi di esposizione durante la notte. Ad esempio, si possono esporre gli animali ad ALAN per tutta la notte, solo per una parte della notte, o lasciare un periodo di oscurità nel cuore della notte per ridurre il grado di perturbazione.
   2. Nei casi in cui un animale debba entrare nella scatola del nido (o in un'area specifica) per essere esposto all'ALAN, considerare anche se la luce deve essere accesa prima o dopo che è probabile che si verifichi l'evento di ingresso.
4. Impostare il timer per controllare il periodo di esposizione alla luce durante la notte.
   1. Impostare il timer collegato ai LED ad ampio spettro in modo che la luce si accenda e si spenga in periodi specificati (ad esempio, almeno 2 ore prima del tramonto; spento 2 ore dopo l'alba).
      NOTA: La telecamera IR consente di registrare contemporaneamente il comportamento dell'animale per tutta la durata dell'esposizione alla luce e sarà accesa finché è collegata a una batteria carica.
5. Determinare il progetto sperimentale appropriato da utilizzare per le domande di ricerca target.
   NOTA: Per alcune domande, un disegno sperimentale di misure ripetute sarà l'opzione più potente (ad esempio, In che modo l'esposizione ad ALAN influisce sul comportamento del sonno?). Per altri, saranno necessari gruppi di controllo e sperimentali accoppiati (ad esempio, in che modo l'esposizione ad ALAN influisce sulla perdita di telomeri nello sviluppo di nidiacei?).

Fonte/livello di esposizione	Intensità (lux)
Piena luce del sole	103000
Pieno chiaro di luna	0.05–1
Bagliore del cielo urbano	0.2–0.5
Esposizione di merli europei che vivono liberi	0.2 (0.07–2.2)
Studi sperimentali passati utilizzando il sistema	1–3
Lampioni stradali a LED	~10
Lampioni stradali al sodio a bassa pressione	~10
Sodio ad alta pressione	~10
Illuminazione fluorescente	300
Alogenuri metallici	400–2000

Tabella 1: Intensità luminose caratteristiche nell'ambiente ^3,9, livelli di esposizione degli uccelli liberi⁴¹ e intensità utilizzate in studi precedenti che utilizzano questo sistema (riferimenti nella tabella 2).

3. Implementazione dell'esposizione ad ALAN

1. Abituare gli animali alla configurazione sperimentale.
   1. Se possibile nel contesto dell'esperimento, abituare gli animali alla configurazione posizionando scatole fittizie sulla parte superiore delle cassette nido almeno 1 giorno prima dell'esperimento per ridurre al minimo gli effetti dell'avversione alla novità.
2. Esamina gli individui focali.
   1. Adatta gli animali nella popolazione di studio con tag transponder integrativi passivi (PIT) per consentire l'identificazione all'interno delle cassette nido senza disturbare gli uccelli.
   2. Negli esperimenti che coinvolgono l'effetto di ALAN sul comportamento del sonno, visita le cassette nido la notte prima dell'esperimento e scansiona le scatole con un lettore di identificazione a radiofrequenza (RFID) per determinare quali uccelli si trovano all'interno.
   3. Negli esperimenti durante la stagione riproduttiva che comportano l'esposizione di nidiacei in via di sviluppo ad ALAN, monitorare costantemente (ad esempio, a giorni alterni) le cassette nido e controllare il contenuto del nido e l'identità degli adulti. Selezionare attentamente le cassette nido contenenti covate con determinate caratteristiche (ad esempio, dimensioni modali della covata, entrambi i genitori presenti e in alimentazione) da utilizzare nell'esperimento.
3. Selezionare e implementare l'esperimento.
   1. Per gli esperimenti che coinvolgono il comportamento del sonno, implementare un progetto di misure ripetute registrando prima gli individui che dormono in condizioni di oscurità per almeno una notte per registrare il sonno indisturbato in assenza di ALAN (trattamento di controllo) seguendo i passaggi 3.3.2-3.3.21.
   2. A tal fine, assicurarsi di sincronizzare l'ora sulle telecamere IR con l'ora locale prima di portarle sul campo.
   3. Inserire una scheda SD nello slot SD nel mini registratore DVR adiacente alla batteria (Figura 2B; Figura supplementare 2). Verificare che la scheda SD sia vuota e, in caso contrario, cancellare i dati in essa contenuti.
   4. Almeno 2 ore prima dell'inizio dell'oscurità, rimuovere la scatola fittizia dalla parte superiore della scatola del nido.
   5. Apri il coperchio della scatola del nido.
   6. Posizionare la piastra contenente la telecamera IR all'interno della scatola nido con l'obiettivo della telecamera orientato verso il basso.
   7. Estendere i connettori elettronici fuori dal boschetto nella scatola del nido.
   8. Chiudere il coperchio della scatola del nido.
   9. Posizionare l'involucro contenente la batteria, il registratore e il timer sopra la scatola del nido.
   10. Collegare i connettori di alimentazione della batteria. Collegare il connettore rosso del registratore al connettore bianco della fotocamera (audio), il connettore giallo del registratore al connettore giallo della fotocamera (video) e il connettore nero della batteria al connettore rosso della fotocamera (alimentazione) (Figura supplementare 1 e Figura supplementare 2).
   11. Premere il pulsante di registrazione per avviare la registrazione della fotocamera.
       NOTA: il timer non verrà impostato e/o l'alimentazione non sarà collegata al timer che controlla i LED in modo che nessun ALAN venga prodotto nelle notti di controllo.
   12. Controllare con un piccolo schermo tft per assicurarsi che la registrazione sia iniziata e che l'immagine sia corretta. Una porta per collegare lo schermo tft si trova sotto il registratore (Figura supplementare 2).
   13. Circa 1 ora dopo il tramonto, torna alla scatola del nido e controlla l'identità dell'uccello che dorme all'interno spostando un lettore transponder RFID sul fondo e sui lati della scatola del nido e registrando il numero di identificazione univoco comunicato dal tag PIT.
   14. La mattina successiva alla registrazione di controllo, almeno 2 ore dopo l'alba, tornare al nido e ritirare il sistema di batterie e la telecamera IR.
   15. Ancora una volta, posiziona una scatola fittizia sopra la scatola del nido.
   16. In laboratorio o in ufficio, caricare la batteria e rimuovere e scaricare la scheda SD dal registratore per raccogliere i dati comportamentali.
       NOTA: le batterie hanno una durata di circa 30 ore in condizioni di freddo per consentire la registrazione per l'intera notte, ma devono essere completamente ricaricate tra notti consecutive di registrazione.
   17. Dopo aver scaricato correttamente i dati, cancellare i dati dalla scheda SD e quindi reinserirli nel mini registratore DVR.
   18. Nella notte successiva, implementare il trattamento di esposizione alla luce (ad esempio, 1-3 lux, come utilizzato in esperimenti passati utilizzando il sistema; Tabella 1 e Tabella 2).
   19. Impostare il sistema timer per il periodo di tempo desiderato di esposizione alla luce.
   20. Seguire gli stessi passaggi (3.3.2-3.3.17) descritti sopra per la registrazione di controllo, ma anche collegare il timer all'alimentazione e i LED al timer (Figura supplementare 1 e Figura supplementare 2).
   21. Se lo si desidera, ripetere la registrazione di controllo (del comportamento del sonno in condizioni di oscurità, cioè assenza di ALAN) la terza notte.
   22. Per gli esperimenti che comportano l'esposizione di nidiacei ad ALAN, utilizzare covate di controllo e sperimentali come descritto nelle fasi 3.3.23-3.3.25.
   23. Posiziona scatole fittizie (prive di elettronica) sopra le scatole nido di covate di controllo e gestisci sia i nidiacei di controllo che quelli sperimentali in modi equivalenti.
   24. Implementare l'esposizione sperimentale ALAN per scatole sperimentali. Durante il periodo sperimentale, montare il sistema LED e la telecamera IR all'interno del nest box, come descritto sopra, e impostare il timer per controllare il periodo desiderato di esposizione alla luce.
   25. Ricaricare le batterie. Per esperimenti che prevedono più notti di esposizione alla luce e registrazione video, raccogliere i sistemi ogni mattina per ricaricare le batterie durante il giorno e quindi sostituire il sistema la sera.
4. Raccogliere dati sulle variabili di risposta di interesse.
   1. Se il comportamento all'interno della scatola del nido è la variabile di interesse, la telecamera IR consentirà di documentare contemporaneamente il comportamento (ad esempio, il comportamento del sonno; Figura 3).
   2. Raccogliere qualsiasi altro dato di interesse tramite metodi di monitoraggio aggiuntivi, con campionamento che avviene in momenti variabili nel tempo (ad esempio, campioni di sangue prelevati prima e dopo l'esposizione alla luce¹⁵).

Figura 3: Immagine a infrarossi di una cinciallegra all'interno di una scatola nido esposta ad ALAN. (A) Dormire e (B) Avvisa grande cinciallegra Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Gli articoli di ricerca peer-reviewed pubblicati utilizzando questo sistema sono riassunti nella Tabella 2. Diversi altri manoscritti sono in corso. Questi studi affrontano tre principali suite di domande di ricerca. In primo luogo, il sistema è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'esposizione alla luce sul comportamento del sonno e sui livelli di attività negli adulti. A tal fine, è stato impiegato un disegno sperimentale di misure ripetute, in cui lo stesso individuo è stato prima registr...

Discussione

Questo sistema basato su nest box di luci a LED e una telecamera IR accoppiata ha permesso ai ricercatori di valutare una serie di domande intriganti riguardanti gli effetti biologici di ALAN. Inoltre, ci sono molte altre direzioni di ricerca che possono essere perseguite con il sistema. Inoltre, l'espansione dell'uso del sistema ad altre specie potrebbe aiutare a promuovere una comprensione delle differenze interspecifiche nella sensibilità all'ALAN. Di seguito vengono presentate alcune possibilità non esaustive per l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Broad spectrum; 15 mm x 5 mm; LED headlight	RANEX; Gilze; Nederlands	6000.217	A similar model could also be used
Battery	BYD	R1210A-C	Fe-battery 12 V 120 Wh ( lithium iron phosphate battery)
Dark green paint			Optional. To color nest boxes/electronic enclosures
Electrical tape			For electronics
Homemade timer system	Amazon	YP109A 12V	A similar model could also be used
Infrared camera	Koberts-Goods, Melsungen, DE	205-IR-L	Mini camera; a similar model could also be used
Light level meter	ISO-Tech ILM; Corby; UK	1335	To calibrate light intensity
Mini DVR video recorder	Pakatak, Essex, UK	MD-101	Surveillance DVR Recorder Mini SD Car DVR with 32 GB
Passive integrated transponder (PIT) tags	Eccel Technology Ltd, Aylesbury, UK	EM4102	125 Kh; Provides unique electronic ID
Radio frequency identification (RFID) Reader	Trovan, Aalten, Netherlands	GR-250	To scan PIT tags and determine bird identity
Resistor	RS Components		Value depending on voltage battery and illumination
SD card	SanDisk		64 GB or larger
SongMeter	Wildlife Acoustics; Maynard, MA		Optional. Provides a means of monitoring vocalizations outside of nest boxes
TFT Color LED Portable Test Monitor	Walmart		Allows verification that the camera is on and recording the image correctly
Wood			To construct nest boxes/electronic encolsures