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要約

このプロトコルは、無傷のダイズ結節からの真核生物ポリソーム精製のための方法を記載する。シーケンシング後、遺伝子発現解析の標準パイプラインを使用して、トランスクリプトームおよびトランスラトームレベルで発現差のある遺伝子を同定できます。

要約

このプロトコルの目的は、ダイズ(Glycine max)共生結節の真核生物トランスラトームを研究するための戦略を提供することです。この論文では、RNAシーケンシングを使用して分析される植物由来のポリリボソームとそれに関連するmRNAを分離するために最適化された方法について説明します。まず、細胞質ライセートは、凍結大豆団塊全体からポリソームおよびRNA保存条件でホモジナイズすることによって得られます。次に、ライセートを低速遠心分離で除去し、上清の15%をトータルRNA(TOTAL)単離に使用します。残りの透明ライセートは、2層のスクロースクッション(12%および33.5%)を介した超遠心分離によってポリソームを単離するために使用されます。ポリソーム関連mRNA(PAR)は、再懸濁後にポリソームペレットから精製されます。TOTALとPARはどちらも、RNA-seqのシーケンシングライブラリの品質基準を満たすために、高感度キャピラリー電気泳動によって評価されます。ダウンストリームアプリケーションの例として、シーケンシング後、遺伝子発現解析のための標準パイプラインを使用して、トランスクリプトームおよびトランスラトームレベルで発現差のある遺伝子を取得できます。要約すると、この方法は、RNA-seqと組み合わせて、共生結節などの複雑な組織における真核生物mRNAの翻訳制御の研究を可能にします。

概要

ダイズ(グリシンマックス)などのマメ科植物は、根粒菌と呼ばれる特定の土壌細菌との共生を確立することができます。この相利共生的な関係は、植物の根に新しい器官、共生結節の形成を誘発します。結節は細菌を宿主とする植物器官であり、その細胞質がバクテロイドと呼ばれる特殊な形態の根粒菌でコロニー形成されている宿主細胞からなる。これらのバクテロイドは、大気中の窒素(N 2)をアンモニアに還元することを触媒し、アンモニアは炭水化物1,2と引き換えに植物に移される。

この窒素固定共生は、最もよく研究されている植物と微生物の共生の1つですが、さまざまな非生物的ストレス条件にさらされた植物が共生パートナーとの相互作用をどのように調節するか、これが結節代謝にどのように影響するかなど、多くの側面がよりよく理解されていません。これらのプロセスは、結節トランスラトーム(すなわち、メッセンジャーRNAのサブセット[mRNA]が活発に翻訳される)を分析することによってよりよく理解できる可能性があります。ポリリボソームまたはポリソームは、mRNAに関連する複数のリボソームの複合体であり、翻訳の研究に一般的に使用されます3。ポリソームプロファイリング法は、ポリソームに関連するmRNAの解析で構成されており、多様な生物学的プロセスで発生する遺伝子発現を制御する転写後メカニズムの研究に成功しています4,5。

歴史的に、ゲノム発現解析は主にmRNA存在量の決定に焦点を当ててきました6,7,8,9。しかし、遺伝子発現の転写後調節、特に翻訳の異なる段階のために、転写産物とタンパク質レベルの間には相関関係がない10、11、12。さらに、トランスクリプトームのレベルでの変化とトランスラトーム13のレベルで起こる変化との間に依存性は観察されていない。翻訳されているmRNAのセットを直接分析することで、mRNAレベルのみを分析した場合よりも、細胞遺伝子発現(エンドポイントはタンパク質存在量)をより正確かつ完全に測定できます14,15,16。

このプロトコルは、植物由来のポリソームが、2層のショ糖クッションを介した差動遠心分離によって無傷の大豆結節からどのように精製されるかを説明しています(図1)。しかしながら、バクテロイド由来のリボソームも結節に存在するので、真核生物のものが主要な画分(90%〜95%)を表すとしても、リボソームとRNA種の混合物が精製される。その後のRNA単離、定量、および品質管理についても説明します(図1)。このプロトコルは、RNA-seqと組み合わせて、共生結節などの複雑な組織における真核生物mRNAの翻訳制御に関する実験結果を提供するはずです。

figure-introduction-1870
図1:共生結節からの真核生物ポリソーム精製のための提案された方法論の概略概要。 このスキームは、(1)植物の成長と(2)結節の収穫から(3)細胞質抽出物の調製、(3)TOTALサンプルと(4)PARサンプルの取得、および(5)RNA抽出と品質管理。略語:PEB =ポリソーム抽出バッファー;RB = 再懸濁バッファー;合計=総RNA;PAR = ポリソーム関連mRNA。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1.植物の成長と根粒菌の接種

  1. 必要な結節を生成するには、制御された条件下で成長チャンバー内の選択した基質に選択した大豆種子を播種します。
    注:このプロトコルでは、種子は砂:バーミキュライト(1:1)の混合物で満たされた0.5Lのペットボトルに播種されました。成長チャンバーは、昼/夜のサイクル温度をそれぞれ28°C/20°C、明暗日長をそれぞれ16時間/8時間に設定しました。光合成有効放射強度は620μmol・m−2・s−1であった。
  2. 液体酵母エキスマンニトール(YEM)培地を事前に準備します( 材料の表を参照)。培地をオートクレーブします。
  3. 種まきの同じ日に、100mLのYEMを含む1つのフラスコに Bradyrhizobium elkanii U1302株を接種します。フラスコをオービタルシェーカー上で28°C、100rpmでインキュベートします。
    1. 根粒菌を2日間成長させ、苗に2 mLの培養液を接種します。

2.水不足処理(オプション)

注:このプロトコルは、大豆植物の水不足処理の概要を示しています。この部分は、手元の実験的な質問に応じて完全に変更または省略できます。

  1. 水制限なしで19日間(V2-3発育段階)大豆苗を育てます。0.5 mM KNO3を添加したB&D-medium17で基板をフィールド容量に保ちます。
  2. 20日目に、散水を撤回します。
    注:ここでは、水分含有量は、成長期および水不足期間中の重量測定(水分重量含有量)によって毎日測定されました。
  3. 製造業者の指示に従って、20日目から水不足期間の終わりまで、ポロメーターを使用して軸方向の葉の表面で毎日三重の気孔コンダクタンスを測定します( 材料の表を参照)。
    注:水不足期間の終わりは、気孔コンダクタンス値が播種から20日目に得られた値の約50%であったときに、植物ごとに個別に決定されました。

3.結節収穫

  1. 清潔な容器に液体窒素を収集し、15 mLチューブ(各プラントに1本ずつ)にラベルを付けます。
    注意: 液体窒素は、クライオ手袋、フェイスシールド、安全ゴーグルを着用して取り扱ってください。
  2. 各プラントを個別に取得します。空中部分を切り取って廃棄します。根を水で徹底的に洗って、残っている基質を取り除きます。
  3. 各結節を根から切り離し、プレチルした15 mLチューブに集めます。チューブをスナップ凍結し、-80°Cで保管します。

4.細胞質抽出物の調製

注:このプロトコルの最終的な目的は、高品質のトータルRNA(TOTAL)およびポリソーム関連RNA(PAR)を取得することです。したがって、RNAの分解を防ぐ条件下で作業し、サンプルを常に4°Cに保ち、RNaseフリーの実験装置と溶液を使用してください。特に指定がない限り、すべての溶液は滅菌超純水で調製されます。

  1. バッファーストック溶液の調製
    1. 表1に示すオートクレーブ可能なストック溶液を調製し、15分間オートクレーブし、RTに保ちます。
    2. 表1に示すフィルター滅菌可能なストック溶液を調製し、フィルター滅菌して-20°Cに保ちます。
  2. ポリソーム抽出バッファー(PEB、 表1を参照)を調製し、氷上に保ちます。
    注:与えられたボリュームは6つのサンプル用です。
  3. 遠心分離機を4°Cに冷却し、2 mLの微量遠心チューブを氷上に置きます。
  4. 計量皿で約0.2 gの無傷の結節を計量し、予冷した2 mLチューブに移します。
    注意: サンプルの解凍を避けるために、この手順をすばやく実行してください。あるいは、0.2gの代わりに0.4〜0.5mLの推定結節容量を使用することができる。
  5. 1.2 mLのPEBを加え、サンプルを2分間解凍し、結節が完全に破壊され均質になるまで組織粉砕機でホモジナイズします。
    注意: 小遠心チューブ内のティッシュグラインダー( 材料の表を参照)で簡単に破壊できるほど柔らかくなるため、解凍したら必ず結節を粉砕してください。凍結結節は粉砕が困難です。また、サンプルを冷たく保ちながら適切に均質化するために、チューブをベンチトップクーラー(0°C)に入れることをお勧めします。
  6. 氷上で10分間、またはすべてのサンプルが処理されるまで、穏やかに攪拌しながらサンプルをインキュベートします。
  7. 16,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、破片をペレット化します。上清を回収し、遠心分離工程を繰り返す。
  8. 清澄化した細胞質抽出物を注意深く回収し、200 μLのアリコートを清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに移して完全に分離します(TOTALサンプル;セクション7を参照)。

5.ショ糖クッションの調製

注:このプロトコルでは、13.2 mLの超遠心チューブに2層のスクロースクッション(12%および33.5%)を使用します( 材料の表を参照)。すべての溶液は滅菌超純水で調製されます。

  1. スクロースと塩ストック溶液を調製します。
    1. 100 mLの2 Mショ糖溶液を調製します(68.5%、 表1)。
    2. 10倍の塩溶液を調製する(表1)。
  2. 表2に記載のショ糖クッションの 2層を準備した。抗生物質(CHXおよびCHL)ストック溶液の組成については 、表1 を参照してください。
    注:記載されている容量は6つのクッション用です。
  3. 4.5 mLの33.5%ショ糖層を遠沈管に注ぎます。次に、4.5 mLの12%層をP1000マイクロピペットで注意深くゆっくりと加えます。清澄化した細胞質抽出物が添加されるまで、チューブを氷の上に置きます。

6. ポリソーム精製

  1. チューブの側壁に注意深くピペッティングすることにより、1 mLの清澄化細胞質抽出物(ステップ4.8)をショ糖クッションの上にロードします。
  2. 超遠心チューブを予冷バケットに移し、217,874 × g(参照ローターで35,000 rpm[ 材料の表を参照])で4°Cで2時間遠心分離します。
  3. 残りの細胞質抽出物およびスクロースクッションを廃棄し、ポリソームペレットを200μLの予冷RB( 表1に従って予め調製)と共に再懸濁する。
  4. 氷上で30分間インキュベートした後、ポリソーム再懸濁液を1.5 mLの予冷チューブに移します。RNA抽出(PARサンプル)を続行します。

7. RNA抽出と品質管理

注:この手順は、TOTAL(ステップ4.8)およびPARサンプル(ステップ6.4)に対して実行されます。

  1. 滅菌超純水で75%EtOHを調製し、-20°Cに冷却します。 さらに、クロロホルムとイソプロパノールを-20°Cに冷却します。
  2. サンプルを750 μLのRNA単離試薬でホモジナイズし、RTで5分間インキュベートします。
  3. 200 μLの冷たいクロロホルムを加え、チューブを15秒間激しく振とうします。RTで10分間インキュベートします。
  4. 12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、相分離を行います。ピンク色の有機相を乱すことなく500 μLの上部水相をきれいなチューブに移し、375 μLの冷たいイソプロパノールと0.5 μLのRNaseフリーグリコーゲンを加えます( 材料の表を参照)。上下にピペッティングして完全に混合します。
    注:グリコーゲンは、アルコール沈殿からの核酸回収率を高めるための共沈剤として使用される担体です。
  5. 混合物を4°Cで10分間インキュベートし、12,000 × g で15分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。
  6. RNA沈殿物を1 mLの冷75%EtOHで洗浄します。短時間の渦で混ぜる。
    注:この時点で、サンプルは-20°Cで一晩保存できます。
  7. 7,500 × g で4°Cで5分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を注意深く除去し、RNAペレットを風乾します。
  8. ペレットを50 μLのRNaseフリー水に溶解し、65°Cで5分間インキュベートします。
  9. 高感度キャピラリー電気泳動18 (材料 表を参照)および/または2%RNaseフリーアガロースゲル19 ( 材料表を参照)での電気泳動により、RNA濃度と完全性を評価します。
    注:RNAサンプルをすぐに使用しない場合、またはRNA-seqライブラリ調製のためにシーケンシング施設に送る場合は、EtOHを使用してそれらを沈殿させることをお勧めします。

8. RNA沈殿

  1. 遠心分離機とEtOHを4°Cに冷却します。
  2. 3 M酢酸ナトリウムを準備します。
  3. 滅菌済みの超純水で70%EtOHを調製し、-20°Cに冷却します。
  4. サンプル量を推定します。0.1容量の3 M酢酸ナトリウム、3容量の冷EtOH、および0.5 μLのRNaseフリーグリコーゲンを追加します。よく混ぜます。
  5. 必要になるまで-20°Cで放置します。
    注:RNA沈殿サンプルは、-80°Cで最大1年間保存できます。

9. 遺伝子発現解析のための標準パイプライン

  1. 平均40Mのイルミナペアエンドリードをリード長>100 bpで実行し、信頼性の高いトランスクリプトームおよびトランスラトームデータ解析を実現します。
    注:標準的なRNA-seqデータ解析には、次の手順9.2〜9.5が含まれます。
  2. FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)またはマルチサンプルMultiQC20を使用して読み取り品質検査を実施します。
  3. トリモマティック21、BBDuk(http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/)、カットアダプト22、シックル23、トリムガロア(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)などを使用して、アダプターと低品質のシーケンスを削除します。
  4. 種の参照ゲノムが利用可能な場合は、他のオープンソースツールに加えて、Bowtie2 24、TopHat2 25またはSalmon26、およびfeatureCounts27を使用して、参照に対してリードマッピングを実行し、その後存在量を定量化します。
  5. edgeR28、DESeq229、またはlimma30などを使用して、発現差のある遺伝子同定のための統計解析を実行します。
    注:これらのオープンソースソフトウェアは、コマンドラインを介してローカルで使用できます。または、グラフィカルユーザーインターフェイスを提供するGalaxy31やGEOexplorer32などのパブリックサーバー上のWebブラウザーを介して操作できるため、コマンドラインの知識は必要ありません。

結果

RNAシーケンシングなどのほとんどのダウンストリームアプリケーションでは、高品質のサンプルがライブラリ調製とシーケンシングの基本であるため、上記の手順で精製されたTOTALおよびPAR画分の量と品質の評価は、その成功を決定するための鍵となります。さらに、RNA分子の完全性により、試料採取18の瞬間における遺伝子発現プロファイルのスナップショットの捕捉が可...

ディスカッション

細胞遺伝子発現のエンドポイントはタンパク質の存在量であるため、翻訳レベルでの遺伝子発現調節の研究は、さまざまな生物学的プロセスをよりよく理解するために重要です13,14。これは、ポリソーム画分を精製すべき目的の組織または生物のトランスラトームを分析し、それに関連するmRNAを分析することによって評価できます3

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この研究は、CSIC I + D 2020助成金番号282、FVF 2017助成金番号210、およびPEDECIBA (マリアマーササインツ)によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shakerDaihan ScientificModel SHO-1D
YEM-mediumAmrescoJ850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3Merck221295
PorometerDecagon DeviceModel SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23Sigma-AldrichP1254
CentrifugeSigmaModel 2K15
ChloranphenicolSigma-AldrichC0378
CycloheximideSigma-AldrichC7698
DOCSigma-Aldrich30970
DTTSigma-AldrichD9779
EGTASigma-AldrichE3889
Igepal CA 360Sigma-AldrichI8896
KClMerck1.04936
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Plastic tissue grinderFisher Scientific12649595
PMSFSigma-AldrichP7626
PTESigma-AldrichP2393
TrisInvitrogen15504-020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Weighing dish Deltalab1911103
Preparation of sucrose cushions
SucroseInvitrogen15503022
SW 40 Ti rotorBeckman-Coulter
UltracentrifugeBeckman-CoulterOptima L-100K
Ultracentrifuge tubesBeckman-Coulter34405913.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
AgaroseThermo scientificR0492
BioanalyzerAgilentModel 2100. Eukaryote total RNA nano assay
ChloroformDI41191
EthanolDorwilUN1170
IsopropanolMallinckrodt3032-06
GlycogenSigma10814-010
TRIzol LSAmbion102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mLBiologix10-0152
Filter tips 10 µLBioPointe Scientific321-4050
Filter tips 1000 µLBioPointe Scientific361-1050
Filter tips 20 µLBioPointe Scientific341-4050
Filter tips 200 µLTarsons528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mLTarsons500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mLTarsons500020-N
Sequencing companyMacrogen
Sterile 250 mL flaskMarienfeld4110207

参考文献

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