Una tecnica minimamente invasiva, accurata ed efficiente per l'iniezione intratimica nei topi

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una procedura di radiologia interventistica stabilita per l'iniezione intratimica nei topi per evitare il rischio di chirurgia aperta e migliorare l'accuratezza delle iniezioni percutanee cieche.

Abstract

L'iniezione intratimica in modelli murini è una tecnica importante per lo studio della funzione timica e immunitaria, comprese le malattie genetiche e acquisite delle cellule T. Ciò richiede metodi per la deposizione diretta di reagenti e / o cellule nel timo di topi vivi. I metodi tradizionali di iniezione intratimica includono la chirurgia toracica o iniezioni mini-invasive percutanee in cieco, entrambe con limitazioni significative. I dispositivi di imaging ad ultrasuoni ad altissima frequenza hanno reso possibili iniezioni percutanee guidate da immagini nei topi, migliorando notevolmente l'accuratezza dell'iniezione dell'approccio di iniezione percutanea e consentendo l'iniezione di bersagli più piccoli. Tuttavia, le iniezioni guidate da immagini si basano sull'utilizzo di un sistema ferroviario integrato, rendendo questa procedura rigida e dispendiosa in termini di tempo. Qui viene presentato un metodo unico, sicuro ed efficiente per le iniezioni intratimiche percutanee nei topi, eliminando la dipendenza dal sistema binario per le iniezioni. La tecnica si basa sull'utilizzo di un'unità micro-ecografica ad alta risoluzione per visualizzare il timo del topo in modo non invasivo. Utilizzando una tecnica a mano libera, un radiologo può posizionare una punta dell'ago direttamente nel timo del topo sotto guida ecografica. I topi vengono puliti e anestetizzati prima dell'imaging. Per un radiologo esperto esperto in procedure ecoguidate, il periodo di apprendimento per la tecnica dichiarata è piuttosto breve, in genere all'interno di una sessione. Il metodo ha un basso tasso di morbilità e mortalità per i topi ed è molto più veloce delle attuali tecniche assistite meccanicamente per l'iniezione percutanea. Consente allo sperimentatore di eseguire in modo efficiente iniezioni percutanee precise e affidabili di timo di qualsiasi dimensione (compresi organi molto piccoli come il timo di topi anziani o immunodeficienti) con uno stress minimo sull'animale. Questo metodo consente l'iniezione di singoli lobi se lo si desidera e facilita esperimenti su larga scala grazie alla natura che consente di risparmiare tempo della procedura.

Introduzione

Il timo ha un ruolo essenziale nello sviluppo e nell'immunità delle cellule T. La carenza di cellule T, che può essere causata da involuzione timica, malattie genetiche, infezioni e trattamenti contro il cancro, tra gli altri fattori, porta ad un'elevata mortalità e morbilità ^1,2. I modelli murini sono indispensabili nella ricerca immunologica sia di base che traslazionale e sono stati utilizzati per decenni per studiare la biologia timica e lo sviluppo delle cellule T, nonché per sviluppare trattamenti per coloro che soffrono di disfunzione timica e deficit di cellule T ^3,4,5.

Una parte centrale delle indagini timiche è stata l'iniezione intratimica di materiali biologici come cellule, geni o proteine nei modelli murini 6,7,8,9,10,11,12. I metodi convenzionali di iniezione intratimica utilizzano toracotomia seguita da iniezione intratimica sotto visualizzazione diretta o da iniezione percutanea "cieca" nel mediastino. L'approccio chirurgico aumenta significativamente il rischio di pneumotorace, tra gli altri. Inoltre, l'elevato stress durante questo intervento chirurgico provoca immunosoppressione, compromettendo così potenzialmente i dati immunologici¹³. I ricercatori esperti, dopo un po 'di pratica, possono eseguire la tecnica di iniezione cieca, ma questo approccio è meno accurato e quindi limita i soggetti sperimentali ai topi giovani con un grande timo.

L'utilizzo della guida ecografica è stato introdotto come alternativa precisa e minimamente invasiva ai tradizionali approcci di iniezione intratimica¹⁴. Tuttavia, questa procedura richiede molto tempo quando si utilizza il sistema ferroviario integrato anziché la tecnica a mano libera. L'esecuzione delle iniezioni con il supporto di iniezione richiede un'attenta ottimizzazione delle immagini e il posizionamento del trasduttore con l'aiuto dei vari accessori come il supporto e il supporto del trasduttore, il sistema di posizionamento X, Y e Z, nonché un funzionamento efficiente dei controlli di micromanipolazione e delle estensioni del sistema ferroviario. Una semplice tecnica alternativa, l'iniezione timica ecoguidata, viene qui presentata eseguita da un radiologo utilizzando un approccio a mano libera¹⁵, che è un'alternativa minimamente invasiva rapida e accurata ai metodi sopra descritti. È importante sottolineare che l'approccio attuale può essere eseguito con qualsiasi sistema di imaging a ultrasuoni ad alta risoluzione senza bisogno di un supporto di iniezione e di un sistema di guida integrato. È particolarmente utile per gli studi che richiedono l'iniezione di un gran numero di topi¹¹, per esperimenti che coinvolgono l'iniezione di entrambi i lobi timici o per l'iniezione accurata di piccoli timo in topi anziani, irradiati o immunocompromessi¹².

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura degli animali presso il Center for Discovery and Innovation (protocollo IACUC 290). Per il presente studio, topi C57BL / 6 (femmina, 4-6 settimane), topi C57BL / 6 (femmina, 6 mesi), topi femmina J: NU, topi femmina NOD scid gamma (NSG) e B6; I topi CAG-luc, -GFP sono stati utilizzati rispettivamente come modello murino giovane, modello di topo invecchiato, modello di nudo atimico, modello immunodeficiente e sorgente cellulare di bioluminescenza. I topi sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Questa procedura richiederà in genere due persone (una per rimanere sterile durante l'esecuzione delle iniezioni e un'altra per gestire i topi).

1. Preparazione degli animali

1. Indurre l'anestesia nei topi usando il 3% -4% di gas isoflurano e mantenere l'anestesia usando gas isoflurano all'1% -3% somministrato tramite un cono nasale e un vaporizzatore calibrato con precisione (vedi Tabella dei materiali).
2. Confermare la profondità / incoscienza anestetica appropriata non rispondendo al pizzico della zampa posteriore.
3. Rimuovere la pelliccia dalla zona anteriore del torace dei topi applicando un sottile strato di crema depilatoria per meno di 1 minuto. Utilizzare un tovagliolo di carta bagnato per rimuovere completamente la crema insieme alla pelliccia sciolta.
   NOTA: L'applicazione di troppa crema provocherà l'infiammazione della pelle della zona del torace.
4. Posizionare un topo alla volta, supino, sulla piattaforma riscaldata della stazione di imaging a ultrasuoni per piccoli animali (vedi Tabella dei materiali) con il cono del naso in posizione (Figura 1).
5. Fissare il mouse al palco con nastro adesivo medico sugli arti posteriori e anteriori (Figura 1).
6. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
7. Disinfettare la pelle del torace superiore priva di pelliccia utilizzando un applicatore di gluconato di clorexidina (vedere la tabella dei materiali).

2. Preparazione della macchina ad ultrasuoni e campo sterile

1. Attivare la sonda lineare a più alta frequenza disponibile, in genere la sonda con la più alta risoluzione spaziale per le dimensioni dell'animale da riprendere. Attivare la sonda toccando il pulsante corrispondente dopo la schermata di avvio.
   NOTA: Per questa applicazione con topi, la sonda utilizzata è progettata specificamente per l'uso con topi e piccoli ratti (vedere Tabella dei materiali).
2. Ottimizzare le impostazioni ecografiche per l'imaging e l'iniezione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Regolare la profondità del campo visivo a una dimensione appropriata per l'animale di destinazione regolando i cursori orientati verticalmente sul lato destro dello schermo (Figura 2). L'impostazione della profondità massima sarà in genere di circa 6-8 mm per i topi giovani.
   2. Regolare il guadagno in scala di grigi facendo scorrere il pulsante lungo la barra orizzontale nella parte inferiore dello schermo (Figura 2). L'obiettivo è quello di iniziare con un'immagine che sia solo leggermente più scura di un tipico aspetto "grigio".
   3. Regolare la zona focale (freccia blu a destra dello schermo, Figura 2) al livello previsto del timo. Per i topi giovani, questo sarà intorno a una profondità di 4 mm.
   4. Se si desidera acquisire immagini, verificare la funzionalità dei pulsanti dell'immagine dell'archivio e della clip di memorizzazione per assicurarsi che le immagini possano essere salvate in modo appropriato durante la procedura. Per eseguire questa operazione, toccare il pulsante Salva clip nella parte inferiore destra dello schermo o toccare il pulsante Blocca e quindi toccare Salva immagine (Figura 2).
3. Applicare una piccola quantità (~ 1 ml) di gel per ultrasuoni sulla superficie del trasduttore (vedi Tabella dei materiali) mentre è in posizione verticale, appoggiata nel supporto della macchina ad ultrasuoni o nelle mani di un assistente.
4. Preparare un piccolo campo sterile accanto alla piattaforma riscaldata. Il posizionamento ottimale per questo è di solito tra la piattaforma e la macchina ad ultrasuoni.
   1. Svuotare questi elementi sul campo sterile: un coperchio sterile della sonda, elastico, guanti sterili e gel per ultrasuoni sterili (vedi Tabella dei materiali).
   2. Con il campo sterile impostato e gli oggetti in posizione, indossare i guanti sterili.
   3. Posizionare con cautela il coperchio sterile della sonda sul trasduttore ad ultrasuoni (così come sul gel che è stato inizialmente posizionato sulla sonda). Mantenere la sterilità e toccare solo la copertura sterile, nient'altro. Far scorrere l'elastico sterile sul coperchio della sonda sterile per tenerlo in posizione.
      NOTA: I fuochi d'aria, indipendentemente dalle dimensioni, possono interferire con l'imaging ecografico. Pertanto, è essenziale applicare il gel ad ultrasuoni tra il trasduttore e il coperchio della sonda sterile e sopra il coperchio della sonda per garantire un'interfaccia priva di aria tra la sonda ad ultrasuoni e l'animale.
   4. Posizionare una quantità moderata (2-3 ml) di gel per ultrasuoni sterile sul trasduttore.
      NOTA: l'utente è ora pronto per visualizzare un mouse anestetizzato.

3. Imaging e localizzazione del timo

1. Mantenendo la sterilità, posizionare verticalmente la sonda con gel ad ultrasuoni sulla parte disinfettata della parete toracica anteriore del mouse per l'imaging iniziale.
   1. Prenditi un momento per guardare l'immagine ecografica e ottimizzarla ulteriormente. Tornare al passaggio 2.2 e regolare per ottenere un aspetto simile a quello della Figura 3.
2. Scansiona il torace anteriore del mouse su un piano trasversale. Esegui questa operazione tenendo il trasduttore verticalmente e spostandolo su e giù dal collo all'addome in un movimento simile a un pennello o "ampio".
   NOTA: Il cuore sarà la struttura più riconoscibile nel torace a causa del suo movimento rapido e dell'aspetto "camerato". Una volta localizzato il cuore, questo può essere usato come punto di riferimento per acquisire un'immagine del timo.
3. Con il cuore centrato nel campo visivo, spazzare leggermente il trasduttore verso il collo. Appena superiore al cuore, il timo si incontra di solito.
4. Visualizza il timo come una struttura bilobata, piramidale, ipoecogena ("scura" o "nera" che appare sullo schermo) che è centrata nella linea mediana, anteriore all'aorta e posteriore allo sterno (Figura 3A).
5. Prendi nota delle due strutture rotonde accoppiate nere (cioè "ipoecogene") su entrambi i lati della parte superiore del torace.
   NOTA: Queste sono le vene cavae bilaterali. L'aorta è una struttura ipoecogena curvilinea simile nella linea mediana tra le due vene cavae. Questi sono facilmente riconoscibili dal loro movimento pulsante.

4. Iniezione del timo

1. Se necessario, applicare più gel per ultrasuoni sterile (2-3 ml) sul trasduttore.
   NOTA: Una quantità relativamente grande di gel sterile sul trasduttore (rispetto alle dimensioni del torace del topo) fungerà da "cuscinetto di gel" attorno alla parete toracica del mouse. Ciò ridurrà il numero di artefatti ad ultrasuoni realizzati dall'aria all'interno del campo visivo.
2. Utilizzando la sonda ad ultrasuoni, individuare la porzione più ampia del timo, che di solito è il sito bersaglio ideale per l'iniezione. Anticipare una traiettoria orizzontale dell'ago nella posizione scelta.
   1. Nota dove si trovano i principali vasi sanguigni (SVC e aorta) in questo sito. Evitare questi durante l'iniezione.
   2. I vasi sanguigni saranno ipoecogeni, strutture pulsatili, come descritto nella fase 3.7. In caso di dubbi, utilizzare la modalità color Doppler per verificare il flusso all'interno dei recipienti (Figura 4A). Attivare la modalità Color Doppler toccando il pulsante Colore sullo schermo.
   3. Se si prevede che uno dei principali vasi sanguigni (o il cuore) si trovi lungo la traiettoria dell'ago prevista, scegliere una nuova area target o trovare un approccio / traiettoria diverso.
3. Tenga il trasduttore in una mano e un ago da insulina da 30 G (vedere Tabella dei materiali) con 10 μL di iniettare nell'altra.
   NOTA: l'iniezione varia in base al disegno sperimentale. Il presente studio ha utilizzato soluzione salina tamponata fosfato, blu di tripano o D-luciferina (0,1 μg / 10 μL).
4. Per iniziare il processo di iniezione, spostare il trasduttore lateralmente in modo che il timo sia decentrato nel campo visivo degli ultrasuoni. Assicurarsi che l'altro lato del campo visivo sia costituito principalmente da gel ad ultrasuoni e nient'altro.
5. Posizionare la punta dell'ago nel gel sotto il trasduttore e muovere lentamente l'ago fino a quando non viene visualizzato adiacente alla superficie cutanea (Figura 4B).
6. Mentre si esegue continuamente l'imaging dell'ago sotto ultrasuoni, inserire l'ago nella ghiandola del timo con una traiettoria percutanea, lontano dai vasi sanguigni.
   1. Utilizzare una traiettoria orizzontale "cross thymus" per posizionare la punta dell'ago nel lobo timico controlaterale al sito di ingresso. Ciò spiega la potenziale perdita lungo il tratto dell'ago (Figura 5A).
7. Una volta che la punta dell'ago è all'interno della porzione desiderata del timo, iniettare rapidamente il contenuto (come 10 μL di tripano blu o D-luciferina, 0,1 μg/10 μL) dalla siringa da 30 G utilizzando la visualizzazione ecografica.
   1. Per stabilizzare la siringa durante l'inserimento e l'iniezione dell'ago, tenere la siringa tra il pollice e il terzo dito e controllare lo stantuffo della siringa con l'indice.
8. Rimuovere l'ago dopo che tutto il contenuto è stato depositato.

5. Monitoraggio post-iniezione degli animali

1. Trasferire l'animale in una gabbia vuota e osservare fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale.
   NOTA: Il recupero completo dall'anestesia dovrebbe avvenire entro 2 minuti.
2. Monitorare l'animale per altri 10 minuti per segni di angoscia, respiro affannoso o sanguinamento.
   NOTA: Il dolore post-iniezione non è previsto e in genere non è necessaria l'analgesia post-iniezione.
3. Una volta completamente recuperato e dopo un periodo di osservazione post-iniezione senza incidenti, riportare l'animale iniettato in compagnia di altri animali.

Risultati

Il successo dell'implementazione di questa tecnica si basa su alcuni passaggi chiave da seguire. In primo luogo, deve essere garantita l'identificazione affidabile della ghiandola del timo stessa. Nei topi giovani, questo è semplice a causa delle grandi dimensioni della ghiandola (Figura 3A). Nei topi più anziani o nei topi immunodeficienti, può essere più impegnativo; tuttavia, è ancora molto fattibile con le moderne apparecchiature ad ultrasuoni (Figura 3B

Discussione

Un'iniezione a mano libera guidata da ultrasuoni è una tecnica altamente accurata per fornire materiali di studio al timo in modo efficiente e asettico. Dopo la sterilizzazione iniziale della pelle nel sito di iniezione, la sterilità viene mantenuta durante la procedura grazie all'uso di guanti sterili, coperture sterili per sonde ad ultrasuoni e gel per ultrasuoni sterili. In contrasto con l'approccio percutaneo cieco 10,17 o affidandosi a incisioni chirurgiche per la visualizzazione diretta del timo^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform