Análisis de alto rendimiento del enfriamiento no fotoquímico en cultivos mediante fluorometría de clorofila modulada por amplitud de pulso

Resumen

El protocolo introduce un método de alto rendimiento para medir la relajación del enfriamiento no fotoquímico mediante fluorometría de clorofila modulada por amplitud de pulso. El método se aplica a Glycine max cultivada en el campo y se puede adaptar a otras especies para detectar la diversidad genética o las poblaciones reproductoras.

Resumen

La fotosíntesis no está optimizada en las variedades de cultivos modernos y, por lo tanto, brinda una oportunidad de mejora. Acelerar la relajación del enfriamiento no fotoquímico (NPQ) ha demostrado ser una estrategia efectiva para aumentar el rendimiento fotosintético. Sin embargo, el potencial de reproducirse para mejorar el NPQ y una comprensión completa de la base genética de la relajación del NPQ es deficiente debido a las limitaciones del sobremuestreo y la recopilación de datos de las plantas de cultivo cultivadas en el campo. Sobre la base de informes anteriores, presentamos un ensayo de alto rendimiento para el análisis de las tasas de relajación de NPQ en Glycine max (soja) utilizando fluorometría de clorofila de amplitud modulada por pulso (PAM). Los discos de hoja se muestrean de soja cultivada en el campo antes de su transporte a un laboratorio donde se mide la relajación de NPQ en un fluorómetro PAM cerrado. Los parámetros de relajación de NPQ se calculan ajustando una función biexponencial a los valores de NPQ medidos después de una transición de luz alta a baja. Usando este método, es posible probar cientos de genotipos en un día. El procedimiento tiene el potencial de detectar paneles mutantes y de diversidad para detectar la variación en la relajación de NPQ y, por lo tanto, se puede aplicar tanto a preguntas de investigación fundamentales como aplicadas.

Introducción

La fotosíntesis consiste en la absorción de luz, la transferencia primaria de electrones, la estabilización de energía y la síntesis y transporte de productos fotosintéticos¹. Comprender cada paso es vital para guiar los esfuerzos para aumentar la eficiencia fotosintética de los cultivos. La luz afecta la velocidad de la fotosíntesis, lo que requiere equilibrar el suministro de energía, en forma de fotones, con la demanda de equivalentes reductores. Cuando la oferta excede la demanda, por ejemplo, bajo mucha luz o durante la fijación reducida de CO₂ causada por el cierre estomático, la acumulación de potencia reductora aumenta la probabilidad de formación de especies reactivas de oxígeno con el potencial de dañar el aparato fotosintético y perjudicar el transporte de electrones. Por lo tanto, para prevenir daños, las plantas han desarrollado varios mecanismos de fotoprotección, incluida la desintoxicación de especies reactivas de oxígeno y el enfriamiento no fotoquímico de los estados de clorofila excitada (NPQ)².

Mantener altas tasas de fotosíntesis es un desafío en un entorno de campo. Los cambios estacionales y diurnos, junto con las fluctuaciones ambientales, como los movimientos de las hojas inducidos por el viento y la nubosidad transitoria, causan cambios en la cantidad e intensidad de la luz recibida por las plantas para la fotosíntesis³. NPQ disipa el exceso de energía de la luz y puede ayudar a prevenir el daño fotográfico al tiempo que permite tasas sostenidas de fotosíntesis con mucha luz⁴. Sin embargo, la NPQ prolongada durante las transiciones de alta a baja luz continúa disipando la energía que podría usarse para la reducción de carbono⁵. Como resultado, acelerar la relajación de NPQ puede aumentar la eficiencia de la fotosíntesis⁶, haciendo de la relajación de NPQ un objetivo atractivo para la mejora de cultivos.

El análisis de fluorescencia de clorofila modulada por amplitud de pulso (PAM) se puede utilizar para calcular el NPQ a partir de parámetros medibles (Tabla suplementaria 1 y Tabla suplementaria 2)^7,8,9. Este artículo se centra en determinar las tasas de relajación de NPQ en plantas cultivadas en el campo con el fin de detectar la variación natural en el germoplasma. Sin embargo, el análisis de fluorometría de clorofila PAM también se puede utilizar para una amplia variedad de propósitos, aplicado a especies que van desde algas hasta plantas superiores, y se revisa en otros lugares ^7,8,9.

En una hoja o célula adaptada a la oscuridad, los centros de reacción del fotosistema II (PSII) están abiertos para recibir electrones y no hay NPQ. Encender una luz de medición de baja intensidad provoca fluorescencia de clorofila al tiempo que evita el transporte de electrones a través de PSII. La fluorescencia mínima registrada en este estado adaptado a la oscuridad se describe mediante el parámetro F_o. La aplicación de un pulso de luz de alta intensidad a una hoja adaptada a la oscuridad puede reducir rápidamente el primer grupo estable de aceptores de electrones de quinonas unidas al sitio de la quinona A. Esto bloquea temporalmente la capacidad de transferencia de electrones en los centros de reacción PSII, que luego se dice que están cerrados y no pueden recibir electrones de la división del agua. Al usar una duración de pulso corta, no hay tiempo suficiente para estimular npq. La fluorescencia de clorofila resultante es equivalente al valor máximo obtenible en ausencia de NPQ, o fluorescencia máxima, F_m. La diferencia entre fluorescencia mínima y máxima se conoce como fluorescencia variable, F_v. El rendimiento cuántico fotoquímico máximo del fotosistema II (F_v/F_m) se calcula a partir de estos dos parámetros utilizando la siguiente ecuación:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Esto puede proporcionar un indicador importante de la función del fotosistema y el estrés. Encender una luz actínica (fotosintética) estimula el enfriamiento no fotoquímico, y la posterior aplicación de un flash saturador permite la medición de la fluorescencia máxima adaptada a la luz, F_m'. Al comparar la diferencia entre la fluorescencia máxima oscura y la adaptada a la luz, el NPQ se puede calcular de acuerdo con la ecuación de Stern-Volmer¹⁰:

NPQ = F_m/F_m' - 1

En plantas superiores, se ha descrito que npQ consta de al menos cinco componentes distintos, incluidos qE, qT, qZ, qI y qH. Los mecanismos precisos que intervienen en el PNP no se comprenden plenamente; sin embargo, qE se considera el componente principal de NPQ en la mayoría de las plantas. Se ha encontrado que los factores cruciales para la participación total de la qE incluyen la acumulación de un gradiente de protones a través de la membrana tilacoidea, la actividad del fotosistema II subunidad S ^11,12 y las xantofilas desoxidadas, la anteraxantina, la luteína y, en particular, la zeaxantina¹³. qE relaja el más rápido de cualquier componente NPQ (< 2 min)¹⁴, y la activación reversible de qE es, por lo tanto, particularmente importante para la adaptación a las intensidades de luz cambiantes. Una segunda fase más lenta de relajación de NPQ (~ 2-30 min) abarca tanto qT, relacionada con las transiciones de estado, como qZ, que implica la interconversión de zeaxantina a violaxantina¹⁵. La relajación lenta (> 30 min) de NPQ puede incluir tanto el enfriamiento fotoinhibitorio (qI)¹⁶ como procesos independientes del fotodaño^17,18, como qH, que es un enfriamiento sostenido en las antenas periféricas de PSII mediado por una proteína plastid lipocalina^19,20.

La NPQ aumenta durante la exposición a la luz alta. La transferencia posterior a poca luz puede resultar en una regulación a la baja del NPQ. La desintegración de las fases relajantes rápidas, intermedias y lentas se puede capturar en los parámetros de una función^{biexponencial} 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

La base teórica para la función biexponencial se basa en el supuesto de la utilización de primer orden de quenchers hipotéticos, incluyendo qE (Aq1), la relajación combinada de qZ y qT (Aq2), con las correspondientes constantes de tiempo τq1 y τq2, y NPQ a largo plazo, que incluye qI y procesos independientes de fotodaño (Aq3). Como tal, la función biexponencial proporciona una representación más realista de los múltiples procesos biológicos conectados involucrados en el enfriamiento de la fluorescencia de clorofila en comparación con una ecuación de Hill más simple que carece de una base teórica²⁴.

NpQ se puede medir utilizando una variedad de fluorómetros PAM disponibles comercialmente^25,26, desde simples dispositivos de mano²⁷ hasta sistemas cerrados más avanzados²⁸. Sin embargo, una limitación de varios de estos enfoques es un rendimiento relativamente bajo, lo que hace que la detección de grandes colecciones de plantas sea un desafío sin múltiples dispositivos y un equipo de investigadores. Para abordar este problema, McAusland et al. desarrollaron un procedimiento basado en el tejido foliar extirpado y lo utilizaron para identificar diferencias en la fluorescencia de clorofila entre dos cultivares de trigo²⁹. El atractivo de este enfoque es que la obtención de imágenes de discos de hojas, tomadas de múltiples plantas con un solo dispositivo, puede facilitar la detección de cientos de genotipos en un día. Esto permite evaluar la variación en la relajación de NPQ como parte de los estudios de asociación de todo el genoma, o para detectar poblaciones reproductoras con el potencial de aumentar la eficiencia fotosintética de los cultivos y, en última instancia, el rendimiento.

Sobre la base de los hallazgos de McAusland et ^al.29, utilizamos el análisis de fluorescencia de clorofila PAM de discos foliares para el cribado de alto rendimiento de las tasas de relajación de NPQ en Glycine max (G.max; soja). Este protocolo utiliza el CF Imager²⁵, que es comparable a otros sistemas pam cerrados disponibles comercialmente, como la popular FluorCam²⁶. Con una sala oscura para la adaptación de muestras, los usuarios pueden obtener imágenes de placas de 96 pocillos, placas de Petri y plantas pequeñas. La ventaja clave de este enfoque es el aumento en el rendimiento que ofrece el uso de discos de hoja en comparación con el análisis secuencial de plantas individuales. A continuación presentamos resultados representativos y un método para el muestreo, la medición y el análisis de NPQ en plantas cultivadas en el campo.

Protocolo

1. Siembra de semillas

1. Elija un sitio de campo con suelo fértil, bien drenado, pero no arenoso, y con un pH de casi 6.5. Marque parcelas de 1,2 m de fila con un espaciado de 0,75 m anotando el suelo con una azada.
2. Plantar 50 semillas/m de G.max cv. IA3023 a 3 cm de profundidad a lo largo de cada parcela al comienzo de la temporada de crecimiento cuando las temperaturas del suelo estén entre 25 y 30 °C.
   NOTA: Con el propósito de evaluar la diversidad genética, se espera que se cultiven y comparen múltiples genotipos diferentes. Planta 2-5 filas por genotipo dispuestas en un diseño de bloque aleatorio. Se debe considerar si las condiciones climáticas se adaptan al crecimiento de la soja, incluido el tipo de suelo, la temperatura y la duración del día.

2. Recolección de muestras de hojas del campo

1. Muestree las plantas en el sitio de campo 30 días después de la germinación.
   NOTA: Después de 30 días las plantas de soja estarán en fase vegetativa. El número de días posteriores a la germinación antes del muestreo depende de la cuestión biológica que se aborde.
2. Llene los pocillos de una placa de 24 pocillos hasta 1^{/3 con} agua destilada. Etiquete la tapa y el lado de la placa con las réplicas que se van a muestrear.
3. Seleccione la hoja completamente expandida más joven en la parte superior de la planta que se va a muestrear. Sostenga la hoja contra un tapón de goma.
4. Presione un barrenador de corcho de Humboldt # 2 a través de la hoja y gire para cortar un disco mientras evita la costilla media. Recolecte consecutivamente 5 discos de la misma hoja para réplicas técnicas. Tome aproximadamente un 30% más de discos de hoja para cada parcela de lo requerido en caso de que el tejido de la hoja se dañe en tránsito o por muestreo.
   NOTA: El número de réplicas biológicas (parcelas o plantas) y el número de réplicas técnicas (discos de hojas de la misma planta o parcela) pueden variar según el diseño experimental.
5. Empuje los discos de hojas fuera del barrenador del corcho en un solo pozo de una placa de 24 pocillos con un hisopo de algodón. Compruebe que todos los discos de hojas están flotando en el agua. De lo contrario, mueva suavemente los discos de hojas pegados al costado de un pozo en una posición flotante con un hisopo de algodón.
6. Pase a la siguiente gráfica y repita los pasos 2.3 a 2.5. Empuje los discos de hojas fuera del barrenador del corcho en un pozo separado en una placa de 24 pocillos con un hisopo de algodón. Repita este paso para recolectar una tercera réplica biológica.
7. Repita el paso 2.6 hasta que se haya muestreado una placa completa de 24 pocillos. Coloque una tapa y selle con una película semitransparente y flexible. Guarde el plato fuera de la luz solar directa, en una bolsa, caja o refrigerador vacío (sin hielo).

3. Preparación de muestras para el análisis

1. Regrese a un espacio de laboratorio limpio después del muestreo. Toque la tapa de la placa sellada para desalojar los discos de hojas pegados a la tapa durante el transporte. Desenvuelva la película y retire la tapa.
2. Transfiera un disco de hoja desde la primera posición de la placa de 24 pocillos a una placa fresca de 96 pocillos, con el disco de hoja mirando hacia abajo en la parte inferior del pozo.
3. Corte un filtro aspirador nasal por la mitad. Sumerja el filtro resultante hasta la mitad en agua y aplique una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Inserte el filtro en el pozo con el disco de hoja para mantener la humedad.
4. Tome un segundo disco de hoja de la primera posición de la placa de 24 pocillos y colóquelo boca abajo en la siguiente posición disponible de la placa de 96 pocillos. Sumerja la mitad restante del filtro nasal producido en el paso 3.3 en agua y aplique una toalla de papel antes de insertarlo en el pozo con el segundo disco de hoja.
5. Repita los pasos 3.3 a 3.4 para un disco de tercera hoja desde la primera posición de la placa de 24 pocillos.
6. Pase a la segunda posición de la placa de 24 pocillos y repita los pasos 3.3 a 3.5.
7. Coloque la tapa en la placa cuando todos los pocillos tengan discos de hojas y filtros aspiradores nasales insertados. Pega con cinta adhesiva la esquina superior derecha para ayudar a orientar la placa en la oscuridad para obtener imágenes.
8. Selle las placas con una película semitransparente y flexible y envuelva la placa en papel de aluminio. Escriba los ID de la trama y la identificación de la placa en el papel de aluminio.
9. Coloque las placas en una caja oscura o gabinete durante un mínimo de 30 minutos, para permitir la relajación de las dos primeras fases de NPQ (qE, qT, qZ). Use un período de incubación más largo y oscuro de 1 h antes de obtener imágenes si las fases a largo plazo de NPQ son de interés.
10. Prepare una placa ficticia adicional para enfocar durante el análisis. Para hacer esto, coloque un disco de hoja en cada una de las esquinas de una placa fresca de 96 pocillos y una en el centro. Asegure los discos de hojas con filtros nasales como se hizo con las placas anteriores. Selle la placa e incube en la oscuridad a temperatura ambiente (24 ° C), ~ 50% de humedad relativa.

4. Medición del enfriamiento no fotoquímico utilizando imágenes de fluorescencia de clorofila

1. Encienda el generador de imágenes y abra el software de imágenes. Haga clic en Configuración > Protocolo para abrir una ventana para la entrada de pasos en el protocolo experimental PAM. Las especificaciones técnicas de la máquina se proporcionan en la Tabla suplementaria 3.
2. Configure el programa para que comience con un pulso saturado para medir la máxima eficiencia cuántica de la fotosíntesis adaptada a la oscuridad ingresando 20 s en la caja: Después de un retraso de. Haga clic en la casilla Aplicar pulso e ingrese 1 en el cuadro: Este número de veces.
3. Establezca el PPFD de pulso en 6152, la longitud del pulso en 800 ms y marque la casilla Tomar imágenes F' & Fm' con todos los pulsos. Haga clic en Insertar después para agregar un segundo paso al protocolo.
4. Introduzca 30 s en la casilla: Después de un retraso de. Seleccione la opción Cambiar actínico e introduzca 50 en la casilla: PPFD actínico, para ajustar la intensidad de la luz en la cámara a 50 PPFD.
5. Haga clic en Insertar después para agregar un nuevo paso al protocolo. Introduzca 150 s en la caja: Después de un retraso de, seleccione Aplicar pulso e introduzca 4 en la caja: Este número de veces, para aplicar pulsos de medición cada 150 s, 4 veces seguidas mientras la luz actínica se mantiene a 50 PPFD.
6. La información completa del protocolo se proporciona en la Tabla 1, use los pasos 4.2 y 4.3 para cambiar la intensidad de la luz y los pasos 4.4 y 4.5 para ingresar ciclos de pulsos saturadores. Ajuste el retardo y la intensidad de la luz para cada paso de acuerdo con los valores proporcionados en la Tabla 1. Guarde el protocolo como un archivo .pcl en una ubicación conocida.
7. Apague la luz, coloque la placa ficticia en el escenario de muestra y ajuste la altura del escenario de muestra para que los discos de hoja estén 140 mm por encima de la base del instrumento. Se utiliza una placa ficticia ya que la luz se parpadeará repetidamente en la placa al enfocar; esto requerirá una adaptación a la oscuridad de cualquier muestra que se vaya a medir y puede causar fotodaño.
8. Haga clic en el icono Conectar/Desconectar a la cámara y la cámara de hardware de Imager para iniciar la cámara. Haga clic en el símbolo De enfoque (fluorescencia) representado por un icono de flecha de dos caras de color rojo con dos líneas verdes en la base. Ajuste la lente y la exposición para enfocar la placa.
9. Haga clic de nuevo en el icono Enfoque (fluorescencia) para apagar la luz intermitente. Trabajando en la oscuridad, reemplace la placa ficticia con la placa a analizar.
10. Haga clic en el icono de la cámara Map Image . Ajuste la exposición de la imagen abriendo o cerrando la abertura hasta que la barra de la ventana emergente se coloque en la zona verde.
11. Haga clic en el botón Volver a intentarlo después de cada ajuste de la apertura hasta que la exposición se ajuste correctamente y el instrumento tome una imagen. Haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione Aplicar aislamiento de imagen para bloquear las señales de fondo. El área de la hoja enfocada se mostrará en gris y el fondo en azul.
12. Seleccione el área/píxeles de interés para incluir solo los discos de hojas ajustando el histograma y el nivel gamma en el menú desplegable Modificar imagen haciendo clic con el botón derecho en la imagen.
13. Haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione Eliminar cortes altos y bajos (mapa de color) para eliminar el área resaltada en azul claro. Haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione Eliminar extraviados (pesados) para eliminar los píxeles que no toquen al menos otros tres píxeles.
    NOTA: Cualquier área de la imagen que aparezca como islas aisladas se analizará por separado y se incluirá en la salida de datos final. El aislamiento de imágenes y la eliminación de píxeles perdidos dan como resultado datos limpios y comprensibles.
14. Haga clic en el icono Ejecutar protocolo para iniciar el programa, aparecerá un temporizador en la parte inferior de la pantalla que le informará cuánto tiempo le queda por ejecutar el protocolo.
15. Espere hasta que finalice el protocolo, haga clic en Archivo > Guardar como y guarde los datos como un archivo .igr. Cierre la ventana haciendo clic en la cruz roja en la parte superior derecha de la ventana antes de comenzar a ejecutar otra placa de muestra.
16. Abra un nuevo archivo para la siguiente muestra seleccionando Archivo > Nuevo y repita los pasos 4.10 a 4.15 hasta que se hayan medido todas las placas.
    NOTA: Es recomendable medir las placas dentro de un período de 4 h o menos para minimizar el impacto potencial de la regulación circadiana en los resultados.

5. Procesamiento de datos de fluorescencia de clorofila

1. Abra el archivo .igr en el software de imágenes. Exporte los datos haciendo clic en Archivo > Exportar a carpeta para crear una nueva carpeta con todos los archivos necesarios.
2. Copie los tres archivos matlab siguientes en la carpeta resultante: MapAndLabelDiscs.m (archivo complementario 1), ProcessFoFm.m (archivo complementario 2) y ProcessNPQdata.m (archivo complementario 3), y el archivo R: create_file_to_process. R (Expediente Complementario 4).
3. Abra MapAndLabelDiscs.m (archivo complementario 1) en MATLAB y ejecútelo. Guarde el mapa de discos de hoja numerados generados en una ventana emergente como un archivo .png para comprobar la numeración del disco de hoja más adelante.
4. Abra el archivo ProcessFoFm.m (Archivo suplementario 2) en MATLAB y ejecútelo para calcular los valores F_o y F_m para cada disco hoja. Ejecute ProcessNPQdata.m (Archivo suplementario 3) para calcular los valores de NPQ en cada punto de tiempo.
5. Abra el archivo create_file_to_process. R (Archivo Suplementario 4) en Rstudio y agregue la fecha al código en la línea 5. Agregue el número de placa a la línea 8 en create_file_to_process.R.
6. Corre create_file_to_process. R para consolidar los valores F_v/F_m y los datos NPQ en un archivo que lleva el nombre de los datos con el sufijo -cf-summary.csv. Compruebe la numeración del disco de hoja en el archivo cf-summary del paso 5.5 mediante el archivo .png del paso 5.3. Información complementaria relativa al número de parcela y a la adhesión.
7. Abra el script de R CF-data-processing_2.R (Archivo suplementario 5) y cambie la línea 13 a la ruta del directorio de trabajo. Cambie la línea 16 de CF-data-processing_2.R al nombre del archivo desde el paso 5.5.
8. Cambie la línea 48 en CF-data-processing_2.R por el nombre de un archivo de salida. Ejecute el script CF-data-processing_2.R para volver a formatear los datos para la conexión de curvas.
9. Abra el script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (archivo complementario 6) en MATLAB y cambie la línea 5 al nombre del archivo de salida del paso 5.8. Cambie la línea 85 en MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m a un nuevo nombre de archivo de salida. Ejecute el script MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m para calcular los parámetros de relajación de NPQ.

Resultados

La Figura 1A muestra una medición típica del NPQ en la soja cultivada en el campo. Las plantas se cultivaron en Urbana, IL (latitud 40.084604°, longitud -88.227952°) durante el verano de 2021, con semillas plantadas el 5 de junio. 2021. Los discos foliares fueron muestreados después de 30 días de siembra de semillas, y se realizaron mediciones con el protocolo proporcionado (Tabla 1). Se calcularon los valores de F_v/F_m y NPQ para cada disco fo...

Discusión

La elección cuidadosa y el manejo de los discos de hoja son fundamentales para obtener mediciones confiables de NPQ. En primer lugar, el daño al tejido, como el manejo brusco con pinzas, introducirá estrés, lo que resultará en valores bajos para la máxima eficiencia cuántica de la fotosíntesis. Las plantas no estresadas suelen tener valores de F_v/F_m de alrededor de 0,83¹⁸, con disminuciones significativas que indican una reducción en el rendimiento ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America