Velocità di eritrosedimentazione: una caratterizzazione guidata dalla fisica in un contesto medico

Riepilogo

La velocità di eritrosedimentazione (VES) è un parametro fisico, spesso utilizzato nei controlli sanitari di routine e nella diagnosi medica. Recentemente è stato sviluppato un modello teorico che consente di estrarre parametri fisicamente significativi dall'intera curva di sedimentazione, basato sulle moderne conoscenze colloidali. Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere automaticamente la VES nel tempo ed estrarre i parametri di questo modello recente da questa raccolta automatica dei dati. Questi parametri raffinati sono anche suscettibili di migliorare la testimonianza medica.

Abstract

La velocità di sedimentazione degli eritrociti (o globuli rossi) (ESR) è un parametro fisico derivato del sangue che viene spesso utilizzato nei controlli sanitari di routine e nella diagnosi medica. Ad esempio, nel caso dell'infiammazione, si osserva una VES più elevata a causa dell'aumento associato del fibrinogeno e di altre proteine plasmatiche. Si riteneva che questo aumento fosse dovuto alla formazione di aggregati più grandi di globuli rossi (RBC) causati dall'aumento del fibrinogeno. In effetti, il fibrinogeno è un'aggregazione di globuli rossi che favorisce l'agente e nel regime di Stokes si presume che venga osservato nei sedimenti di aggregati più grandi del sangue più velocemente. Tuttavia, tutti i modelli di misurazione ESR basati su questa ipotesi richiedono ulteriori assunzioni fisiche specifiche, non richieste in nessun altro sistema. Inoltre, studi moderni nel campo delle sospensioni colloidali hanno stabilito che particelle attrattive formano aggregati percolanti (cioè aggregati larghi quanto il contenitore). La sedimentazione di questi colloidi segue poi un cosiddetto "collasso del gel colloidale". Recentemente, è stato dimostrato che i globuli rossi seguono effettivamente lo stesso comportamento. Questa ipotesi permette anche di modellare in modo efficiente e analitico la curva di sedimentazione dei globuli rossi, da cui possono essere estratti descrittori robusti e fisicamente significativi. Questo manoscritto descrive come eseguire tale analisi e discute i vantaggi di questo approccio.

Introduzione

La velocità di eritrosedimentazione (VES) è uno strumento clinico medico in vitro, formalmente introdotto nella medicina basata sull'evidenza nel corso del XX secolo 1,2,3,4. Attualmente è utilizzato in tutto il mondo come test infiammatorio aspecifico, o per monitorare l'evoluzione di alcune condizioni specifiche 5,6,7,8. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della concentrazione di fibrinogeno, ma anche in altri componenti plasmatici come IgM 1,9,10,11. Secondo l'attuale protocollo standard Westergren, i valori ESR sono riportati come la misurazione dello strato di plasma privo di cellule in un dato punto temporale (30 minuti o 1 ora) dopo aver lasciato un tubo verticale di una dimensione tipica di 20 cm verticalmente a riposo¹². Tuttavia, questo metodo di misurazione è stato criticato poiché sono stati riportati stadi qualitativamente diversi nel processo di sedimentazione, incluso un ritardo prima di raggiungere la velocità massima di sedimentazione¹³. Questo ritardo dura più di 1 ora in circa la metà dei campioni sani¹⁴. La velocità durante questa fase obbedisce a una scala diversa rispetto alla seconda fase, più veloce della sedimentazione¹⁵. Limitare la lettura alla velocità media di assestamento durante la prima ora, quindi confrontare un diverso mix di varie proprietà del sangue tra individui diversi.

Inoltre, è stato recentemente dimostrato che le solite considerazioni teoriche alla base di questo protocollo erano errate^16,17,18. All'ematocrito fisiologico (superiore a circa il 25%), i globuli rossi (RBC) non sedimentano come aggregati separati, ma piuttosto come una rete continua, cosiddetta percolante, di globuli rossi 17,18, obbedendo a un diverso insieme di equazioni fisiche rispetto alla sedimentazione di Stokes ^16,17 solitamente menzionata. È stato dimostrato che considerare una descrizione fisica basata sulle misure risolte nel tempo della sedimentazione (intera curva) era più robusto in alcuni nuovi contesti medici^19,20. Inoltre, queste misurazioni potrebbero essere utilizzate per far luce sui meccanismi fisici che alterano la VES in patologie in cui le forme cellulari sono alterate^19,20. Inoltre, una VES lenta può avere un'utile interpretazione medica, come indicato nelle misurazioni di una coorte di pazienti con sindrome da neuroacantocitosi^19,20. Questo articolo esamina come implementare praticamente la misurazione di parametri fisicamente significativi, in base all'intera cinetica ESR. Più precisamente, il metodo qui presentato estrae la velocità massima di sedimentazione U_m, il cui valore può essere corretto per considerare l'effetto dell'ematocrito del donatore^16,17. Questo parametro è più preciso e quindi più affidabile della misura tradizionale^16,17,19,20.

Inoltre, in alcune ricerche fondamentali, invece di monitorare lo stato infiammatorio di un determinato paziente, è interessante escludere l'effetto dell'ematocrito sulla VES 21,22,23, o indagare il ruolo dei globuli rossi in una VES modificata 19,20,24,25 tra diversi donatori. Potrebbe essere utile confrontare campioni che non sono direttamente campioni di sangue completi di pazienti. Pertanto, la sospensione dei globuli rossi con un ematocrito controllato nel plasma autologo, o in un sostituente del plasma, potrebbe essere utilizzata come primo passo della misurazione della VES. Ad esempio, soluzioni di destrano 70 kDa con una concentrazione di 55 mg/ml in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) producono un intervallo di sedimentazione all'interno dell'intervallo di controllo per le cellule sane¹⁹. Questo manoscritto mostra anche come tali passi dovrebbero essere condotti, e che l'analisi presentata è rilevante anche in questi casi.

Protocollo

La raccolta di campioni di sangue e gli esperimenti sono stati approvati dalla "Ärztekammer des Saarlandes", ethics votum 51/18, ed eseguiti dopo aver ottenuto il consenso informato secondo la Dichiarazione di Helsinki. Le misurazioni standard devono essere eseguite con sangue anticoagulato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione standard di EDTA di 1,6 mg/ml di sangue, norma europea NF EN ISO 6710), in provette di Westergren. Il volume richiesto per riempire il tubo Westergren dipende dal produttore (poiché le parti inferiori a volte contengono un serbatoio più largo); Il volume deve essere di circa 1 ml di sangue pieno e 800 μL per le provette indicate nella tabella dei materiali. Il metodo descritto di seguito è comunque valido indipendentemente dalla specifica forma della sospensione e del contenitore, purché l'ematocrito dei campioni sondati sia superiore al 25%¹⁶. Volumi, contenitori, mezzi di sospensione e additivi dovrebbero quindi essere selezionati in base agli obiettivi specifici della ricerca eseguita.

1. Esperimenti e misurazioni

NOTA: Registrare la velocità di sedimentazione del campione ogni minuto.

1. Preparazione del campione (se necessario): se è necessario un ematocrito di controllo o un liquido sospensivo, iniziare lavando le cellule e preparando i campioni (ad esempio, mostriamo come preparare campioni con vari livelli di fibrinogeno, mescolando siero e plasma autologhi). Il siero può infatti essere approssimato come plasma libero da fibrinogeno^26,27, e può essere utilizzato per diminuire l'aggregazione dei globuli rossi^, in condizioni altrimenti fisiologiche. Per preparare diversi campioni, raccogliere il sangue in provette EDTA standard da 9 ml e il siero in provette di siero standard (con perle di silice come attivatori della coagulazione) di 9 ml.
   1. Centrifugare i campioni di sangue (cioè 9 ml di EDTA standard e provette di siero nell'esempio scelto) a 3.000 x g per almeno 7 minuti, per una compattazione ottimale degli eritrociti imballati. Sostituire il surnatante con PBS o il liquido di sospensione desiderato, se è disponibile una quantità sufficiente. Se è semplicemente necessario controllare l'ematocrito nel plasma autologo, procedere direttamente al punto 1.1.3. Altrimenti, mescolare delicatamente dopo l'inclusione del surnatante per il lavaggio.
   2. Ripeti tre volte. Eseguire l'ultimo lavaggio con il liquido di sospensione desiderato in ogni caso.
      1. Nell'esempio scelto, preparare miscele di plasma autologo e siero con proporzioni determinate (ad esempio, 25%/75%, 50%/50% o 75%/25% della frazione volumetrica plasma-siero). Ad esempio, quando si preparano 2,5 ml della miscela plasma-siero al 25%/75%, aggiungere 0,625 ml di plasma a 1,875 ml di siero.
   3. Estrarre il volume richiesto di celle imballate e sospenderlo nel liquido desiderato. Trattare le celle imballate come un liquido altamente viscoso (utilizzando il pre-pipettaggio standard e/o il reverse pipetting o una pipetta a spostamento positivo²⁸). Nell'esempio scelto, per un campione di 4 ml con un ematocrito del 45%, sospendere 1,8 ml di cellule imballate entro 2,2 ml dalla miscela plasma-siero.
2. Se l'ematocrito del campione non è controllato, determinarlo mediante microcentrifugazione ad alta velocità (sono adatti anche altri metodi standard).
   1. Estrarre la quantità necessaria di campione per la determinazione dell'ematocrito: riempire i capillari del microematocrito immergendo la punta inferiore nel liquido. Fermarlo coprendo l'apertura superiore quando la quantità richiesta di campione sale nel tubo mediante aspirazione capillare.
   2. Sigillare i capillari con ceralacca. Metterli nella centrifuga micro-ematocrito e farlo funzionare a 15.000 x g (12.000 giri / min) per 5 minuti o secondo le istruzioni del produttore.
   3. Leggere il livello di ematocrito sul capillare e scriverlo per riferimento.
3. Impostare una telecamera per registrare la sedimentazione dei campioni. Per evitare di sovraccaricare la memoria o scaricare la batteria, alimentare il dispositivo dalla rete elettrica e salvare le immagini direttamente su un computer o un disco rigido esterno.
   1. Posizionare una telecamera fissa davanti al supporto in cui i tubi ESR verranno lasciati a riposo. Usa uno sfondo bianco illuminato (i fogli di carta bianchi sullo sfondo funzionano perfettamente).
   2. Utilizzando tubi Westergren vuoti, preferibilmente senza marcature, impostare la messa a fuoco e il campo visivo della telecamera per ottenere la massima risoluzione in cui verranno posizionati i campioni. Preferibilmente, assicurarsi che i bordi delle immagini siano allineati nella direzione verticale e orizzontale.
   3. Scatta una foto di un tubo in scala per estrarre la risoluzione in pixel. Si consiglia l'uso di immagini RGB.
   4. Impostare la luce e il tempo di esposizione della fotocamera in modo che abbia uno sfondo bianco, ma senza saturazione. L'esempio in Figura 1 è stato ottenuto utilizzando una Canon EOS M50, con un tempo di esposizione di 1/15s, un'apertura di F8.0, bilanciamento del bianco al tungsteno, in modalità scatto singolo con messa a fuoco manuale e una velocità ISO di 1.000.
4. Preparare e posizionare i tubi ESR.
   1. Riempire il contenitore inferiore del tubo Westergren con il volume corrispondente alle istruzioni del produttore. Inserire il tubo Westergren nel contenitore inferiore come indicato dal produttore.
   2. Non appena il primo tubo è pronto, posizionarlo nel supporto e avviare la registrazione della fotocamera. La registrazione di un'immagine ogni minuto di solito fornisce una buona risoluzione della curva cinetica ESR.
   3. Preparare e posizionare i campioni successivi. Assicurati di non stare di fronte a nessun campione quando viene scattata una foto.
   4. Lasciare che le misurazioni vengano eseguite per almeno 2 ore, al fine di confrontare con le misurazioni standard a 30 min, 1 h e 2 h. Tuttavia, è anche meglio vedere la saturazione e l'arresto della sedimentazione. Per campioni sani, o in caso di infiammazione, la registrazione dei campioni durante la notte, tra 12 h e 24 h, è più che sufficiente poiché la curvatura dei campioni più veloci è visibile entro 3 h^13,19. Tuttavia, se una condizione diminuisce la velocità di sedimentazione, come fa una diminuzione della concentrazione di fibrinogeno (cioè, nell'esempio scelto, alta frazione di volume sierico), potrebbero essere necessarie registrazioni di 50 ore o più per ottenere le informazioni più accurate^16,19.

2. Analisi delle immagini

NOTA: una volta registrate le immagini, estrarre la curva ESR. Un esempio di codice Matlab viene fornito come file supplementare 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. Selezionare o identificare una regione di interesse (ROI) in cui è visibile un solo tubo, il cui bordo inferiore si trova sotto la posizione più bassa dell'interfaccia del plasma privo di cellule eritrocitarie ma all'interno del campione (vedere Figura 1A, B). Se necessario, ruotare l'immagine in modo che la direzione verticale sia allineata lungo il primo componente dell'immagine.
2. Converti il ROI dell'immagine RGB in un'immagine in scala di grigi o matrice Gr. Di solito, combinando i canali a tre colori (rosso [R], verde [G] e blu [B]) come Gr = 2 * R - B - G è molto efficiente con uno sfondo chiaro (vedere Figura 1C e MatlabCodeImageAnalysisSampled.m righe 121-128).
3. Binarizzare l'immagine. Per un campione integro, l'utilizzo della soglia Otsu²⁹ in genere fornisce un risultato coerente (vedere la Figura 1D e la riga 133 di MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Per i campioni con un ematocrito alto o con qualche emolisi, potrebbe essere meglio regolarlo manualmente o utilizzare un altro metodo automatico (come fatto nelle righe 129-131 di MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), a seconda dell'esatto contrasto ottenuto tra le varie fasi all'interno del tubo.
4. Ottenere la media dei valori di pixel (o elementi) di Gr lungo la direzione orizzontale. Questo passaggio riduce al minimo il rumore e calcola in modo efficiente la media delle possibili irregolarità dell'interfaccia (vedere la Figura 1E e MatlabCodeImageAnalysisSampled.m riga 137).
5. Prima di calcolare le variazioni, smussare la curva con una media mobile, soprattutto se i tubi contengono alcuni segni orizzontali (vedi Figura 1F). Per gli esempi forniti, per questo processo è stata utilizzata una finestra mobile di ~2,5 mm (50 pixel) (vedere la riga 138 di MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Quindi, identificare la posizione dell'interfaccia come il punto con la variazione di intensità più elevata (vedere la Figura 1G).
6. Ripetere l'operazione per ogni immagine e ogni campione. Per ogni campione, salvare le posizioni dell'interfaccia nel tempo in un formato appropriato per adattare il modello fisico a qualsiasi software adatto.

3. Adattamento del modello fisico

1. Utilizzando qualsiasi software opportunamente adatto, conoscendo l'ematocrito e l'altezza iniziale della colonna sanguigna h 0, trovare i valori del tempo di ritardo t₀, il tempo adimensionale γ e la frazione di volume finale impacchettata Φ_mdegli eritrociti che minimizza la somma delle deviazioni residue al quadrato per il modello fisico¹⁷. Un codice Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) viene fornito come file supplementare 2 come esempio di come eseguire tale adattamento. Vedere il file supplementare 2 per ulteriori istruzioni. Come descritto altrove^16,17, eritrociti a sedimento ematocrito fisiologico come gel di particelle molli, dove i parametri fisici importanti sono la differenza di densità tra il plasma e i globuli rossi del donatore Δρ, il diametro caratteristico dei globuli rossi r_RBC^, la viscosità plasmatica a temperatura ambiente η e l'ematocrito del donatore Φ . Usando questi parametri, e supponendo che lo stress gravitazionale sia il principale processo trainante per il plasma a fluire verso l'alto attraverso la rete porosa formata dagli eritrociti dopo un tempo di ritardo t₀, si ottiene l'evoluzione temporale^16,17:
   
   con , , e essendo il raggio medio del disco di un eritrocita. Un esempio di codice Matlab che esegue questa operazione viene fornito come allegato (ShapeAnalyzerIntegrated.m si adatta alla funzione definita in SedimFit.m [File supplementare 3]). In alternativa, G/γ può anche essere utilizzato direttamente come parametro di adattamento con unità di 1/t.
2. Una volta estratta la curva quantitativa dall'immagine, salvare i parametri fisici del campione. I valori ESR tradizionali a 30 min, 1 h o 2 h possono ancora essere estratti dalla curva come riferimento (vedere ShapeAnalyzerIntegrated.m righe 123-132).

Risultati

Un esempio di sequenza di immagini correttamente acquisita è fornito come filmato supplementare 1 (MovieS1.avi). Una serie di adattamenti caratteristici del modello è mostrata per varie condizioni nella Figura 2. La concentrazione di fibrinogeno è stata determinata dalla concentrazione di fibrinogeno nel plasma Fib₀, supponendo che il siero non abbia alcun fibrinogeno. Quindi, Fib = C Fib₀, dove C è la frazione di volume p...

Discussione

Affinché il protocollo automatizzato funzioni in modo efficiente, è importante avere uno sfondo chiaro e un'illuminazione adeguata. Uno sfondo scuro potrebbe impedire l'esistenza di una soglia di binarizzazione efficiente. Per i campioni con una certa emolisi, che di solito si verifica (aumenta) nel tempo, è importante verificare prima che la soglia di binarizzazione scelta sia rilevante sia per le immagini iniziali che per quelle finali.

Quando si tratta del processo di binarizzazione dell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 - Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.