Un modelo de trasplante renal ortotópico de rata para el rechazo del aloinjerto renal

Resumen

El modelo de trasplante renal ortotópico de rata contribuye a investigar el mecanismo de rechazo del aloinjerto renal. El modelo actual aumenta la supervivencia de los receptores sin interferencia con el suministro de sangre y el reflujo venoso de la parte inferior del cuerpo utilizando una anastomosis de extremo a extremo de la implantación renal y un método de "túnel" de extremo a lado de anastomosis uréter-vejiga.

Resumen

El rechazo del aloinjerto renal limita la supervivencia a largo plazo de los pacientes después del trasplante renal. El trasplante renal ortotópico de rata es un modelo esencial para investigar el mecanismo de rechazo del aloinjerto renal en estudios preclínicos y podría ayudar en el desarrollo de nuevos enfoques para mejorar la supervivencia a largo plazo de los aloinjertos renales. La implantación renal de donante en el trasplante renal ortotópico de rata se realiza comúnmente mediante anastomosis de extremo a lado en la aorta de los receptores y la vena cava inferior. En este modelo, el riñón del donante se implantó mediante anastomosis de extremo a extremo en la arteria renal y la vena renal de los receptores. El uréter del donante se anastomosó a la vejiga del receptor en un método de "túnel" de extremo a lado. Este modelo contribuye a una mejor curación de la anastomosis uréter-vejiga y aumenta la supervivencia de los receptores al evitar la interferencia con el suministro de sangre y el reflujo venoso de la parte inferior del cuerpo. Este modelo se puede utilizar para investigar los mecanismos de rechazo inmune y patológico agudo y crónico de los aloinjertos renales. Aquí, el estudio describe los protocolos detallados de este trasplante renal ortotópico entre ratas.

Introducción

El trasplante renal se ha convertido en el enfoque terapéutico más eficaz para los pacientes con insuficiencia de la función renal en etapa terminal. Sin embargo, el rechazo agudo mediado por células T y el rechazo inmune humoral mediado por aloanticuerpos resultan en la lesión patológica de los aloinjertos renales y limitan la supervivencia a corto y largo plazo de los pacientes después del trasplante renal ^1,2,3. Desafortunadamente, todavía faltan los productos farmacéuticos efectivos que previenen el rechazo de los aloinjertos renales, porque los mecanismos exactos de rechazo inmunológico y patológico de los aloinjertos renales no están claros. En consecuencia, los estudios preclínicos que dilucidan los mecanismos de rechazo inmune y patológico de los aloinjertos renales contribuyen a encontrar nuevas dianas y desarrollar fármacos eficaces relevantes para prevenir el rechazo de los aloinjertos renales y, finalmente, prolongar la supervivencia de los pacientes.

Muchos posibles mecanismos inmunológicos y fisiopatológicos de rechazo del aloinjerto renal se han propuesto recientemente en estudios de modelos de ratas de trasplante renal ortotópico 4,5,6,7,8. Estos hallazgos proponen varias dianas novedosas y enfoques de interferencia relevantes como terapias prometedoras para suprimir el rechazo del aloinjerto renal, como los factores reguladores del complemento y los anticuerpos anti-CD59⁶, el inmunoproteasoma y los inhibidores de la epoxicetona ^7,8. Por lo tanto, el trasplante renal ortotópico de rata es un modelo preclínico ideal para investigar los mecanismos de rechazo inmune y lesión patológica de los aloinjertos renales después del trasplante renal.

El trasplante renal de rata ha pasado gradualmente de la implantación heterotópica de los riñones del donante⁹ a la implantación renal ortotópica mediante anastomosis de extremo a lado de los vasos o mediante anastomosis de extremo a extremo del uréter mediante un método de manguito 10,11,12. El presente estudio describe protocolos detallados del trasplante renal ortotópico entre ratas utilizando anastomosis de extremo a extremo a la arteria renal y la vena renal de los receptores, y un método de "túnel" de extremo a lado de anastomosis uréter-vejiga, que evita la isquemia de la parte inferior del cuerpo y la trombosis de la vena cava inferior y reduce la pérdida de orina postoperatoria y la torsión del uréter.

Protocolo

Se obtuvieron comercialmente machos endogámicos de 8-10 semanas de edad F344 y ratas Lewis (200 g a 250 g). El trasplante alogénico de riñón izquierdo se realizó entre ratas macho F344 y Lewis. Las ratas F344 se utilizaron como donantes y receptores singénicos, y las ratas Lewis sirvieron como receptoras alogénicas. Todos los procedimientos de manejo de animales se llevaron a cabo de conformidad con las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicadas por los NIH, y todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Cáncer de la Universidad de Chongqing. Todos los suministros utilizados durante la cirugía, incluidos los instrumentos quirúrgicos y las soluciones, son estériles. En la figura 1 se muestra un esquema del protocolo.

1. Procedimiento del donante

1. Inducir anestesia general en la rata mediante inhalación de isoflurano al 5% utilizando una cámara de inducción. Luego, inyecte buprenorfina por vía subcutánea a 0,1 mg / kg para realizar analgesia preventiva concurrente.
2. Coloque la rata sobre su espalda y mantenga la anestesia con inhalación de isoflurano al 2% usando una máscara facial sobre su nariz y boca. Aplique lubricante para los ojos en los ojos para evitar el secado de la córnea. La frecuencia y el ritmo respiratorios lentos, la desaparición del reflejo corneal y la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie indican la efectividad de la anestesia.
3. Afeitar el vello abdominal con una maquinilla de afeitar eléctrica y esterilizar la piel con 0,5% de yodo y 70% de alcohol.
4. Inyecte por vía subcutánea lidocaína al 0,5% a lo largo de la línea media desde la sínfisis del pubis hasta el subxifoideo para analgésicos locales, y luego incise el abdomen y abra la incisión con un retractor.
5. Saque los intestinos del lado derecho de la incisión y envuélvalos con una gasa humedecida para evitar que se sequen. Luego, exponga el riñón izquierdo.
6. Segregue los tejidos grasos del riñón izquierdo y el uréter usando hisopos de algodón, y luego disocie la arteria y la vena renal izquierda usando las microfórceps bajo un microscopio quirúrgico con un aumento de 20x. Coagule cualquier sangrado mediante electrocoagulación, si es necesario.
7. Realizar ligadura de la aorta aproximadamente 5 mm por encima de la arteria renal izquierda con una sutura de monofilamento de poliamida 4-0. Luego, transecte la vena renal izquierda distal a la conjunción de la vena genital izquierda y la vena suprarrenal.
8. Enjuague el riñón con una solución de UW helada suplementada con heparina (100 U/mL) con una aguja de cuero cabelludo de 24 G desde la aorta debajo de la arteria renal izquierda hasta que la sangre se desvanezca en color. El tiempo de isquemia caliente es de 5 minutos en promedio.
9. Después de transectar la arteria renal izquierda aproximadamente 2 mm junto a la aorta, disociar el riñón y el uréter con la ayuda de microfórceps (preservar los tejidos conectivos periféricos para garantizar el suministro de sangre al uréter). Luego, transecte el uréter junto a la vejiga y conserve el riñón izquierdo del donante en una solución de UW helada.
10. Sacrifique la rata donante con pérdida de sangre transectando la aorta y posteriormente colocándola en una caja de CO₂ para asegurar la muerte.

2. Procedimiento del destinatario

1. Repita el procedimiento descrito en los pasos 1.1-1.5 para la rata receptora.
2. Disociar el riñón izquierdo y el uréter, así como la arteria renal izquierda y la vena renal de la rata receptora utilizando hisopos de algodón y microfórceps bajo un microscopio quirúrgico con un aumento de 20x.
3. Recorte la arteria renal izquierda y la vena renal en la raíz mediante pinzas microvasculares no invasivas. Ligar el uréter izquierdo aproximadamente 2-3 cm por debajo del riñón con un 8-0 poliamida monofilamento sutura y transectarlo en la ligadura.
4. Reseque el riñón izquierdo nativo del receptor transectando la arteria renal izquierda a 2 mm de distancia de la pinza microvascular y transectando la vena renal proximal a la conjunción de la vena genital izquierda y la vena suprarrenal. Coagular la vena suprarrenal mediante electrocoagulación, si es necesario.
5. Implantar el riñón del donante en la fosa renal izquierda de la rata receptora y colocar hielo alrededor del riñón del donante implantado. Anastomosa la arteria renal y la vena renal del donante a la arteria renal y la vena renal del receptor en un patrón de extremo a extremo utilizando suturas de monofilamento de poliamida 10-0 bajo un microscopio quirúrgico con aumento de 45x, de la siguiente manera.
6. Anastomosa la arteria renal con suturas interrumpidas.
   1. Coloque las suturas de estancia en las posiciones 12 y 6 en punto de anastomosis, respectivamente. Sutura equidistante un lado de la anastomosis entre las dos suturas de permanencia con 2-3 puntos de sutura utilizando una sutura de monofilamento de poliamida 10-0.
   2. Voltee las suturas de estancia y suture de manera similar el otro lado de la anastomosis entre las dos suturas de estancia con 2-3 puntos de sutura.
7. Anastomosa la vena renal con suturas continuas.
   1. Coloque las suturas de estancia en las posiciones de anastomosis a las 6 y 12 en punto, respectivamente. Sutura un lado de la anastomosis desde la posición de las 12 en punto con 4-5 puntos de sutura usando las suturas en ejecución, y luego atar la sutura de carrera a la sutura de permanencia en la posición de las 6 en punto con una sutura de monofilamento de poliamida 10-0.
   2. Gire las suturas de la estancia y sutura de manera similar el otro lado de la anastomosis desde la posición de las 6 en punto, y finalmente ate la sutura de carrera a la sutura de la estancia en la posición de las 12 en punto.
8. Vuelva a perfundir el riñón del donante liberando primero la pinza microvascular no invasiva de la vena renal; luego, identifique los sitios de sangrado y haga puntos adicionales.
9. Suelte la pinza microvascular no invasiva de la arteria renal, identifique los sitios de sangrado y haga puntos adicionales. El tiempo de isquemia fría es de 45 minutos en promedio.
10. Sutura el extremo del uréter donante con una sutura de monofilamento de poliamida 4-0 como remolque para arrastrar el extremo a través del "túnel" de la vejiga del receptor bajo un microscopio quirúrgico con un aumento de 20x. Después, transecte el extremo del uréter donante con la sutura fuera de la vejiga del receptor. Deje que el uréter del donante se encoja de nuevo en la vejiga del receptor.
11. Fije el uréter del donante con la vejiga del receptor cosiendo la adventicia del uréter del donante con la capa muscular de la vejiga del receptor afuera en cuatro posiciones equidistantes usando un 8-0 sutura de monofilamento de poliamida bajo un microscopio de funcionamiento con aumento de 45x.
12. Coloque los intestinos de nuevo en la cavidad abdominal y cierre la incisión abdominal con suturas continuas en la capa muscular primero y luego la capa de la piel con una sutura de monofilamento de poliamida 4-0.
13. Coloque la rata receptora en una almohadilla térmica de 37 ° C en una jaula seca y limpia. Espere hasta que la rata se recupere de la anestesia.
14. Inyecte subcutáneamente buprenorfina (0,05 mg/kg) en la rata receptora cada 6 h durante 48 h para la analgesia postoperatoria. Inyecte penicilina por vía intramuscular (50,000 U / kg) en la rata receptora una vez al día durante 3 días para la prevención de la infección. La rata receptora se sacrifica colocándola en una caja de CO₂ para observar el rechazo crónico del aloinjerto renal después de 10 semanas de trasplante.

Resultados

En este modelo de trasplante renal ortotópico de rata, las ratas receptoras se mueven normalmente después de la operación. Para observar el rechazo crónico del aloinjerto renal, las ratas receptoras se crían durante 10 semanas después del trasplante, y la tasa de supervivencia total de las ratas receptoras en este punto de tiempo es de aproximadamente el 90%. Las principales causas de muerte son el sangrado y la pérdida de orina después de la operación. Las otras complicaciones importantes incluyen sangrado dura...

Discusión

El trasplante renal en la rata es un trabajo desafiante que requiere un alto nivel de técnicas de microcirugía y las técnicas de operación se han optimizado varias veces. Desde el principio, González et al. implantaron el riñón del donante en el cuello del receptor y anastomosed el uréter del donante a la piel⁹. Sin embargo, debido a la alta incidencia de infección urinaria y estenosis del uréter donante, la operación se abandonó en poco tiempo. Posteriormente, la operación de implant...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
4-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C1048451
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Electrocoagulator	ZJ1099
F344 and Lewis rats	Center of Experimental Animals (Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China)	NA
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
Injection syringe (1 ml and 10 ml)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Penicillin G Sodium	Wuhan HongDe Yuexin pharmatech co.,Ltd	69-57-8
Scalp needle (24 G)	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science	R500
Small Animal Surgery Kit	Beyotime	FS500
Sodium chloride injection	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274
Tape	Minnesota Mining Manufacturing Medical Equipment (Shanghai) Co., LTD	1911N68
UW solution	Bristol-Myers Squibb Company	17HB0002