Terapia fotodinamica mediata dal Bengala Rosa per inibire la Candida albicans

Riepilogo

La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l'efficacia dell'aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.

Abstract

L'infezione invasiva da Candida albicans è una significativa infezione fungina opportunistica negli esseri umani perché è uno dei colonizzatori più comuni dell'intestino, della bocca, della vagina e della pelle. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, il tasso di mortalità della candidosi invasiva rimane ~ 50%. Sfortunatamente, l'incidenza di C. albicans resistente ai farmaci sta aumentando a livello globale. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire un trattamento alternativo o adiuvante per inibire la formazione di biofilm di C. albicans e superare la resistenza ai farmaci. L'aPDT mediato da Rose Bengal (RB) ha dimostrato un'efficace uccisione cellulare di batteri e C. albicans. In questo studio, viene descritta l'efficacia di RB-aPDT su C. albicans multiresistente ai farmaci. Una sorgente luminosa a diodi a emissione di luce verde (LED) fatta in casa è progettata per allinearsi con il centro di un pozzo di una piastra a 96 pozzetti. I lieviti sono stati incubati nei pozzetti con diverse concentrazioni di RB e illuminati con fluenze variabili di luce verde. Gli effetti di uccisione sono stati analizzati con il metodo di diluizione della piastra. Con una combinazione ottimale di luce e RB, è stata raggiunta l'inibizione della crescita a 3 log. Si è concluso che RB-aPDT potrebbe potenzialmente inibire C. albicans resistente ai farmaci.

Introduzione

C. albicans colonizza nel tratto gastrointestinale e genito-urinario di individui sani e può essere rilevato come microbiota normale in circa il 50% degli individui¹. Se si crea uno squilibrio tra l'ospite e l'agente patogeno, C. albicans è in grado di invadere e causare malattie. L'infezione può variare da infezioni locali della mucosa a insufficienza multiorgano². In uno studio di sorveglianza multicentrico negli Stati Uniti, circa la metà degli isolati di pazienti con candidosi invasiva tra il 2009 e il 2017 è C. albicans³. La candidemia può essere associata ad alti tassi di morbilità, mortalità, degenza ospedaliera prolungata⁴. I Centri statunitensi di controllo e prevenzione delle malattie hanno riferito che circa il 7% di tutti i campioni di sangue di Candida testati sono resistenti al farmaco antifungino fluconazolo⁵. L'emergere di specie di Candida resistenti ai farmaci solleva la preoccupazione di sviluppare una terapia alternativa o adiuvante agli agenti antimicotici.

La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prevede l'attivazione di un fotosensibilizzante specifico (PS) con la luce alla lunghezza d'onda di assorbimento di picco del PS⁶. Dopo l'eccitazione, il PS eccitato trasferisce la sua energia o elettroni alle molecole di ossigeno vicine e ritorna allo stato fondamentale. Durante questo processo, si formano specie reattive dell'ossigeno e ossigeno singoletto che causano danni alle cellule. aPDT è stato ampiamente utilizzato per uccidere i microrganismi dal 1990⁷. Uno dei vantaggi dell'aPDT è che più organelli sono danneggiati in una cellula dall'ossigeno singoletto e / o dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante l'irradiazione; pertanto, la resistenza all'aPDT non è stata trovata fino ad oggi. Inoltre, un recente studio ha riportato che i batteri sopravvissuti dopo l'aPDT sono diventati più sensibili agli antibiotici⁸.

Le sorgenti luminose utilizzate in aPDT includono laser, lampade alogene metalliche con filtri, luce nel vicino infrarosso e diodi emettitori di luce (LED)9,10,11,12. Il laser fornisce un'elevata potenza luminosa, solitamente superiore a 0,5 W/cm², che consente l'erogazione di una dose di luce elevata in un tempo molto breve. È stato ampiamente utilizzato nei casi in cui un tempo di trattamento più lungo è scomodo come aPDT per le infezioni orali. Lo svantaggio di un laser è che la sua dimensione spot di illuminazione è piccola, che va da poche centinaia di micrometri a 10 mm con un diffusore. Inoltre, le apparecchiature laser sono costose e richiedono una formazione specifica per funzionare. D'altra parte, l'area di irradiazione di una lampada alogena metallica con filtri è relativamente più grande¹³. Tuttavia, la lampada è troppo pesante e costosa. Le sorgenti luminose a LED sono diventate mainstream di aPDT in campo dermatologico perché è piccolo e meno costoso. L'area di irradiazione può essere relativamente grande con una disposizione array della lampadina a LED. L'intero viso può essere illuminato contemporaneamente⁹. Tuttavia, la maggior parte, se non tutte, le sorgenti luminose a LED disponibili oggi sono progettate per uso clinico. Potrebbe non essere adatto per esperimenti in un laboratorio perché occupa spazio e costoso. Abbiamo sviluppato un array di LED economico che è molto piccolo e può essere tagliato e assemblato da una striscia LED. I LED possono essere montati in diverse disposizioni per diversi progetti sperimentali. Diverse condizioni di aPDT possono essere completate in una piastra a 96 pozzetti o anche in una piastra a 384 pozzetti in un esperimento.

Rose bengal (RB) è un colorante colorato ampiamente utilizzato per migliorare la visualizzazione dei danni corneali negli occhi umani¹⁴. L'aPDT mediato da RB ha mostrato effetti di uccisione su Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans con un'efficienza approssimativamente paragonabile a quella del blu di Toluidina O¹⁵. Questo studio dimostra un metodo per convalidare l'effetto di RB-aPDT su C. albicans multiresistente.

Protocollo

1. Preparazione del sistema aPDT

1. Tagliare quattro diodi emettitori di luce verde (LED) da una striscia LED (vedere Tabella dei materiali) e allinearli con quattro pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (Figura 1).
   NOTA: i LED sono stati disposti in un array 4 x 3. Il retro del LED è stato fatto aderire a un dissipatore di calore per disperdere il calore durante l'irradiazione.
2. Misurare la frequenza di fluenza¹¹ del LED a 540 nm con un misuratore di potenza luminosa (vedi Tabella dei materiali). Vedere la Figura 1 supplementare per assicurarsi che la frequenza di fluenza del LED sia compresa tra 510-560 nm.
3. Mettere un ventilatore elettrico accanto alla piastra durante l'irradiazione per mantenere la temperatura costante (25 ± 1 °C)¹¹. Vedere la figura supplementare 2 per garantire che la temperatura costante del mezzo sia mantenuta durante l'irradiazione.

2. Coltivazione della forma di lievito di C. albicans

NOTA: Per gli esperimenti^viene utilizzato un C. albicans multiresistente (BCRC 21538 / ATCC 10231), resistente alla maggior parte degli antifungini, incluso il fluconazolo.

1. Determinare la sensibilità al farmaco antimicotico con un metodo di diffusione del disco seguendo il rapporto^{precedentemente pubblicato 17}.
2. Coltiva C. albicans in forme di lievito, ife e pseudoife a seconda degli ambienti microecologici¹⁸.
   NOTA: Le forme ife e pseudoife sono difficili per un calcolo accurato. La forma del lievito può essere calcolata con precisione al microscopio o con citometria a flusso. La temperatura durante la crescita cellulare determina la sua morfologia. A temperatura ambiente (25 °C), quasi tutte le cellule sono sotto forma di lievito. Una breve incubazione di 4 ore di C. albicans a 30 °C non ha influenzato la morfologia del lievito.

3. aPDT sul planctonico C. albicans

1. Isolare una singola colonia di C. albicans da una piastra di agar con un anello sterile e aggiungerla a un mezzo di 3 mL di estratto di lievito peptone destrosio (YPD) (vedi Tabella dei materiali) in un tubo di vetro sterilizzato.
   1. Incubare il tubo a 25 ± 1 °C durante la notte (14-16 h) in un incubatore con una velocità di rotazione di 155 rpm per espandere C. albicans e mantenere il fungo in forma di lievito per una quantificazione accurata.
2. Diluire la coltura notturna con un valore medio a un valore di OD₆₀₀ di circa 0,5 a 30 ° C e ruotare ad una velocità di 155 giri / min per 4 ore per ottenere una fase di crescita logaritmica di C. albicans.
3. Diluire nuovamente la coltura in fase logaritmica con mezzo YPD fresco a un valore OD₆₀₀ di 0,65 (circa 1 x 10⁷ unità formanti colonie, CFU/mL). Confermare la concentrazione finale con metodo di diluizione seriale su una piastra di agar⁸.
4. Preparare una soluzione madre (4%) di Rose bengal (RB) sciogliendo la polvere in 1x PBS. Filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservarlo a 4 °C al buio. La concentrazione finale di lavoro di RB è dello 0,2%.
5. Aggiungere 111 μL di RB al 2% a 1 mL di C. albicans in fase logaritmica in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e co-coltura in diversi punti temporali (0, 15 e 30 min) a temperatura ambiente per comprendere l'assorbimento di RB nelle cellule (Figura 2).
6. Lavare la cocoltura tre volte con 1 mL di 1x PBS con centrifugazione a 16.100 x g per 2,5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: aPDT contiene quattro diverse condizioni: controllo assoluto (nessuna esposizione alla luce, nessun RB), controllo del buio (nessuna luce ma incuba con RB), controllo della luce (espone alla luce senza RB), aPDT (espone alla luce in presenza di RB).
7. Risospese il C. albicans in 1 mL di 1x PBS e allocarli in tre diversi pozzetti in una piastra da 96 pozzi per ogni condizione. Allineare i pozzetti con l'array di LED dopo il lavaggio.
8. Nei gruppi esposti alla luce, accendere la ventola elettrica e la luce.
   NOTA: Una diversa fluenza (J/cm²) può essere ottenuta esponendo i pozzetti a periodi di tempo variabili. Ad esempio, un'esposizione alla luce di 16,7 minuti arriva a 10 J / cm² con una lampadina a LED da 10 mW / cm² .
9. Dopo l'irradiazione, aggiungere 20 μL della soluzione di cocoltura da un pozzo a un tubo di centrifuga da 1,5 mL contenente 180 μL di 1x PBS per preparare una diluizione 10x. Inoltre, diluire dieci volte, seguendo successivamente lo stesso metodo.
10. Far cadere tre gocce di 20 μL di ogni diluizione seriale su un quadrante di una piastra di agar YPD per ottenere colonie numerabili la piastra. Calcolare il CFU/mL moltiplicando le colonie per i fattori di diluizione³.

4. Analisi statistica

1. Analizzare i dati raccolti utilizzando un software di grafica e statistica (vedi Tabella dei materiali).
2. Rappresentare i dati per mezzo ± errore standard della media. Eseguire un'analisi ANOVA bidirezionale della varianza⁸ per valutare le differenze significative tra le diverse condizioni di test.
3. Eseguire i test di confronto multipli di Tukey per i confronti a coppie⁸. Per ogni diverso trattamento, eseguire almeno tre esperimenti indipendenti. Considera il valore p < 0,05 statisticamente significativo.

Risultati

La Figura 1 mostra il sistema aPDT utilizzato nel presente studio. Poiché le alte temperature possono causare una significativa morte cellulare, l'array di LED viene raffreddato da una ventola elettrica e un dissipatore di calore viene utilizzato durante l'irradiazione per mantenere una temperatura costante a 25 ± 1 °C. L'effetto calore può essere scontato. Avere una distribuzione uniforme della luce è anche un importante fattore determinante per un aPDT di successo; pertanto, è fonda...

Discussione

Risultati incoraggianti delle applicazioni cliniche di RB-PDT per la cheratite fungina sono stati riportati di recente¹⁹. Il picco di assorbimento di RB è a 450-650 nm. È essenziale determinare la frequenza di fluenza della sorgente luminosa per un aPDT di successo. Una fluenza elevata (di solito >100 J / cm²) è necessaria per trattare le cellule tumorali, mentre una fluenza inferiore dovrebbe trattare le lesioni infette⁶. Un'elevata fluenza significa un lungo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01	Disperses heat from the LED array.
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363