הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הדור של אקספלנט עור-פאשיה המכונה "SCar כמו רקמה בצלחת" או SCAD. מודל זה מאפשר הדמיה חסרת תקדים של פיברובלסטים בודדים במהלך היווצרות צלקות.

Abstract

התגובה הגלובלית של היונקים לאיטום פצעי רקמות עמוקים היא באמצעות היווצרות צלקות והתכווצות רקמות, המתווכת על ידי פיברובלסטים מיוחדים של החיתולית. למרות המשמעות הקלינית של היווצרות צלקות וריפוי פצעים לקוי, הבנתנו את הדינמיקה הפיברובלסטית של החיתולית בריפוי פצעים היא מעורפלת בשל היעדר מבחנים רלוונטיים המאפשרים הדמיה ישירה של כוריאוגרפיה פיברובלסטית ודינמיקה בסביבות מורכבות כגון פצעים בעור. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת צלקות עור לשעבר באמצעות SCAD או "רקמה דמוית SCar בצלחת A Dish" המחקה את הסביבה המורכבת של פצעי עור. במבחן זה, עור 2 מ"מ בעובי מלא נכרת ומתורבת הפוך במדיה במשך 5 ימים, שבמהלכם צלקות והתכווצויות עור מתפתחות באופן אחיד. מתודולוגיה זו, יחד עם מודלים של עכברים מהונדסים ספציפיים לשושלת פיברובלסטים, מאפשרת הדמיה של שושלות פיברובלסט בודדות לאורך כל תהליך תיקון הפצע. באופן כללי, פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין תהליכים ומנגנונים בסיסיים של תיקון פצעים, תוך בחינה ישירה של ההשפעות של מודולטורים על תוצאות ריפוי פצעים.

Introduction

ריפוי פצעים הוא תהליך של שחזור פצעים שנפרצו. פגיעות ברקמות אצל חסרי חוליות גורמות להתחדשות חלקית או מלאה. לעומת זאת, יונקים מגיבים לפציעה עמוקה על ידי הצטלקות, תהליך המותאם לאטום פצעים במהירות עם תקעים צפופים של סיבי מטריצה הממזערים את האזור הפרוע ובמקביל מעוותים לצמיתות את האתר הפגוע ^1,2,3. כוויות עור גדולות או פצעים פתוחים עמוקים ביונקים גורמים לפנוטיפים פתולוגיים כגון צלקות היפרטרופיות או קלואידיות ^4,5. צלקות נשגבות אלה גורמות לעומס עצום על מערכות הבריאות הקליניות והעולמיות. בארה"ב לבדה, ניהול צלקות עולה כ-10 מיליארד דולר בשנה ^6,7. לכן, פיתוח מתודולוגיות רלוונטיות נדרש כדי להבין טוב יותר את התהליכים והמנגנונים המממנים המעורבים ביצירת צלקות.

בשנים האחרונות, מגוון רחב של מחקרים בעכברים גילו אוכלוסיות פיברובלסטים הטרוגניות עם עוצמות תפקודיות מובהקות בהתבסס על מקורותיהם במקומות מסוימים בעור ^8,9,10. בעור האחורי, Rinkevich et al., 2015, זיהו כי אוכלוסייה פיברובלסטית ספציפית עם ביטוי עוברי מוקדם של Engrailed-1 (En1), המכונה EPF (פיברובלסט חיובי חרוט) תורמת להצטלקות עורית עם פציעה. לעומת זאת, שושלת פיברובלסטית אחרת ללא היסטוריה של ביטוי חרוט, פיברובלסט שלילי חרוט (ENF), אינה תורמת להיווצרות^{צלקת 8}. מיפוי גורל של שושלות En1 אלה באמצעות קווי עכברים מהונדסים מונעי Cre שנחצה לקווי עכברים פלואורסצנטיים כגון R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) מאפשר הדמיה של אוכלוסיות EPF ו- ENF.

חקר נדידת פיברובלסטים in vivo במשך מספר ימים מוגבל על ידי אילוצים אתיים וטכניים. יתר על כן, מסכי ספריית נוגדנים מורכבים, נגיפיים ומנטרלים כדי לווסת מסלולים המעורבים בהצטלקות הם מאתגרים מבחינה טכנית. בעבר נעשה שימוש במודלים של in vitro או ex vivo חסרים את היכולת לדמיין נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה אמיתית של העור, אחידות בהתפתחות צלקות, כמו גם מורכבות רקמות המחקה סביבות עור in vivo ^11,12. כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל, פיתחנו מבחן צלקות ex vivo המכונה SCAD (רקמה דמוית SCar בצלחת A)^13,14. בדיקה פשוטה זו יכולה להתבצע על ידי כריתת עור בעובי מלא של 2 מ"מ המכיל את האפידרמיס, הדרמיס ואזורי החיתולית התת עוריים ושילובם במדיית DMSO בתוספת סרום למשך עד 5 ימים. צלקות המופקות מ-SCAD משכפלות באופן מהימן סימני היכר תעתיקיים ופרוטאומיים של צלקות in vivo. בנוסף, SCADs שנוצרו מקווי עכברים מהונדסים רלוונטיים (למשל, עכברי En1) שהוצלבו עם קווי עכברים פלואורסצנטיים מאפשרים הדמיה של דינמיקת נדידת פיברובלסטים והתפתחות צלקות ברזולוציה חסרת תקדים. יתר על כן, מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לכל יישומי תפוקה גבוהה (למשל, ספריית תרכובות, ספריית נוגדנים או סינון ויראלי)^13,14. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב ליצירת SCADs ויישומי עיבוד במורד הזרם הבאים כדי לחקור את הדינמיקה התאית והמטריקסית בפיתוח צלקות.

Protocol

המודל המוצג להלן מספק תיאור מפורט שלב אחר שלב של יצירת מבחן SCAD כמתואר בקצרה ב- Jiang et al., 2020¹³. תכשירי דגימת SCAD בוצעו לאחר הקרבת בעלי החיים בהתאם להנחיות הבינלאומיות וממשלת בוואריה עילית. בעלי חיים שוכנו במתקן החיות של מרכז הלמהולץ במינכן. החדרים נשמרו עם לחות אופטימלית וטמפרטורה קבועה עם מחזור אור של 12 שעות. בעלי החיים סופקו עם מזון ומים ad libitum.

1. הכנת רקמת SCAD

1. להקריב גורים שזה עתה נולדו ביום 0 או ביום 1 (P0 או P1).
2. יש לבלום בזהירות לפחות 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ של עור גב גב בעובי מלא עד לשכבת שריר השלד באמצעות אזמל כירורגי סטרילי.
3. מקלפים את העור באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ומבטיחים כי החיתולית השטחית שלמה עם שריר panniculus carnosus הבסיסי.
4. שטפו את הרקמה שנכרתה ב-50-100 מ"ל של מדיית DMEM/F-12 קרה כדי להסיר דם מזהם.
5. יש לשטוף פעם אחת עם תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתאים.
6. מניחים את העור הפוך (חיתולית שטחית למעלה) בצלחת פטרי 10 ס"מ המכילה מדיית DMEM/F12.
7. באמצעות אגרוף ביופסיה חד פעמי של 2 מ"מ, הוציאו את הבלו על פיסות עור עגולות בעובי מלא, מה שמבטיח כי החיתולית השטחית תהיה שלמה עם שרירי panniculus carnosus הבסיסיים עד האפידרמיס ליצירת רקמות SCAD.
8. הכן ומלא 200 μL של DMEM / F12 (ללא פנול אדום) מדיה מלאה - DMEM / F12 מדיה בתוספת 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין לתוך בארות בודדות של צלחת 96 בארות.
9. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות ומטביעים באופן מלא רקמת SCAD בודדת במהופך (החיתולית פונה כלפי מעלה) לבארות של צלחת בת 96 בארות.
10. העבר את הצלחת לחממה של תרבית תאים המתוחזקת בתנאים סטנדרטיים (37 °C , 21%(v/v) חמצן, 5% (v/v) C0₂ ו-95% לחות).

2. SCAD - תרבית רקמה

1. תרבות SCADs בחממה עד 5 ימים.
2. ביום 2 וביום 4 של התרבית, החליפו את המדיה ב-200 מיקרול של מדיה מלאה טרייה של DMEM/F12 שחוממה מראש כדי להבטיח את המשך הכדאיות של התאים והרקמות. החלף תרכובות טיפול במהלך כל שינוי במדיה.
   הערה: הקפד להשאיר 10 μL של מדיה בבאר כדי למנוע רקמות להידבק לבארות.
3. הכינו SCADs לניסויים הבאים: הדמיה חיה (סעיף 3), וקצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית (סעיף 4).

3. הדמיה חיה של SCADs

1. הכינו מינימום של 30 מ"ל של 2%-3% (w/v) תמיסת אגרוז נמסה נמוכה ב-PBS בבקבוק זכוכית על ידי חימום במיקרוגל עד להרתחה.
2. מעבירים מיד את הבקבוק ומקררים את תמיסת האגרוס הנוזלי באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.
3. העבירו את רקמת ה-SCAD עם החיתולית/צלקת הפונה כלפי מעלה אל מרכז המנה בקוטר 35 מ"מ.
4. הטמיעו את ה-SCAD בטמפרטורת החדר (RT) על ידי העברה איטית של אגרוז נוזלי בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס על המנה בקוטר 35 מ"מ באמצעות פיפטה של פסטר. אגרוז מתפלמר תוך 2 דקות.
5. הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה של DMEM/F12 שחוממה מראש (ללא מחוון אדום פנול).
6. רכוש תמונות בהילוך מהיר של יום 0 SCADs עד 48 שעות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או רב-פוטון המצויד במערכת דגירה מתאימה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, 21% (v/v) חמצן, 5% (v/v) C0₂ ו-95% לחות.

4. קצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית

1. לשטוף את הרקמות בנקודות זמן רלוונטיות על ידי החלפת המדיה עם PBS סטרילי.
2. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות SCADs בודדים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 500 μL של 2% paraformaldehyde כדי לתקן את הרקמות במהלך הלילה ב 4 °C (74 °F).
3. שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS והמשיכו עם צביעה אימונופלואורסצנטית דו-ממדית/תלת-ממדית.
4. צביעה אימונופלואורסצנטית תלת-ממדית
   1. חלחלו לרקמות על ידי דגירה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של PBS בתוספת 0.2% ג'לטין, 0.5% Triton-X100 ו-0.01% תימרוסל (PBSGT) ב-RT למשך 24 שעות.
   2. להכין כמות נאותה של נוגדנים ראשוניים בהתאם להוראות היצרן ולדגום רקמות SCAD ב 150 μL של תמיסת PBSGT במשך 24 שעות ב RT.
      הערה: אם ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית אינו מדווח על ידי היצרן, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים על רקמות בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:500, 1:1000).
   3. שטפו בעדינות את ה-SCADs שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.
   4. דגירה רקמה עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT.
   5. לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 30 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.
   6. מעבירים את הרקמה לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להדמיה קונפוקלית או מולטי-פוטון.
      הערה: בעת שימוש במטרות טבילה במים, הטמיעו את ה-SCADs באגרוז של נקודת התכה נמוכה ב-2% כדי לשתק את הרקמה כדי למנוע היסחפות במהלך רכישת התמונה
5. צביעה דו-ממדית של אימונופלואורסצנציה
   1. מעבירים את הרקמה לתבנית קריו וממלאים בעדינות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.
   2. כוונון בעדינות את כיוון הרקמה, מה שמבטיח היעדר בועות אוויר כדי להשיג חתך רוחב או חתך אנכי.
   3. הניחו את התבנית על קרח יבש למשך 20-30 דקות ודגרו את הבלוק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   4. הגדר את טמפרטורת הלהב ל -25 °C (75 °F) ואת טמפרטורת בלוק הדגימה ל -17 °C (74 °F). הכינו מקטע קריו של 6 מיקרומטר באמצעות cryostat, העבירו את החלקים לשקופית הידבקות ואחסנו את השקופיות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
   5. יש לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS ולדגום את השקופיות ב-5% אלבומין בסרום בקר (BSA) w/v ב-PBST (PBS בתוספת 0.05% Tween) למשך שעה אחת.
   6. מוסיפים כמות מתאימה של נוגדן ראשוני ל-150μl PGST, ודוגרים למשך הלילה ב-4 °C (4 °F)
      הערה: אם היצרן לא מדווח על כך שהיצרן מדווח על ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים במקטעי בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   7. שטפו בעדינות את החלקים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.
   8. דגירה של רקמות עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT למשך שעתיים.
   9. לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.
   10. הרכיבו את המגלשות עם מדיום הרכבה המכיל DAPI ויבשו את המגלשות בחושך ב-RT.
   11. דמיינו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

ניתן להפריד את הדור של SCADs לשלושה שלבים חיוניים: קצירת עור בחזרה מעכברי P0-P1, יצירת אגרופי ביופסיה בעובי מלא, והתרבות שלאחר מכן של סקאדים בודדים עד 5 ימים בלוחות של 96 בארות. כקריאה, ניתן ליישם עוד יותר את הבדיקה הזו כדי לנתח את ההיבטים המרחביים והזמניים של הצטלקות. הניתוח המרחבי משתמש בתיוג חי?...

Discussion

מספר דגמים כבר פותחו כדי להבין היווצרות צלקות לאחר פציעה. אמנם נעשו הרבה התקדמויות בעניין זה, אך המנגנונים בפועל עדיין אינם ברורים. בניגוד לטכניקה הקודמת, מודל SCAD משלב את כל סוגי התאים והשכבות העוריות, ובכך שומר על המורכבות של עור מקומי^18,19. מתודולוגיה זו מסו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss