Внепеченочный желчный проток и рассечение желчного пузыря у новорожденных девятидневных мышей

Резюме

Для наблюдения за нарушениями желчных протоков новорожденных требуется интактный желчный проток и эффективная подготовка. Поэтому был успешно разработан новый подход к выделению всей внепеченочной системы желчных протоков у новорожденных мышей при сохранении целостности желчного протока.

Аннотация

Рассечение мышиных неонатальных желчных протоков было описано как трудное. Основной целью описанной стандартной операционной процедуры является выделение внепеченочного желчного протока (EBD) у новорожденных мышей без повреждения желчного протока во время подготовки. Из-за его исключительно близкой подготовки по сравнению с клеточной линией холангиоцитов и сбором всей внепеченочной системы желчных протоков (EBDS), описанный подход чрезвычайно полезен при исследовании животных моделей нарушений желчных протоков новорожденных, таких как атрезия желчевыводящих путей. После эвтаназии была получена доступ к брюшной полости, а система желчных протоков, двенадцатиперстная кишка и печень были извлечены с помощью уникальной En-bloc-resection (EbR). Извлеченный образец помещают на пенопластовый мат, а EBD рассекают от загрязняющих клеток атравматично без необходимого прикосновения. Рассечение всей EBDS является существенным преимуществом этого метода. Следует соблюдать осторожность из-за небольшого размера и количества ткани желчных протоков. При использовании описанной методики не происходит повреждения холангиоцитов. Далее чистота методики воспроизводима (n = 10). Таким образом, можно собрать оптимально сопоставимые образцы. Кроме того, ткань желчных протоков не повреждается, потому что любого контакта с системой желчных протоков можно избежать во время приготовления, оставив желчную жидкость внутри желчного пузыря. Самое главное, что при выполнении заключительного рассечения желчного пузыря и желчных протоков атравматические микроинструменты использовались лишь незначительно латерально от желчного протока, не сдавливая его. Это ключ к чистому и неповрежденному образцу и необходим для дальнейшего гистологического исследования или выделения холангиоцитов. Подводя итог, можно сказать, что описанная инновационная методика вскрытия позволяет особенно неопытным операторам с необходимым оборудованием максимально четко изолировать EBDS.

Введение

Генезис и прогрессирование холангиопатий, таких как билиарная атрезия, первичный склерозирующий холангит (PSC) и первичный билиарный холангит (PBC), либо неизвестны, либо неполны ^1,2. Ограниченное понимание происхождения и прогрессирования этих заболеваний приводит к нехватке вариантов терапии³. Самым сложным препятствием в изучении неонатальных нарушений желчных протоков является получение молекулярного понимания патофизиологии. Одним из важных ключей к лучшему пониманию молекулярной патологии является наилучшее наблюдение за пораженной тканью. Чтобы избежать снижения сопоставимости и расхождений между исследованиями, таких как наблюдение за потенциальной вирусной этиологией атрезии желчевыводящих^{путей 4}, возникает необходимость в наилучшей возможной подготовке и совместном использовании выполненных методов диссекции. Чистая подготовка ткани-мишени необходима для последующих микроскопических исследований или разведения клеточных и 3D-органоидных культур. Однако при неонатальных заболеваниях мышей образцы тканей встречаются редко и встречаются только в небольшом количестве из-за очень маленького размера. Что касается нарушений желчных протоков, то описаны трудности в чистой подготовке желчных протоков у новорожденных мышей⁵. Из-за неонатальной стадии развития дифференцировка тканей не слишком развита, что затрудняет подготовку и увеличивает сложность по сравнению с подготовкой взрослых образцов. Поэтому операционная рабочая группа исследовала новую стратегию подготовки EBDS в модели неонатальной мыши. В настоящем исследовании этот метод позволяет эффективно распределять каждый образец.

Система желчных протоков внутрибрюшинно размещается в правой верхней части живота, возникая из печени. Желчный пузырь расположен под висцеральной поверхностью правой доли печени. Желчный проток вместе с воротной веной и печеночной артерией внедряется в гепатодуоденальную связку. Он соединяет печень и двенадцатиперстную кишку непосредственно и дренирует желчную жидкость в двенадцатиперстную кишку⁶. Анатомически желчный проток делится на правый и левый печеночный протоки, общий печеночный проток, кистозный проток и Ductus choledochus, который образуется слиянием кистозного протока и общего печеночного протока⁷. Этот в конечном итоге опорожняет желчную жидкость и слюну из протока поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку через ампулу Фатера.

Холангиоциты выстилают желчный проток внутри- и экстрагепатически, обитая в сложной анатомической нише, где они помогают в производстве желчи и гомеостазе⁸. Желчная жидкость ежедневно проходит через эти специализированные эпителиальные клетки в высоких концентрациях. В частности, поддержание зонтика HCO3 очень важно для защиты от токсичности желчных кислот⁹. Холангиоциты являются первой линией обороны в гепатобилиарной системе против, например, просветных микроорганизмов¹⁰. Защитная эффективность холангиоцитов от токсических атак может быть ослаблена генетической предрасположенностью. Токсическая перегрузка вызывает повреждение и разрушение и, следовательно, может привести к холангиопатии. Кроме того, развивающийся желчный проток не полностью способен ко всем самозащитным механизмам, что приводит к более высокой восприимчивости к токсинам окружающей среды в желчных протоках новорожденных¹¹.

протокол

После этического одобрения (N045/2021) новорожденные самцы и самки мышей C57BL/6 наблюдались до 9-дневного возраста. Животные были рождены и предоставлены для экспериментальных целей учреждением для животных Университетской медицинской клиники Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия. Новорожденных помещали в клетку вместе с родительскими животными. Условия окружающей среды контролировались при температуре (20-24 °C), цикле 12:12 ч свет-темнота и относительной влажности 40%-70%.

1. Экспериментальная подготовка

1. Подготовить необходимое оборудование для хирургической операции, включая ножницы, щипцы и т.д. (см. Таблицу материалов).
2. Поместите продезинфицированные и автоклавные инструменты на стерильную поверхность рядом с операционным столом.
3. Быстро усыплите неонатальную мышь P9-возраста путем обезглавливания с помощью операционных ножниц. Поместите тело усыпленной неонатальной мыши на стерильное операционное поле. Рассечение EBDS у 9-дневных новорожденных мышей (шаг 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная процедура рассечения дает любому ученому надлежащие инструменты для удаления EBDS у неонатальных и пожилых мышей. Чем старше мышь, тем легче подготовка.

2. Доступ к брюшной полости

1. Обхватите кожу над расположением мочевого пузыря щипцами. Вырежьте отверстие диаметром 2 мм в кожу ножницами, не повреждая брюшину и нижележащие структуры. Разверните разрез до места обезглавливания, следуя левой передней подмышечной линии. Снимите кожу слева на правую сторону атравматическими щипцами.
2. Возьмите в руки брюшину, окружающую селезенку. Осторожно поднимите его вверх, пока брюшина не станет похожа на шатровую структуру, и вырежьте отверстие диаметром 1 мм в центре. Подождите, пока «перитонеальная палатка» наполнится воздухом. Используйте 10-кратное микроскопическое увеличение для этого и следующих шагов.
3. Отрежьте брюшину в окне, обрамленном нижними ребрами, как боковыми областями живота, так и областью нижнего мочевого пузыря, чтобы обеспечить полный доступ к печени, системе желчных протоков, желудку, тонкому кишечнику и толстой кишке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения доступа к печени может быть выполнен дополнительный разрез, удаляя три нижних ребра, оставляя мечевидный отросток, фальциформную связку, печень и структуры желчных протоков нетронутыми. Вид печени легко получить.

3. Обследование желчного пузыря и желчных протоков

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец должен оставаться влажным на регулярной основе в течение всех следующих этапов.

1. Осторожно вытяните мечевидный отросток в черепно-вентральное положение, чтобы осмотреть желчный пузырь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение на фальциформной связке увеличивается с этим движением, и присоединенный желчный пузырь становится видимым.
   1. Выполняйте лишь незначительное растяжение, чтобы избежать неконтролируемого разрыва фальциформной связки, что может привести к разрыву желчного пузыря из системы желчных протоков. Отпустите притяжение мечевидного процесса перед следующим шагом.
2. Осторожно потяните вниз двенадцатиперстную кишку, чтобы освободить систему желчных протоков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По мере увеличения напряжения на гепатодуоденальной связке становится видимой ткань желчного протока.

4. Эн-блок-резекция

1. Выполните нижнюю блочную мобилизацию, выполнив следующие действия.
   1. Определите дуоденальный сосочек, который соединяет систему желчных протоков с двенадцатиперстной кишкой.
   2. Прорежьте двенадцатиперстную кишку примерно на 2 см от правой боковой стороны сосочка.
   3. Прорежьте пилорическую область. Убедитесь, что содержимое желудка присутствует в пилорической области между местом разреза и дуоденальным сососком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг для последующей безопасности ориентации для правильного расположения ротовой и аборальной дуоденальной частей.
2. Выполните верхнюю ан-блок-мобилизацию.
   1. Осторожно потяните мечевидный отросток и получите доступ к фальциформной связке.
   2. Выполните разрез длиной 1 см через фальциформную связку, максимально приближенную к мечевидному отростку, между желчным пузырем и мечевидным отростком. Следите за тем, чтобы не повредить желчный пузырь.
   3. Прорежьте следующие соединительные структуры между печенью и грудной клеткой: пищевод, нижняя полая вена, грудная аорта, все связки, которые окружают голую область печени, и все дорсально оставшиеся тканевые соединения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец en-bloc полностью рассечен. Он содержит печень, систему желчных протоков и двенадцатиперстную кишку, которая связана с пилорической областью желудка.

5. Окончательное рассечение желчного пузыря и желчных протоков

1. Выполните комплексную подготовку, выполнив следующие действия.
   1. Поместите образец en-bloc на пенопластовую прокладку, обычно используемую для обезвоживания. Используйте 20-кратное микроскопическое увеличение и два микрохирургических атравматических щипца с максимальным размером наконечника 6 мм для этого и следующих шагов.
   2. Соберите образец на поролоновой прокладке. Реорганизуйте образец в правильном анатомическом положении. Сгладить ротовую и аборальную часть двенадцатиперстной кишки, выполнив нежное движение.
   3. Начните движение в двенадцатиперстной кишке и продолжайте к режущим краям с помощью атравматических щипцов. Разгладьте белое пульповое содержимое желудка, которое будет возникать только в ротовой части двенадцатиперстной кишки. Убедитесь, что идентифицирована оральная и аборальная часть двенадцатиперстной кишки, чтобы исключить вероятное вращение желчных протоков.
   4. Отрежьте крупные остатки печеночной ткани, чтобы начать рассечение желчного протока.
2. Выполните окончательную изоляцию.
   1. Аккуратно вдавите оставшуюся печеночную ткань в поры пенопластового мата. Убедитесь, что движения соскоба начинаются с системы желчных протоков и приводят к границам печени.
   2. Переместите образец в более чистое положение на пенопластовом коврике после нескольких скребковых движений в различных направлениях. Используйте преимущество менее сжатой ткани печени на заднем плане, чтобы оптимизировать вид для наилучшей возможной дифференциации между EBDS и нежелательными клетками. Соскоблите печеночную ткань из желчного протока до тех пор, пока ничего или как можно меньше от печеночной ткани не останется.
   3. Обрабатывайте гепатодуоденальную связку до тех пор, пока не останется изолированная EBDS. Удалите интралигаментозные кровеносные сосуды, такие как печеночная артерия, воротная вена и небольшие остатки. Удалите эту нежную нить, с легким натяжением и высоким уходом, с левой боковой стороны. Этот этап рассечения, возможно, уже начался непреднамеренно или частично завершен во время предварительного удаления печеночной ткани, что в конечном итоге приводит к тому же результату.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кровеносные сосуды проявляются в виде белой и очень нежной нити примерно в 3-5 мм перорально дуоденального сосочка и соединяются с гепатодуоденальной связкой с левой боковой стороны, накапливаясь с желчным протоком к глиссонианской триаде. По завершении этого этапа окончательный образец полностью изолируется. Если есть необходимость в записи, изображения могут быть получены после организации структур желчных протоков в их анатомическое положение (рисунок 1). Рекомендуется делать последние шаги подготовки на пенопластовом коврике, потому что образец не будет прилипать так сильно к поверхности рабочего поля. Если поры влажные, желчный проток левитирует или плавает. При перемещении образца он не будет прилипать так же прочно, как при подготовке на операционной ткани, что приводит к отсутствию разрыва при перемещении образца.

6. Подготовка к гистологическому анализу

1. Поместите изолированный образец в буферный раствор, специальную среду или формалинсодержащие фиксаторы (см. Таблицу материалов) как можно скорее после рассечения.
2. Выберите подходящее решение для хранения в зависимости от дальнейших запланированных этапов обработки.
   ВНИМАНИЕ: Используйте формалинсодержащие фиксаторы только под вентиляционным отверстием из-за острой токсичности, коррозионной активности и различных опасностей для здоровья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном исследовании образцы EBDS были вставлены в параформальдегид, обезвожены и внедрены в парафин. Они хранятся при комнатной температуре и охлаждаются перед секционированием. В нагревательном шкафу 2 мкм ломтики хранились в течение ночи и окрашивались с использованием обычного гематоксилина и эозина⁴ (см. Таблицу материалов).

Результаты

На рисунке 1А показана EBDS новорожденного мыша, которая была рассечена с помощью описанной методики. Микроскопически больше печеночной ткани не видно. Печеночная ткань была удалена во время заключительных этапов выделения протокола и может быть легко отличима от ткани ?...

Обсуждение

В этой статье сообщалось и обсуждалось создание и валидация нового хирургического подхода к удалению EBDS усыпленных неонатальных мышей. Микроскопические и гистологические данные показывают, что подход быстро обнаруживает ЭБД и рассекает их вблизи краев протока, даже у неонатальных мы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides