Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Riepilogo

Qui, descriviamo l'uso di piastre a gradiente induttore per valutare la motilità dello sciame batterico ottenendo contemporaneamente risposte di concentrazione multiple.

Abstract

La motilità dello sciame batterico è un fenotipo microbiologico comune che le comunità batteriche usano per migrare su superfici semisolide. Nelle indagini sulla motilità dello sciame indotto, la concentrazione specifica di un induttore potrebbe non essere in grado di segnalare eventi che si verificano entro l'intervallo di concentrazione ottimale per suscitare le risposte desiderate da una specie. Le piastre semisolide contenenti concentrazioni multiple sono comunemente usate per studiare la risposta all'interno di un intervallo di concentrazione dell'induttore. Tuttavia, le piastre semisolide separate aumentano le variazioni della viscosità media e del contenuto di umidità all'interno di ciascuna piastra a causa del tempo di solidificazione non uniforme.

Questo documento descrive un metodo in un'unica fase per testare contemporaneamente la motilità dello sciame superficiale su una singola piastra a gradiente, in cui i pozzetti di prova disposti isometricamente consentono l'acquisizione simultanea di risposte multiconcentranti. Nel presente lavoro, lo sciame superficiale di Escherichia coli K12 e Pseudomonas aeruginosa PAO1 è stato valutato in risposta a un gradiente di concentrazione di induttori come il resveratrolo e l'arabinosio. Periodicamente, le morfologie dello sciame sono state fotografate utilizzando un sistema di imaging per catturare l'intero processo di sciame superficiale.

La misurazione quantitativa delle morfologie dello sciame è stata acquisita utilizzando il software ImageJ, fornendo informazioni analizzabili dell'area dello sciame. Questo documento presenta un semplice metodo di piastra a sciame a gradiente che fornisce informazioni qualitative e quantitative sugli effetti degli induttori sullo sciame superficiale, che può essere esteso per studiare gli effetti di altri induttori su una gamma più ampia di specie batteriche mobili.

Introduzione

La motilità dello sciame batterico si riferisce alla migrazione collettiva delle cellule batteriche attraverso la superficie di una sostanza. Oltre alle piastre di agar semisolide appositamente preparate in ^laboratorio1, questo fenotipo si osserva anche su alcuni substrati molli come tessuti ^animali2, superfici idratate3 e radici ^vegetali4. Mentre una superficie semisolida è considerata una delle condizioni fondamentali per lo sciame batterico, alcune specie richiedono anche un mezzo ricco di energia per supportare la loro motilità dello ^sciame5. La rotazione dei flagelli alimenta sia il nuoto che lo sciame motilità: il nuoto descrive la motilità unicellulare all'interno di un ambiente liquido, mentre lo sciame è il movimento sincrono di una popolazione microbica su superfici semisolide.

La viscosità del substrato influenza la motilità batterica; studi su microbi patogeni, come l'Helicobacter pylori, hanno dimostrato che la motilità del patogeno cambia a seconda della viscosità dello strato di mucina, che è influenzata dall'acidificazione ambientale nell'ospite ^umano6. Per replicare questi ambienti, studi precedenti che utilizzavano una concentrazione di agar superiore allo 0,3% (p / v) limitano la motilità del nuoto batterico per effettuare un graduale spostamento nello sciame superficiale. L'uso di concentrazioni di agar superiori all'1% (p/v) previene la motilità brulicante di molte ^specie7. I modelli di colonie formati sulla superficie sono diversi, tra cui ^mat8 senza caratteristiche, occhio di ^bue9, dendrites10 e ^vortex11.

Sebbene la rilevanza di tali modelli rimanga poco chiara, tali modelli sembrano dipendere da segnali ambientali e ^chimici12. I segnali ambientali coprono diversi aspetti, tra cui temperatura, salinità, luce e pH, mentre i segnali chimici includono la presenza di molecole microbiche di quorum sensing, sottoprodotti biochimici e sostanze nutritive. Molecole di segnalazione con quorum sensing autoinduttore come AHL (N-esanolo-L omoserina lattone) possono avere un impatto sullo sciame superficiale regolando la produzione di tensioattivo13,14. Il resveratrolo, un composto fitoalessico, potrebbe limitare la motilità dello sciame ^batterico15.

Nel presente lavoro, studiamo l'effetto delle concentrazioni di gradiente di resveratrolo sul ceppo Escherichia coli K12 di tipo selvatico e studiamo la motilità dello sciame inducibile dall'arabinosio delle specie ingegnerizzate E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La produzione dell'enzima YdeH è indotta dall'arabinosio attraverso il promotore araBAD, con conseguente perturbazione cellulare c-di-GMP e influenza la motilità dello sciame ^{batterico16,17}. Questo comportamento di sciame inducibile è studiato utilizzando piastre di sciame a gradiente di arabinosio con ceppi di E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.

Le piastre dello sciame gradiente vengono preparate solidificando successivamente il mezzo a doppio strato (Figura 1B). Lo strato inferiore comprende il mezzo aggiunto con l'induttore, versato su un lato di una capsula di Petri appoggiata. Dopo la solidificazione dello strato inferiore, la capsula di Petri viene restituita a una superficie piana, dove lo strato superiore contenente il mezzo senza l'induttore viene aggiunto dall'altro lato della piastra. Dopo che le piastre dello sciame sono state completamente solidificate, i pozzetti di tenuta disposti isometricamente vengono prodotti perforando i fori sulle piastre dello sciame seguendo un layout fisso (Figura 1C) o imprimendo i pozzetti utilizzando un modello stampato in 3D del coperchio della piastra contenente pioli durante il processo di polimerizzazione media (Figura supplementare S1). Un sistema di imaging su gel viene utilizzato per catturare le morfologie dello sciame in diversi punti temporali (Figura 2). L'analisi dello sciame superficiale utilizzando il software ImageJ (Figura supplementare S2) fornisce risultati quantitativi del processo di sciame superficiale (Figura 3).

Pertanto, proponiamo un metodo semplice per testare la motilità dello sciame superficiale all'interno di un intervallo di concentrazione di induttori. Questo metodo può essere utilizzato per testare risposte di concentrazione multiple di altri induttori mescolando l'induttore nel mezzo dello strato inferiore e può essere applicato ad altre specie mobili (ad esempio, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Questo approccio potrebbe fornire risultati qualitativi e quantitativi affidabili per lo screening di un singolo induttore chimico e possono essere utilizzate piastre separate per valutare più induttori chimici.

Protocollo

1. Preparazione delle piastre dello sciame gradiente

1. Preparazione dello sciame medio
   NOTA: Vedere la sezione di discussione per un breve confronto tra diverse viscosità medie; In questo protocollo è stata utilizzata una concentrazione di agar dello 0,7% (p/v) di mezzo sciame.
   1. Preparare il brodo di lisogenia (LB) in polvere con agar in due palloni conici; ogni pallone contiene 2 g di triptone, 2 g di cloruro di sodio, 1 g di estratto di lievito e 1,4 g di agar. Aggiungere acqua a doppia distillazione (_ddH2O) e mescolare la sospensione utilizzando una barra magnetica. Regolare il volume finale a 200 ml aggiungendo ulteriore _ddH2O.
   2. Autoclave della soluzione a 121 °C per 20 min. Utilizzare un tappo permeabile all'aria o un film sigillante per bottiglie con una presa d'aria.
      NOTA: Agar si dissolverà quando riscaldato in autoclave.
   3. Quando la temperatura scende a 65 °C, mescolare la soluzione per garantire l'omogeneità e trasferire il mezzo in un incubatore a 65 °C o a bagnomaria per un uso a breve termine.
2. Preparazione dello sciame dello strato inferiore medio
   NOTA: Il mezzo dello strato inferiore è la miscela di soluzioni stock di mezzo sciame e induttore. La formulazione delle piastre dello sciame a gradiente induttore è mostrata nella Tabella 1.
   1. Preparare una soluzione madre di resveratrolo da 100 mM sciogliendo 114,12 mg di polvere di resveratrolo liofilizzato in 5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) e conservare la soluzione a -20 °C.
   2. Preparare una soluzione madre di arabinosio al 20% (p/v) sciogliendo 6 g di arabinosio in polvere in 30 ml di _ddH2O; attendere 10-15 minuti per permettere all'arabinosio di dissolversi; e conservare la soluzione a temperatura ambiente.
   3. Estrarre il mezzo dall'incubatore a 65 °C e posizionarlo a temperatura ambiente; lasciare raffreddare il mezzo sciame fino a quando il pallone Erlenmeyer non è abbastanza freddo da contenere (~ 50 °C). Non posizionare il mezzo sciame a temperatura ambiente per lunghi periodi, poiché ciò causerà la solidificazione dell'agar.
   4. Aggiungere il volume richiesto della soluzione madre induttore al mezzo sciame a 50 °C (Tabella 1). Utilizzare una pipetta per erogare la soluzione induttore invece di versarla. Ruotare delicatamente per mescolare l'induttore con il mezzo dello sciame.
      NOTA: questo passaggio è per gli induttori che non possono essere autoclavati. Fai attenzione a non introdurre bolle nel mezzo.
3. Preparazione di piastre a sciame gradienti a doppio strato
   NOTA: il mezzo dello strato superiore è un mezzo LB contenente lo 0,7% (p/v) di agar.
   1. Etichettare le piastre di Petri quadrate 13 x 13 cm con nome dell'induttore e ceppi e appoggiare i piatti sul bordo dei coperchi (Figura 1B).
   2. Aggiungere 40 mL di terreno caldo di fondo (50 °C) utilizzando una pipetta da 50 mL o un tubo centrifuga da 50 mL.
      NOTA: In alternativa, per piastre di Petri quadrate da 13 x 13 cm, è adatto uno strato inferiore da 40 ml e un mezzo di strato superiore; per piastre di Petri quadrate 10 x 10 cm, è adatto uno strato inferiore da 25 ml e un mezzo di strato superiore.
   3. Lasciare polimerizzare il mezzo dello strato inferiore scoperto per 1 ora all'interno di una cappa a flusso laminare. Non disturbare le piastre quadrate di Petri mentre il mezzo si solidifica.
      NOTA: durante la polimerizzazione dello strato inferiore, il mezzo sciame non contenente induttori deve essere mantenuto in un incubatore a 65 °C o a bagnomaria.
   4. Una volta che lo strato inferiore è completamente solidificato, rimuovere i coperchi e posare le piastre di Petri quadrate all'interno di una cappa a flusso laminare.
   5. Aggiungere 40 mL di terreno superiore caldo (50 °C) utilizzando una pipetta da 50 mL o un tubo centrifuga da 50 mL.
      NOTA: il mezzo dello strato superiore non contiene induttori.
   6. Polimerizzare le piastre a doppio strato sul piano di lavoro coperto e indisturbato per 1 ora. Conservare le piastre preparate a 4 °C per un massimo di 24 ore.
      NOTA: tempi di polimerizzazione più lunghi ridurrebbero il contenuto di umidità e limiterebbero la motilità dello sciame.

2. Crescita di E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1

1. Preparare 500 mL di LB medium aggiungendo 5 g di triptone, 5 g di NaCl e 2,5 g di estratto di lievito in _ddH2O e rabboccare la soluzione a 500 mL. Autoclave la soluzione su ciclo liquido per 20 min a 121 °C, e conservarla a 4 °C.
2. Preparare 100 mL di terreno LB-agar all'1,5% (p/v) aggiungendo 1 g di triptone, 1 g di NaCl, 0,5 g di estratto di lievito e 1,5 g di agar in _ddH2O e rabboccare la soluzione a 100 ml. Autoclave della soluzione su ciclo liquido per 20 min a 121 °C. Trasferire il mezzo a bagnomaria a 50 °C per evitare che l'agar si solidifichi.
3. Quando il pallone medio LB-agar è comodo da tenere, aggiungere 20 ml di lb-agar medio in una capsula di Petri (10 cm di diametro) usando una pipetta da 25 ml. Lasciare la piastra a temperatura ambiente durante la notte e conservare la piastra LB-agar a 4 °C.
4. Prendere colture stock conservate a -80 °C, striscia E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PAO1-YdeH ceppi su piastre LB-agar Petri utilizzando anelli di inoculazione usa e getta. Incubare le piastre di Petri invertite durante la notte a 37 °C.
5. Scegli singole colonie per diversi ceppi dalle piastre di Petri, inocula ogni colonia in 5 ml di terreno LB e incuba la coltura a 37 °C in uno shaker orbitale di laboratorio impostato a 220 giri / min.
6. Quando la densità di coltura raggiunge _OD600nm ~ 1.0, rimuovere la coltura dallo shaker e posizionarla a temperatura ambiente. Regolare la densità di coltura su _OD600nm = 1.0, come descritto nel passaggio 3.2.1.

3. Inoculazione e incubazione di piastre di sciame gradienti

1. Preparazione di pozzi di inoculazione
   NOTA: i modelli di copertura per la stampa 3D in grado di generare pozzi separati da una distanza standard possono essere utilizzati al posto del metodo descritto di seguito (Figura supplementare S1).
   1. Contrassegnare le posizioni del pozzo sulla carta A4 mostrata nella Figura 1C. Impostare tre concentrazioni di prova in una capsula di Petri quadrata con due o tre repliche.
   2. Posizionare la carta A4 contrassegnata sotto una piastra sfumata solidificata. Spingere il lato più ampio di una punta della pipetta da 100 μL nella superficie media semisolida nella posizione contrassegnata. Premere la punta della pipetta fino a raggiungere il fondo del mezzo dello strato superiore.
   3. Quando la punta tocca il fondo, non applicare alcuna forza verticale alla punta; ruotare delicatamente la punta per isolare il contenuto del pozzetto cilindrico.
   4. Spostare orizzontalmente le punte delle pipette lungo una distanza molto piccola per consentire il flusso d'aria nel punto stretto messo da parte. Premere la punta con l'indice per bloccare il flusso di gas all'interno della punta mentre si tiene la pipetta usando il pollice e il dito medio.
   5. Estrarre la punta verticalmente, mantenendo il contenuto del pozzo nella punta mentre la si estrae.
      NOTA: se il contenuto del pozzo scivola, applicare una pressione leggermente maggiore con l'indice per sigillare completamente la punta.
   6. Ripetere i passaggi da 3.1.2 a 3.1.5 in ogni posizione contrassegnata. Coprire la piastra dello sciame prima dell'inoculazione.
2. Inoculazione e incubazione di piastre sfumate
   1. Regolare la densità di coltura di crescita durante la notte a _OD600nm = 1.0.
   2. Pipetta 80 μL della coltura di crescita durante la notte in ogni pozzo. Non versare la coltura batterica al di fuori dei pozzi.
   3. Avvolgere le piastre con pellicola sigillante. Per l'osservazione a lungo termine (3-5 giorni), avvolgere le piastre con nastro di gomma da laboratorio sterile.
      NOTA: il nastro di gomma ha meno probabilità di rompersi.
   4. Posizionare un becher pieno di _ddH2O nell'incubatore per mantenere l'umidità all'interno dell'incubatore. Incubare le piastre dello sciame gradiente a 37 °C.
      NOTA: non incubare le piastre dello sciame capovolte; questo farà sì che la coltura batterica fuoriesca dai pozzetti.
   5. Immagina la piastra dello sciame subito dopo l'inoculazione, registrandola come il punto temporale 0 h .

4. Imaging dello sciame di superficie batterica

1. Estrarre le piastre dello sciame, una alla volta, dall'incubatrice ogni 12 ore, tenendo la piastra orizzontalmente, e posizionarle nel sistema di imaging del gel (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: non lasciare impronte digitali sulla superficie delle piastre; tenere il lato della piastra dello sciame con guanti puliti.
2. Selezionare la modalità di imaging del gel ; esporre la piastra dello sciame alla luce bianca; e regola la lunghezza focale per dare la visione più chiara degli sciami.
   NOTA: utilizzare la stessa lunghezza focale per tutte le piastre di un determinato lotto.
3. Migliora la luminosità degli sciami per una chiara osservazione regolando il tempo di esposizione a 300 ms. Regolare la soglia per ridurre al minimo le interferenze provenienti dalla luce di sfondo.
   NOTA: la soglia viene regolata sull'interfaccia operativa del sistema di imaging del gel. Aumentare i valori a sinistra per ridurre al minimo le interferenze della luce di sfondo; diminuire i valori a destra per migliorare la luminosità degli sciami. In questo protocollo, la regione è solitamente compresa tra 6.000 e 50.000.
4. Salvare il file immagine per ulteriori analisi. Registrare il tempo di imaging, il tipo di induttore, l'orientamento del gradiente e le deformazioni in un file .txt .

5. Quantifica l'area dello sciame utilizzando il software ImageJ

1. Importare il file immagine acquisito utilizzando il sistema di imaging su gel.
2. Impostare la barra di scala utilizzando il software ImageJ e applicarla a tutte le immagini.
   1. Create un segmento di linea che segni la lunghezza della scheda facendo clic sullo strumento linea.
   2. Fai clic su Analizza | Imposta scala per aprire la finestra Imposta scala .
   3. Digitare la lunghezza effettiva in Distanza nota e Unità di lunghezza.
      NOTA: Poiché in questo lavoro sono state utilizzate piastre di Petri quadrate di 13 x 13 cm, la lunghezza effettiva è "130" e l'unità di lunghezza è "mm".
   4. Seleziona la casella Globale .
   5. Inserire una barra di scala facendo clic su Analizza | Strumenti | Barra di scala, digita Larghezza in mm, Altezza in pixel, Dimensione carattere e seleziona Colore, Sfondo e Posizione dal menu a discesa. In alternativa, scegli Testo in grassetto, Nascondi testo, Carattere Serif e Sovrapposizione spuntando le caselle di controllo.
      NOTA: la scelta di tali parametri è determinata dagli utenti e dalle proprietà delle immagini. In questo protocollo, Larghezza in mm è stata impostata su 25, Altezza in pixel su 20, Dimensione carattere su 80 e la barra della scala è stata posizionata nell'angolo in basso a destra selezionando Posizione | In basso a destra. Altri parametri possono essere scelti dall'utente.
3. Fai clic su | processo Ombre per migliorare la nitidezza dell'immagine, in particolare i confini (Figura supplementare S2A). Fai clic su | processo Batch per elaborare le immagini.
   Nota : lo scopo di questo passaggio è fornire una demarcazione dei limiti più precisa.
   1. Elaborare un'immagine come riferimento facendo clic su Elabora | Ombre | Sud.
   2. Fai clic su | processo | batch Macro per aprire la finestra Processo batch . Cerca i seguenti comandi visualizzati nella finestra:
      run("Sud");
      run("Salva");
      chiudi();
   3. Digitare l'indirizzo della cartella delle immagini originali e l'indirizzo del file di output facendo clic su Elabora nella finestra Processo batch .
      NOTA: si consiglia di esportare le immagini con ombre in un'altra cartella e conservare una copia delle immagini originali.
4. Utilizzate lo strumento Bacchetta (traccia) per selezionare gli sciami singolarmente e regolare la tolleranza ( strumento Bacchetta (traccia) con doppio clic) finché la linea generata non si adatta correttamente al limite dello sciame (Figura supplementare S2B).
   NOTA: per prima cosa, fare clic sullo strumento Bacchetta (traccia) e selezionare uno sciame su un'immagine. Se i limiti non sono stati rappresentati correttamente, fate doppio clic sullo strumento bacchetta (traccia) per aprire le finestre dello strumento bacchetta , in cui è possibile regolare la tolleranza .
5. Clicca su Analizza | Misura per esportare il valore dell'area.
6. Ripetere i passaggi 5.1.1-5.1.5 fino a quando tutti gli sciami non vengono misurati, salvare i risultati in un file .csv per ulteriori analisi.

Risultati

Il flusso di lavoro costituito dalla preparazione di piastre di sciame gradienti, inoculazione e incubazione è mostrato nella Figura 1B. Per generare piastre nuotate sfumate, il mezzo dello strato inferiore viene versato in piatti appoggiati a ~ 4,3 ° dal piano orizzontale (Figura supplementare S3), seguito dal versamento del mezzo dello strato superiore dopo che lo strato inferiore è stato completamente solidificato. La composizione del mezzo a doppio strato è mostrata ...

Discussione

Lo studio della motilità dello sciame batterico su piastre a gradiente semisolido può essere un compito ^{impegnativo18,19,20}, in quanto coinvolge molteplici fattori come la viscosità del substrato, l'umidità e i componenti medi. Tra questi fattori, la concentrazione di agar svolge un ruolo decisivo nel determinare la reversione microbica alla motilità del nuoto o dello sciame. Man mano che la concentrazione di agar aumenta d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Cryogenic vial	Corning	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm
Resveratrol	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	AR, 99.5% (GC), 500 g
Square Petri dishes	Bkman	B-SLPYM130F	Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Yeast extract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Equipments
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28