Velocidade de Hemossedimentação: Uma Caracterização Física em um Contexto Médico

Resumo

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é um parâmetro físico, frequentemente utilizado em exames de saúde de rotina e diagnóstico médico. Um modelo teórico que permite extrair parâmetros fisicamente significativos de toda a curva de sedimentação, baseado no conhecimento coloidal moderno, foi recentemente desenvolvido. Aqui, apresentamos um protocolo para coletar automaticamente a VHS ao longo do tempo, e extrair os parâmetros desse modelo recente dessa coleta automatizada de dados. Esses parâmetros refinados também tendem a melhorar o testemunho médico.

Resumo

A velocidade de sedimentação eritrocitária (ou eritrócitos) (VHS) é um parâmetro físico derivado do sangue que é frequentemente usado em exames de saúde de rotina e diagnóstico médico. Por exemplo, no caso de inflamação, observa-se uma VHS mais elevada devido ao aumento associado do fibrinogênio e de outras proteínas plasmáticas. Acreditava-se que esse aumento se devesse à formação de maiores agregados de hemácias (hemácias) causada pelo aumento do fibrinogênio. De fato, o fibrinogênio é uma agregação de hemácias promotora de agentes e, no regime de Stokes, supõe-se que seja observada em sedimentos de agregados maiores do sangue mais rapidamente. No entanto, todos os modelos de medidas de VHS baseados nessa hipótese requerem pressupostos físicos específicos, não exigidos em nenhum outro sistema. Além disso, estudos modernos no campo das suspensões coloidais estabeleceram que partículas atrativas formam agregados percolantes (ou seja, agregados tão largos quanto o recipiente). A sedimentação desses coloides segue-se então a um chamado "colapso do gel coloidal". Recentemente, foi demonstrado que as hemácias realmente seguem o mesmo comportamento. Essa hipótese também permite modelar de forma eficiente e analítica a curva de sedimentação de hemácias, a partir da qual descritores robustos e fisicamente significativos podem ser extraídos. Este artigo descreve como realizar tal análise e discute os benefícios dessa abordagem.

Introdução

A velocidade de hemossedimentação (VHS) é uma ferramenta clínica médica in vitro, formalmente introduzida na medicina baseada em evidências durante o século XX1,2,3,4. Atualmente, é utilizada mundialmente como teste inflamatório inespecífico, ou para monitorar a evolução de algumas condições específicas5,6,7,8. Isso se deve principalmente ao aumento da concentração de fibrinogênio, mas também de outros componentes plasmáticos, como a IgM 1,9,10,11. De acordo com o protocolo padrão de Westergren atual, os valores de VHS são relatados como a medida da camada de plasma livre de células em um determinado momento (30 min ou 1 h) após deixar um tubo vertical de tamanho típico de 20 cm verticalmente em repouso¹². No entanto, esse método de medição tem sido criticado, uma vez que qualitativamente diferentes etapas do processo de sedimentação têm sido relatadas, incluindo um atraso antes de atingir a velocidade máxima de sedimentação¹³. Esse atraso dura mais de 1 h em aproximadamente metade das amostras saudáveis¹⁴. A velocidade durante essa fase obedece a uma escala diferente da segunda fase mais rápida da sedimentação¹⁵. Restringir a leitura à velocidade média de sedimentação durante a primeira hora compara uma mistura diferente de várias propriedades do sangue entre indivíduos diferentes.

Além disso, recentemente foi demonstrado que as considerações teóricas usuais por trás desse protocolo estavam erradas^16,17,18. No hematócrito fisiológico (acima de aproximadamente 25%), as hemácias (hemácias) não se sedimentam como agregados separados, mas sim como uma rede contínua, denominada percolante, de hemácias 17,18, obedecendo a um conjunto de equações físicas diferente da usualmente citada sedimentação de Stokes ^16,17. Demonstrou-se que considerar uma descrição física baseada nas medidas resolvidas no tempo da sedimentação (curva inteira) foi mais robusto em alguns contextos médicos novos^19,20. Além disso, essas medidas poderiam ser usadas para esclarecer os mecanismos físicos que alteram a VHS em patologias nas quais as formas celulares são alteradas^19,20. Além disso, uma VHS lenta pode ter uma interpretação médica útil, como indicado nas medidas de uma coorte de pacientes com síndrome de neuroacantocitose^19,20. Este artigo revisa como implementar na prática a medição de parâmetros fisicamente significativos, com base em toda a cinética de VHS. Mais precisamente, o método aqui apresentado extrai a velocidade máxima de sedimentação U_m, cujo valor pode ser corrigido para considerar o efeito do hematócrito do doador^16,17. Esse parâmetro é mais preciso e, portanto, mais confiável que a medida tradicional^16,17,19,20.

Além disso, em algumas pesquisas fundamentais, ao invés de monitorar o estado inflamatório de um determinado paciente, é interessante excluir o efeito do hematócrito sobre a VHS 21,22,23, ou investigar o papel das hemácias em uma VHS modificada 19,20,24,25 entre diferentes doadores. Pode ser útil comparar amostras que não são diretamente amostras de sangue cheias de pacientes. Portanto, a ressuspensão de hemácias com hematócrito controlado no plasma autólogo ou substituinte plasmático pode ser usada como o primeiro passo da medida da VHS. Por exemplo, soluções de Dextran 70 kDa com concentração de 55 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) produzem uma faixa de sedimentação dentro da faixa de controle para células saudáveis¹⁹. Este manuscrito também mostra como tais etapas devem ser conduzidas, e que a análise apresentada também é relevante nesses casos.

Protocolo

A coleta de amostras de sangue e os experimentos foram aprovados pela "Ärztekammer des Saarlandes", ética votum 51/18, e realizados após a obtenção do consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque. As medições padrão devem ser realizadas com sangue anticoagulado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração padrão de EDTA de 1,6 mg/mL de sangue, norma europeia NF EN ISO 6710), em tubos de Westergren. O volume necessário para encher o tubo de Westergren depende do fabricante (já que as peças inferiores às vezes contêm um reservatório mais largo); O volume deve ser de cerca de 1 mL de sangue pleno, e 800 μL para os tubos indicados na Tabela de Materiais. O método descrito a seguir é, no entanto, válido independentemente da suspensão específica e da forma do recipiente, desde que o hematócrito das amostras sondadas seja superior a 25%¹⁶. Volumes, recipientes, meio de suspensão e aditivos devem, portanto, ser selecionados de acordo com os objetivos específicos da pesquisa realizada.

1. Experimentos e medições

NOTA: Registrar a taxa de sedimentação da amostra a cada minuto.

1. Preparação da amostra (se necessário): Se for necessário um hematócrito de controle ou líquido de suspensão, comece lavando as células e preparando as amostras (como exemplo, mostramos como preparar amostras com vários níveis de fibrinogênio, misturando soro autólogo e plasma). O soro pode, sim, ser aproximado como plasma livre de fibrinogênio^26,27 e pode ser usado para diminuir a agregação de hemácias^, em condições fisiológicas. Para preparar várias amostras, coletar o sangue em tubos padrão de EDTA de 9 mL e o soro em tubos de soro padrão (com esferas de sílica como ativadores de coagulação) de 9 mL.
   1. Centrifugar as amostras de sangue (ou seja, 9 mL de EDTA padrão e tubos de soro no exemplo escolhido) a 3.000 x g por pelo menos 7 min, para a compactação ideal dos eritrócitos compactados. Substitua o sobrenadante por PBS ou pelo líquido de suspensão desejado, se houver uma quantidade suficiente disponível. Se for simplesmente necessário controlar o hematócrito no plasma autólogo, avance directamente para o passo 1.1.3. Caso contrário, misture suavemente após a inclusão do sobrenadante para lavagem.
   2. Repita três vezes. Realize a última lavagem com o líquido de suspensão desejado em qualquer caso.
      1. No exemplo escolhido, prepare misturas de plasma autólogo e soro com proporções determinadas (por exemplo, 25%/75%, 50%/50% ou 75%/25% da fração de volume plasmático-sérico). Por exemplo, ao preparar 2,5 mL da mistura plasma-soro de 25%/75%, adicione 0,625 mL de plasma a 1,875 mL de soro.
   3. Extraia o volume necessário de células embaladas e suspenda-o no líquido desejado. Processar as células embaladas como um líquido altamente viscoso (usando pré-pipetagem e/ou pipetagem reversa padrão ou uma pipeta de deslocamento positivo²⁸). No exemplo escolhido, para uma amostra de 4 mL no hematócrito de 45%, suspender 1,8 mL de concentrado de hemácias dentro de 2,2 mL da mistura plasma-soro.
2. Se o hematócrito da amostra não for controlado, determiná-lo por microcentrifugação de alta velocidade (outros métodos padrão também são adequados).
   1. Extrair a quantidade necessária de amostra para determinação do hematócrito: preencher os capilares do micro-hematócrito mergulhando sua ponta inferior no líquido. Pará-lo cobrindo a abertura superior quando a quantidade necessária de amostra subir no tubo por sucção capilar.
   2. Sele os capilares com cera selante. Coloque-os na centrífuga de micro-hematócrito e execute-o a 15.000 x g (12.000 rpm) por 5 min, ou de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Leia o nível do hematócrito no capilar e anote-o para referência.
3. Configure uma câmera para registrar a sedimentação das amostras. Para evitar sobrecarregar a memória ou drenar a bateria, ligue o dispositivo da rede elétrica e salve as imagens diretamente em um computador ou disco rígido externo.
   1. Configure uma câmera estável na frente do suporte, onde os tubos ESR serão deixados em repouso. Use um fundo branco e iluminado (folhas de papel brancas no fundo funcionam perfeitamente).
   2. Usando tubos Westergren vazios, de preferência sem marcações, defina o foco e o campo de visão da câmera para obter a maior resolução onde as amostras serão colocadas. De preferência, certifique-se de que as bordas das imagens estejam alinhadas no sentido vertical e horizontal.
   3. Tire uma foto de um tubo dimensionado para extrair a resolução de pixels. Recomenda-se o uso de imagens RGB.
   4. Defina a luz e o tempo de exposição da câmera para ter um fundo branco, mas sem saturação. O exemplo da Figura 1 foi obtido usando uma Canon EOS M50, com um tempo de exposição de 1/15s, uma abertura de F8.0, balanço de branco de tungstênio, no modo single shot com foco manual, e uma velocidade ISO de 1.000.
4. Prepare e coloque os tubos de ESR.
   1. Encha o recipiente inferior do tubo Westergren com o volume correspondente às instruções do fabricante. Insira o tubo Westergren no recipiente inferior conforme indicado pelo fabricante.
   2. Assim que o primeiro tubo estiver pronto, coloque-o no suporte e inicie a gravação da câmera. Gravar uma imagem a cada minuto geralmente dá uma boa resolução da curva cinética da VHS.
   3. Prepare e coloque as próximas amostras. Certifique-se de não ficar na frente de qualquer amostra quando uma foto é tirada.
   4. Deixe as medições correrem por pelo menos 2 h, a fim de comparar com as medidas padrão em 30 min, 1 h e 2 h. No entanto, também é melhor ver a saturação e a parada da sedimentação. Para amostras saudáveis, ou em caso de inflamação, o registro das amostras durante a noite, entre 12 h e 24 h, é mais do que suficiente, uma vez que a curvatura das amostras mais rápidas é visível dentro de 3 h^13,19. No entanto, se uma condição diminui a velocidade de sedimentação, como ocorre uma diminuição na concentração de fibrinogênio (i.e., no exemplo escolhido, fração de volume sérico elevado), registros de 50 h ou mais podem ser necessários para obter a informação mais precisa^16,19.

2. Análise das imagens

NOTA: Uma vez que as imagens são gravadas, extraia a curva ESR. Um exemplo de código Matlab é fornecido como Arquivo Suplementar 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. Selecione ou identifique uma região de interesse (ROI) onde apenas um tubo é visível, sendo a borda inferior localizada sob a posição mais baixa da interface de plasma livre de células eritrocitárias, mas dentro da amostra (ver Figura 1A, B). Se necessário, gire a imagem para que a direção vertical seja alinhada ao longo do primeiro componente da imagem.
2. Converta o ROI da imagem RGB em uma imagem em escala de cinza ou matriz Gr. Normalmente, combinar os canais de três cores (vermelho [R], verde [G] e azul [B]) como Gr = 2 * R - B - G é muito eficiente com um fundo claro (veja a Figura 1C e as linhas 121-128 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).
3. Binarize a imagem. Para uma amostra íntegra, o uso do limiar de Otsu²⁹ geralmente fornece um resultado consistente (consulte a Figura 1D e a linha 133 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Para amostras com hematócrito alto ou com alguma hemólise, talvez seja melhor ajustá-lo manualmente ou usar outro método automático (como feito nas linhas 129-131 do MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), dependendo do contraste exato obtido entre as várias fases dentro do tubo.
4. Obtenha a média dos valores de pixel (ou elementos) de Gr ao longo da direção horizontal. Esta etapa minimiza o ruído e calcula com eficiência as possíveis irregularidades da interface (consulte a Figura 1E e a linha 137 do MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).
5. Antes de calcular as variações, suavize a curva com uma média móvel, especialmente se os tubos contiverem algumas marcações horizontais (veja a Figura 1F). Para os exemplos fornecidos, uma janela móvel de ~2,5 mm (50 pixels) foi usada para esse processo (consulte a linha 138 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Em seguida, identifique a posição da interface como o ponto com maior variação de intensidade (ver Figura 1G).
6. Repita para cada imagem e cada amostra. Para cada amostra, salve as posições da interface ao longo do tempo em um formato apropriado para ajustar o modelo físico com qualquer software adequadamente ajustado.

3. Ajuste do modelo físico

1. Utilizando qualquer software adequadamente ajustado, conhecendo o hematócrito e a altura inicial da coluna sanguínea h 0, encontramos os valores do tempo de atraso t₀, o tempo adimensional γ e a fração de volume do enxurrado final Φ_mdos eritrócitos que minimiza a soma dos desvios residuais quadrados para o modelo físico¹⁷. Um código Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) é fornecido como Arquivo Suplementar 2 como um exemplo de como executar tal ajuste. Consulte o Arquivo Suplementar 2 para obter mais instruções. Como descrito^{alhures 16,17}, os eritrócitos no sedimento do hematócrito fisiológico são um gel de partículas moles, onde os parâmetros físicos importantes são a diferença de densidade entre o plasma e as hemácias do doador Δρ, o diâmetro característico das _{hemácias r hemácias}^, a viscosidade plasmática à temperatura ambiente η e o hematócrito Φ do doador . Utilizando esses parâmetros, e assumindo que o estresse gravitacional é o principal processo direcionador para o fluxo plasmático ascendente através da rede porosa formada pelos eritrócitos após um tempo de atraso t₀, obtém-se a evolução temporal^16,17:
   
   com , e sendo o raio médio do disco de um eritrócito. Um exemplo de um código Matlab executando isso é fornecido como um anexo (ShapeAnalyzerIntegrated.m se ajusta à função definida em SedimFit.m [Arquivo Suplementar 3]). Alternativamente, G/γ também pode ser usado diretamente como um parâmetro de ajuste com unidades de 1/t.
2. Uma vez extraída a curva quantitativa da imagem, salve os parâmetros físicos da amostra. Os valores tradicionais de ESR em 30 min, 1 h ou 2 h ainda podem ser extraídos da curva para referência (consulte as linhas 123-132 do ShapeAnalyzerIntegrated.m).

Resultados

Um exemplo de uma sequência de imagens adquirida corretamente é fornecido como Filme Suplementar 1 (MovieS1.avi). Uma série de ajustes característicos do modelo é mostrada para várias condições na Figura 2. A concentração de fibrinogênio foi determinada a partir da concentração de fibrinogênio no plasma Fib₀, assumindo que o soro não possui fibrinogênio. Assim, Fib = C Fib₀, onde C é a fração de volume plasm...

Discussão

Para que o protocolo automatizado funcione de forma eficiente, é importante ter um fundo claro e iluminação adequada. Um fundo escuro pode impedir a existência de um limiar de binarização eficiente. Para amostras com alguma hemólise, que geralmente ocorre (aumenta) ao longo do tempo, é importante verificar primeiro se o limiar de binarização escolhido é relevante tanto para as imagens iniciais quanto para as finais.

Quando se trata do processo de binarização da imagem, a escolha d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 - Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.