Velocidad de sedimentación globular: una caracterización impulsada por la física en un contexto médico

Resumen

La velocidad de sedimentación globular (VSG) es un parámetro físico, que a menudo se utiliza en controles de salud de rutina y diagnósticos médicos. Recientemente se ha desarrollado un modelo teórico que permite extraer parámetros físicamente significativos de toda la curva de sedimentación, basado en el conocimiento coloidal moderno. Aquí, presentamos un protocolo para recopilar automáticamente la ESR a lo largo del tiempo y extraer los parámetros de este modelo reciente de esta recopilación automatizada de datos. También es probable que estos parámetros refinados mejoren el testimonio médico.

Resumen

La velocidad de sedimentación globular (o glóbulos rojos) (VSG) es un parámetro físico derivado de la sangre que se utiliza a menudo en controles de salud de rutina y diagnósticos médicos. Por ejemplo, en el caso de la inflamación, se observa una mayor VSG debido al aumento asociado de fibrinógeno y otras proteínas plasmáticas. Se creía que este aumento se debía a la formación de agregados más grandes de glóbulos rojos (RBC) causados por el aumento de fibrinógeno. De hecho, el fibrinógeno es un agente que fomenta la agregación de glóbulos rojos y, en el régimen de Stokes, se supone que se observa en agregados más grandes de sangre, sedimenta más rápido. Sin embargo, todos los modelos de mediciones de VSG basados en esta hipótesis requieren suposiciones físicas específicas adicionales, no requeridas en ningún otro sistema. Además, estudios modernos en el campo de las suspensiones coloidales han establecido que las partículas atractivas forman agregados percolantes (es decir, agregados tan anchos como el contenedor). La sedimentación de estos coloides sigue a un llamado "colapso de gel coloidal". Recientemente, se ha demostrado que los glóbulos rojos en realidad siguen el mismo comportamiento. Esta hipótesis también permite modelar de manera eficiente y analítica la curva de sedimentación de los glóbulos rojos, de la cual se pueden extraer descriptores robustos y físicamente significativos. Este manuscrito describe cómo realizar dicho análisis y analiza los beneficios de este enfoque.

Introducción

La velocidad de sedimentación globular (VSG) es una herramienta clínica médica in vitro, introducida formalmente en la medicina basada en la evidencia durante el siglo XX 1,2,3,4. Actualmente se utiliza en todo el mundo como una prueba inflamatoria inespecífica, o para monitorear la evolución de algunas condiciones específicas 5,6,7,8. Esto se debe principalmente a un aumento en la concentración de fibrinógeno, pero también en otros componentes plasmáticos como IgM 1,9,10,11. De acuerdo con el protocolo estándar actual de Westergren, los valores de VSG se informan como la medición de la capa plasmática libre de células en un punto de tiempo dado (30 min o 1 h) después de dejar un tubo vertical de un tamaño típico de 20 cm verticalmente en reposo¹². Sin embargo, este método de medición ha sido criticado ya que se han reportado etapas cualitativamente diferentes en el proceso de sedimentación, incluyendo un retraso antes de alcanzar la velocidad máxima de sedimentación¹³. Este retraso dura más de 1 h en aproximadamente la mitad de las muestras sanas¹⁴. La velocidad durante esta fase obedece a una escala diferente a la de la segunda fase, más rápida de la sedimentación¹⁵. Restringir la lectura a la velocidad de asentamiento promedio durante la primera hora luego compara una mezcla diferente de varias propiedades de la sangre entre diferentes individuos.

Además, recientemente se ha demostrado que las consideraciones teóricas habituales detrás de este protocolo eran erróneas^16,17,18. En el hematocrito fisiológico (por encima de aproximadamente el 25%), los glóbulos rojos (RBC) no sedimentan como agregados separados, sino más bien como una red continua, llamada percolación, de RBC 17,18, obedeciendo a un conjunto diferente de ecuaciones físicas que la sedimentación de Stokes generalmente mencionada ^16,17. Se ha demostrado que considerar una descripción física basada en las mediciones resueltas en el tiempo de la sedimentación (curva completa) fue más robusto en algunos contextos médicos novedosos^19,20. Además, estas mediciones podrían ser utilizadas para arrojar luz sobre los mecanismos físicos que alteran la VSG en patologías en las que las formas celulares están alteradas^19,20. Además, una VSG lenta puede tener una interpretación médica útil, como se indica en las mediciones de una cohorte de pacientes con síndrome de neuroacantocitosis^19,20. Este artículo revisa cómo implementar prácticamente la medición de parámetros físicamente significativos, basándose en toda la cinética de ESR. Más exactamente, el método presentado aquí extrae la velocidad máxima de sedimentación U_m, cuyo valor puede corregirse para considerar el efecto del hematocrito del donante^16,17. Este parámetro es más preciso y, por lo tanto, más confiable que la medición tradicional^16,17,19,20.

Además, en algunas investigaciones fundamentales, en lugar de monitorizar el estado inflamatorio de un paciente determinado, es interesante excluir el efecto del hematocrito sobre la VSG 21,22,23, o investigar el papel de los RBC en una VSG modificada 19,20,24,25 entre diferentes donantes. Podría ser útil comparar muestras que no son directamente muestras de sangre completas de pacientes. Por lo tanto, la resuspensión de eritrocitos con un hematocrito controlado en el plasma autólogo, o en un sustituyente plasmático, podría usarse como el primer paso de la medición de la VSG. Por ejemplo, las soluciones de Dextrano 70 kDa con una concentración de 55 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) producen un rango de sedimentación dentro del rango de control para células sanas¹⁹. Este manuscrito también muestra cómo se deben llevar a cabo tales pasos, y que el análisis presentado también es relevante en estos casos.

Protocolo

La recolección de muestras de sangre y los experimentos fueron aprobados por el "Ärztekammer des Saarlandes", ética votum 51/18, y se realizaron después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Las mediciones estándar deben realizarse con sangre anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (concentración estándar de EDTA de 1,6 mg/ml en sangre, norma europea NF EN ISO 6710), en tubos de Westergren. El volumen requerido para llenar el tubo Westergren depende del fabricante (ya que las partes inferiores a veces contienen un depósito más ancho); El volumen debe ser de aproximadamente 1 ml de sangre completa y 800 μL para los tubos indicados en la Tabla de materiales. Sin embargo, el método descrito a continuación es válido independientemente de la suspensión específica y la forma del recipiente, siempre que el hematocrito de las muestras probadas sea superior al 25%¹⁶. Por lo tanto, los volúmenes, los contenedores, el medio de suspensión y los aditivos deben seleccionarse de acuerdo con los objetivos específicos de la investigación realizada.

1. Experimentos y mediciones

NOTA: Registre la velocidad de sedimentación de la muestra cada minuto.

1. Preparación de la muestra (si es necesario): Si se requiere un hematocrito de control o líquido de suspensión, comience lavando las células y preparando las muestras (como ejemplo, mostramos cómo preparar muestras con varios niveles de fibrinógeno, mezclando suero autólogo y plasma). De hecho, el suero puede aproximarse como plasma libre de fibrinógeno^26,27, y puede usarse para disminuir la agregación de glóbulos rojos^, en condiciones fisiológicas. Para preparar varias muestras, recolectar la sangre en tubos estándar de EDTA de 9 ml y el suero en tubos de suero estándar (con perlas de sílice como activadores de la coagulación) de 9 ml.
   1. Centrifugar las muestras de sangre (es decir, 9 ml de EDTA estándar y tubos de suero en el ejemplo elegido) a 3.000 x g durante al menos 7 minutos, para una compactación óptima de los eritrocitos empaquetados. Reemplace el sobrenadante con PBS o el líquido de suspensión deseado, si se dispone de una cantidad suficiente. Si simplemente es necesario controlar el hematocrito en plasma autólogo, proceda directamente al paso 1.1.3. De lo contrario, mezcle suavemente después de la inclusión del sobrenadante para el lavado.
   2. Repita tres veces. Realice el último lavado con el líquido de suspensión deseado en cualquier caso.
      1. En el ejemplo elegido, prepare mezclas de plasma autólogo y suero con proporciones determinadas (por ejemplo, 25%/75%, 50%/50% o 75%/25% de la fracción de volumen plasmático-sérico). Por ejemplo, al preparar 2,5 ml de la mezcla de suero plasmático al 25%/75%, agregue 0,625 ml de plasma a 1,875 ml de suero.
   3. Extraiga el volumen requerido de células empaquetadas y suspenda en el líquido deseado. Procesar las células empaquetadas como un líquido altamente viscoso (utilizando prepipeteo estándar y/o pipeteo inverso o una pipeta de desplazamiento positivo²⁸). En el ejemplo elegido, para una muestra de 4 ml a un hematocrito del 45%, suspender 1,8 ml de células empaquetadas dentro de los 2,2 ml de la mezcla de suero plasmático.
2. Si el hematocrito de la muestra no está controlado, determinarlo por microcentrifugación de alta velocidad (otros métodos estándar también son adecuados).
   1. Extraiga la cantidad requerida de muestra para la determinación del hematocrito: llene los capilares del micro-hematocrito sumergiendo su punta inferior en el líquido. Deténgalo cubriendo la abertura superior cuando la cantidad requerida de muestra se eleve en el tubo por succión capilar.
   2. Selle los capilares con cera de sellado. Colóquelos en la centrífuga de micro-hematocrito y ejecútela a 15,000 x g (12,000 rpm) durante 5 min, o de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Lea el nivel de hematocrito en el capilar y escríbalo como referencia.
3. Instale una cámara para registrar la sedimentación de las muestras. Para evitar sobrecargar la memoria o agotar la batería, alimente el dispositivo desde la red eléctrica y guarde las imágenes directamente en una computadora o disco duro externo.
   1. Coloque una cámara fija delante del soporte donde los tubos ESR se dejarán en reposo. Use un fondo blanco iluminado (las hojas de papel blancas en el fondo funcionan perfectamente).
   2. Usando tubos Westergren vacíos, preferiblemente sin marcas, establezca el enfoque y el campo de visión de la cámara para obtener la resolución más alta donde se colocarán las muestras. Preferiblemente, asegúrese de que los bordes de las imágenes estén alineados en la dirección vertical y horizontal.
   3. Tome una foto de un tubo a escala para extraer la resolución de píxeles. Se recomienda el uso de imágenes RGB.
   4. Ajuste la luz y el tiempo de exposición de la cámara para que tengan un fondo blanco, pero sin saturación. El ejemplo de la figura 1 se ha obtenido utilizando una EOS M50 de Canon, con un tiempo de exposición de 1/15s, una apertura de F8.0, balance de blancos de tungsteno, en modo de disparo único con enfoque manual y una velocidad ISO de 1.000.
4. Prepare y coloque los tubos de ESR.
   1. Llene el recipiente inferior del tubo Westergren con el volumen correspondiente a las instrucciones del fabricante. Inserte el tubo Westergren en el recipiente inferior según lo indicado por el fabricante.
   2. Tan pronto como el primer tubo esté listo, colóquelo en el soporte y comience la grabación de la cámara. La grabación de una imagen cada minuto suele dar una buena resolución de la curva cinética de ESR.
   3. Prepare y coloque las siguientes muestras. Asegúrese de no pararse frente a ninguna muestra cuando se tome una fotografía.
   4. Deje que las mediciones se ejecuten durante al menos 2 h, para comparar con las mediciones estándar a 30 min, 1 h y 2 h. Sin embargo, también es mejor ver la saturación y detención de la sedimentación. Para muestras sanas, o en caso de inflamación, registrar las muestras durante la noche, entre 12 h y 24 h, es más que suficiente ya que la curvatura de las muestras más rápidas es visible dentro de 3 h^13,19. Sin embargo, si una condición disminuye la velocidad de sedimentación, como lo hace una disminución en la concentración de fibrinógeno (es decir, en el ejemplo elegido, fracción de volumen sérico alto), se pueden requerir registros de 50 h o más para obtener la información más precisa^16,19.

2. Análisis de imágenes

NOTA: Una vez grabadas las imágenes, extraiga la curva ESR. Un ejemplo de código de Matlab se proporciona como archivo complementario 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. Seleccione o identifique una región de interés (ROI) donde solo un tubo sea visible, el borde inferior se encuentra debajo de la posición más baja de la interfaz plasmática libre de células eritrocitarias pero dentro de la muestra (ver Figura 1A, B). Si es necesario, gire la imagen para que la dirección vertical esté alineada a lo largo del primer componente de la imagen.
2. Convierta el ROI de la imagen RGB en una imagen en escala de grises o matriz Gr. Por lo general, la combinación de los canales de tres colores (rojo [R], verde [G] y azul [B]) como Gr = 2 * R - B - G es muy eficiente con un fondo claro (consulte la Figura 1C y MatlabCodeImageAnalysisSampled.m líneas 121-128).
3. Binarize la imagen. Para una muestra sana, el uso del umbral²⁹ de Otsu generalmente da un resultado consistente (consulte la Figura 1D y la línea 133 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Para muestras con un hematocrito alto o con algo de hemólisis, podría ser mejor ajustarlo manualmente o usar otro método automático (como se hace en las líneas 129-131 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), dependiendo del contraste exacto obtenido entre las diversas fases dentro del tubo.
4. Obtenga el promedio de los valores de píxeles (o elementos) de Gr a lo largo de la dirección horizontal. Este paso minimiza el ruido y promedia de manera eficiente las posibles irregularidades de la interfaz (consulte la Figura 1E y MatlabCodeImageAnalysisSampled.m línea 137).
5. Antes de calcular las variaciones, suavizar la curva con una media móvil, especialmente si los tubos contienen algunas marcas horizontales (véase la figura 1F). Para los ejemplos proporcionados, se utilizó una ventana móvil de ~2,5 mm (50 píxeles) para este proceso (consulte la línea 138 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Luego, identifique la posición de la interfaz como el punto con la mayor variación de intensidad (consulte la Figura 1G).
6. Repita para cada imagen y cada muestra. Para cada muestra, guarde las posiciones de la interfaz a lo largo del tiempo en un formato apropiado para ajustar el modelo físico con cualquier software que se ajuste adecuadamente.

3. Ajuste del modelo físico

1. Utilizando cualquier software de ajuste adecuado, conociendo el hematocrito y la altura inicial de la columna sanguínea h 0, encontrar los valores del tiempo de retardo t₀, el tiempo adimensional γ y la fracción final de volumen empaquetado Φ_mde los eritrocitos que minimiza la suma de las desviaciones residuales cuadradas para el modelo físico¹⁷. Se proporciona un código de Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) como archivo complementario 2 como ejemplo de cómo realizar dicho ajuste. Consulte el Archivo complementario 2 para obtener más instrucciones. Como se describe en otra parte^16,17, eritrocitos en el sedimento de hematocrito fisiológico como gel de partículas blandas, donde los parámetros físicos importantes son la diferencia de densidad entre el plasma y los glóbulos rojos del donante Δρ, el diámetro característico de los glóbulos rojos r_RBC^, la viscosidad plasmática a temperatura ambiente η y el hematocrito del donante Φ . Utilizando estos parámetros, y asumiendo que la tensión gravitacional es el principal proceso impulsor para que el plasma fluya hacia arriba a través de la red porosa formada por los eritrocitos después de un tiempo de retardo t₀, se obtiene la evolución temporal^16,17:
   
   con , , y siendo el radio de disco promedio de un eritrocito. Un ejemplo de un código de Matlab que realiza esto se proporciona como un archivo adjunto (ShapeAnalyzerIntegrated.m se ajusta a la función definida en SedimFit.m [Archivo complementario 3]). Alternativamente, G/γ también se puede utilizar directamente como parámetro de ajuste con unidades de 1/t.
2. Una vez extraída la curva cuantitativa de la imagen, guarde los parámetros físicos de la muestra. Los valores tradicionales de ESR a los 30 min, 1 h o 2 h todavía se pueden extraer de la curva como referencia (consulte las líneas 123-132 de ShapeAnalyzerIntegrated.m).

Resultados

Un ejemplo de una secuencia de imágenes adquirida correctamente se proporciona como Película suplementaria 1 (MovieS1.avi). Una serie de ajustes característicos del modelo se muestra para diversas condiciones en la Figura 2. La concentración de fibrinógeno se determinó a partir de la concentración de fibrinógeno en el plasma Fib₀, asumiendo que el suero no tiene fibrinógeno en absoluto. Por lo tanto, Fib = C Fib₀, donde C<...

Discusión

Para que el protocolo automatizado funcione de manera eficiente, es importante tener un fondo claro y una iluminación adecuada. Un fondo oscuro podría impedir la existencia de un umbral de binarización eficaz. Para muestras con alguna hemólisis, que generalmente ocurre (aumenta) con el tiempo, es importante verificar primero que el umbral de binarización elegido sea relevante tanto para las imágenes iniciales como para las finales.

Cuando se trata del proceso de binarización de la image...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 - Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.