進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

要約

このプロトコルは免疫不全のマウスの盲腸壁の患者得られた癌細胞の同所性移植を記述する。このモデルは、進行した大腸がんの転移性疾患を再現し、肺および肝臓転移の臨床的に関連するシナリオにおける新しい治療薬の評価を可能にします。

要約

過去10年間で、患者由来のがん細胞と3D腫瘍様を用いて、より洗練された前臨床大腸がん(CRC)モデルが確立されてきました。患者由来の腫瘍オルガノイドは元の腫瘍の特徴を保持できるため、これらの信頼性の高い前臨床モデルにより、がん治療薬のスクリーニングや薬剤耐性メカニズムの研究が可能になります。しかしながら、患者における大腸がん関連死は、主に転移性病変の存在と関連している。したがって、ヒトのがん転移の主要な分子的特徴を真に再現する関連する in vivo モデルで抗がん療法の有効性を評価することが不可欠です。大腸がん由来のがん細胞をマウスの盲腸壁に直接注入した同所性モデルを確立しました。これらの腫瘍細胞は盲腸に原発腫瘍を発症し、肝臓や肺に転移し、進行した大腸がん患者によくみられる。このCRCマウスモデルは、患者の原発腫瘍または転移を容易に特定できる臨床的に関連する小規模イメージング法であるマイクロコンピューター断層撮影法(μCT)によってモニターされる薬物反応を評価するために使用できます。ここでは、免疫不全マウスの盲腸壁に患者由来のがん細胞を移植するための手術手順と必要な方法論について説明します。

概要

大腸がん(CRC)は、世界のがんによる死亡原因の第2位です¹。個々の患者の腫瘍細胞に由来するin vitroまたはin vivoの腫瘍モデルを生成する能力は、腫瘍学における精密医療を進歩させてきました。過去10年間で、患者由来オルガノイド(PDO)または異種移植片(PDX)は、世界中の多くの研究グループによって使用されてきました²。PDOは、元の腫瘍組織の特徴に似た多細胞in vitro構造であり、自己組織化および自己複製が可能です³。これらの有望なin vitroモデルは、薬物スクリーニングやトランスレーショナルリサーチの促進にうまく使用できます。一方、PDXモデルは、組織学から分子形質、薬物反応まで、関連するすべてのレベルで元のCRCを忠実に再現しています^2,4。

生体内 PDXモデルは、主に免疫不全マウスの皮下腫瘍として増殖します。このアプローチにより、PDXはがん研究、特に薬剤感受性や耐性の研究においてゴールドスタンダードとなっています。しかしながら、大腸がん関連死は、肝臓、肺、または腹腔における転移性病変の存在とほとんどが関連しており、2つのアプローチ(PDOまたはPDX)のいずれも、進行した臨床環境を再現することはできない。さらに、腫瘍増殖の特定の部位は、薬効や疾患の予後に影響を与える重要な生物学的特性を決定することが示されています²。したがって、臨床的に関連する転移性設定における抗がん剤の有効性を評価するために使用できる前臨床モデルを確立することが急務です⁶。

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)スキャナーは、縮小された臨床用CTスキャナーとして機能し、がん患者のCT画像に比例したスケーリングされた画像解像度でマウスの原発腫瘍および転移画像を提供する^{ことができます7}。μCT技術による軟部組織のコントラストの悪さを打ち消すために、放射線ヨウ素化造影剤を使用してコントラストを改善し、腫瘍量を評価することができます。二重造影アプローチを使用して、経口および腹腔内ヨウ素を異なるタイミングで投与します。経口投与される造影剤は、腫瘍組織と腸内の盲腸含有量との間の限界を定義するのに役立ちます。 他方では、腹腔内に投与された造影剤は、頻繁に増殖して腹膜に浸潤する腫瘍塊の外部限界の同定^{を可能にする8。}

この論文では、免疫不全マウスの盲腸壁に患者由来のがん細胞を同所性移植するためのプロトコルと、μCTスキャンを使用して腸管腫瘍の増殖をモニターする方法について説明しています。本稿は、このモデルが、PDOまたはPDXOモデルを使用して研究できないCRC患者における進行性腸腫瘍および転移性疾患の臨床シナリオを再現していることを示しています。大腸がんの同所性PDXモデルは大腸がん患者の臨床シナリオを再現しているため、進行した腸腫瘍および転移性疾患における抗腫瘍薬の有効性を検証するためのこれまでの最良のモデルであると結論付けた。

プロトコル

すべての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。このプロジェクトは、スペインのバルセロナにあるバル・デブロン大学病院の研究倫理委員会によって承認されました(承認ID:PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014、PR(AG)18/2018)。ヒト結腸組織サンプルは、腫瘍切除を受けた結腸がんおよび直腸がんの患者に対応する原発性腺がんまたは肝転移の非壊死領域からの生検で構成されていた。実験は欧州連合の動物管理指令(86/609 / EEC)に従って実施され、VHIR-Vall d'Hebron Research Instituteの動物実験倫理委員会(ID:40/08 CEEA、47/08/10 CEEA、および12/18 CEEA)によって承認されました。

注:女性のNOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl)マウス(生後8週齢)をCharles River Laboratoriesから購入した。

1. 患者細胞の誘導

1. 腫瘍摘出
   注:次の手順は、動物施設の室温(RT)の生物学的キャビネット内で実行されます。
   1. 患者の手術や生検、およびマウスの皮下増殖したPDXから腫瘍サンプルを入手します。
   2. 同所性注射では、患者から直接採取した組織ではなく、確立された皮下PDX腫瘍モデルから腫瘍細胞を調製する⁹。
   3. NOD-SCIDマウス²の脇腹に、マトリゲル基底マトリックス(50μL)と混合したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(50μL)に1 x 10⁵腫瘍細胞の懸濁液を皮下接種することにより、PDX腫瘍を作製する。
      1. 一日おきにノギスを使用して腫瘍の成長を測定します。
         注:重要なことは、私たちの研究室が350以上のPDXモデルのバイオバンクを生成したことです。プロトコルで使用されるCRC-PDX腫瘍モデルは、マウスで3継代以上増幅され、陽性の結果で選択/除外基準に合格したラボで確立されたPDXモデルです(表1)。
   4. 皮下腫瘍がCEEAによって確立された最大サイズ(直径1 cm)に達したとき、または動物がエンドポイント基準に達したときに、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
   5. 腫瘍を摘出し、はさみと鉗子を使用して皮膚と周囲の非腫瘍組織から慎重に除去します。
   6. 採取した腫瘍を次のステップまで4°CのPBSで保存します。
      注:細胞懸濁液中の腫瘍は、患者の病変またはマウスの皮下異種移植片の元の位置から除去した後、できるだけ早く解離してください。細胞生存率は、組織除去後24時間で著しく低下し、レシピエントマウスへの移植が非効率的になります。
2. 細胞調製
   注:以下の手順は、組織培養室の室温(RT)で生物学的キャビネット内で実行されます。
   1. 1 mLの完全CoCSCM 6Ab培地(表2)を含む10 cmの培養プレートのブレードを使用して腫瘍を解離します(ミンチを容易にするため)。均質に解離したサンプルを15 mLのコニカルチューブに入れます。
   2. CoCSCM 6Ab 培地を最終容量 5 mL まで添加します(同じチューブに 3 mL 以下の解離サンプルを使用します)。
      注:患者から切除された原発性大腸がんは、自然に細菌や真菌で汚染されています。6種類の抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン、菌類、カナマイシン、ゲンタマイシン、ナイスタチン)のカクテルを使用して、元の患者サンプルに存在する病原体を除去することが不可欠です。免疫不全マウスに細菌に汚染された腫瘍細胞を注射すると、動物が死亡する可能性があります。
   3. 50 μLのDNase I(0.08 kU/mL)および50 μLのコラゲナーゼ(1.5 mg/mL)(消化培地; 表2)細胞培養インキュベーター内で37°Cで45°の位置で1時間。インキュベーションの前に、15分ごとに5 mLピペットで溶液をよく混合します。
      注:腫瘍組織を解離し、ピペッティングで数回消化して単一細胞溶液を得ます。これは、レシピエントマウスに注入する前に細胞をカウントし、腫瘍細胞の均一な移植を達成するために不可欠です。
   4. 5 mLのCoCSCM 6Ab完全培地を加え、5 mLピペットでよく混合します。
   5. 新しい滅菌済み50 mLチューブを使用して、100 μmセルストレーナーで溶液を選別します。
   6. ソートしたセルを500 x g で8分間、室温でスピンします。
   7. 上澄みを吸引する。
   8. ペレットを3 mLの1x RBC溶解緩衝液に再懸濁します。
   9. 室温で10分間インキュベートします。
   10. 3 mL の完全 CoCSCM 6Ab 培地を添加し、サンプルをピペットで移し、室温で 500 x g で 10 分間遠心します。 上清を吸引します。
   11. 5〜10 mLの完全なCoCSCM 6Ab培地でペレットを再懸濁し、セルカウンターを使用して細胞の総数を計算します。
   12. 細胞を 500 x g で 10 分間室温でスピンし、10 mL の PBS に再懸濁します。
   13. ペレットを再懸濁して20 x 10⁶ 細胞/mLの濃度にし、よく混合して均一な細胞懸濁液を得ます。
   14. 組織培養液に盲腸注射用のシリンジ29 g(0.5 mL U 100針、0.33 mm [29 G] x 12.7 mm)を準備します(シリンジ/マウス1本)。50 μLの腫瘍細胞懸濁液(1 x 10⁶ 細胞/注射)をシリンジにロードし、氷上に保管します。細胞懸濁液から気泡が除去されていることを確認します。
       注:腫瘍細胞がシリンジにロードされているときに気泡を排除することは、組織の破裂やサンプルの損失につながる可能性のある盲腸壁に過剰な量の注入を避けるために不可欠です。同じ実験でマウス間で腫瘍の大きさが不均一にならないように、シリンジを装填する際に細胞懸濁液をよく混合することが不可欠です。

2. 盲腸への同所性注入

注:次の手順は、動物施設の特定の病原体を含まない(SPF)部屋のベンチで実行されます。使用する機器は、事前に洗浄および滅菌されています。さらに、動物施設内の個体間またはゾーン間で携帯型滅菌器で再度滅菌されます。

1. 消毒用洗剤をスプレーして拭き取り、手術部位をきれいにします。
2. マウス脱毛機を用いてマウスの腹部を脱毛する。
3. マウスを仰臥位に置きます。動物に麻酔をかけるために2%イソフルランを使用します。四肢を軽くつまみ、刺激がないことを観察することで麻酔の効果を確認します。
4. 麻酔中の乾燥を防ぐために、50〜100μLの動物用軟膏(3 mg / g Lacryvisc)を目に置きます。.
5. クロルヘキシジンまたはポビドンヨードで円を描くように数回こすり洗いして、マウスの腹部を消毒します。
6. 手術用ハサミを使用して下腹部を縦方向に1cm切開します。皮膚を各部位に慎重に分離して、皮膚の下にある腹膜を提示します。
7. 盲腸を外在化するのに十分な大きさの腹膜に0.5〜1cmの切開を行います。
   注:内臓を過度に操作せずに盲腸を外在化すると、手順の致死率が劇的に向上する可能性があります。
8. 事前にカットされた滅菌ガーゼを使用して、マウスから盲腸を慎重に分離します。
9. 手順全体を通して生理食塩水で盲腸を湿らせます。
10. 鉗子で慎重につかんで盲腸を固定し、針を盲腸壁に表面的に導入します。注射部位の毛細血管や血管は避けてください。細胞懸濁液から気泡を取り除きます。
11. 腫瘍細胞懸濁液50μL全体をゆっくりと注入します。通常、投与には約10秒かかります。針で盲腸内腔に穿孔すると、腸の蠕動運動によって腫瘍細胞懸濁液が体から排除されるため、避けてください。
    注:マウスの盲腸に腫瘍細胞懸濁液を注入することは、手順全体の中で最も困難なステップです。プロトコルのこの部分では、注射部位に焦点を合わせた明るい光と拡大ルーペを使用する必要があります。盲腸の表面と平行に針を刺します。盲腸は非常に壊れやすい組織です。したがって、盲腸の固定は、外科用鉗子を使用し、出血につながる組織の破裂を避けるために穏やかな圧力をかけることによって行う必要があります。移植が成功すると、盲腸壁に白い気泡(細胞のペレット)が発生します。気泡が視覚化できない場合は、盲腸に穴が開いていて、細胞が盲腸内腔で終わっているため、腸管によってクリアランスが行われていることを示している可能性があります。
12. 注射後、盲腸からゆっくりと針を抜き、綿の先端のアプリケーターで注射部位に穏やかな圧力をかけて、腫瘍細胞が逃げないようにし、わずかな出血を減らします。
13. 盲腸を生理食塩水で洗浄し、破片を取り除きます。
14. 盲腸を動物の腹部に戻します。
15. 5/0縫合糸を使用して腹膜を閉じます。
16. 5/0縫合糸を使用して腹部の皮膚を閉じます。
17. 術後抗生物質(100 mg / kgアモキシシリンまたは20 mg / kgエンロフロキサシン)と鎮痛薬(5 mg / mLメタカム/メロキシカム)を皮下注射で投与します。.マウスを加熱パッドの上に置き、完全に回復するまでそのままにしておきます。その後、他の動物と一緒にケージに戻します。

3. μCTスキャンによる同所性腫瘍増殖の評価

注:以下の手順は、動物施設から前臨床イメージングプラットフォーム(PIP)で実行されます。

1. すべての動物処置は、施設倫理委員会の規則に従って行います。
2. 細胞注入の2週間後からμCTによる腫瘍体積のモニタリングを開始し、その後は毎週開始します。
3. 造影剤イオパミロ(300 mg / mL)を生理食塩水で、両方の用量で3:1の比率で新たに希釈します。.300 mLのイオパミロを経口強制経口投与します。.
   注:μCTは軟部組織のコントラストが悪いため、造影剤を使用して技術の感度を向上させることをお勧めします。プロトコルには、管腔内腫瘍の負担を区切るためのヨウ素ベースの薬剤(イオパミロ)の経口投与と、腸の内臓表面の腫瘍負担を定義するための同じ薬剤の二次腹腔内投与が含まれます。造影剤が排泄される前にマウスの盲腸に到達する必要がある正確な時間を決定するために、パイロット実験が以前に実施されました。イオパミロの場合は2時間前後です。
4. 2時間後、以前に希釈した300 mLのイオパミロの腹腔内注射を投与します。.投与は、頭頂面の腫瘍限界を定義するのに役立ちます。
5. 2%イソフルランを使用して動物を麻酔します。
6. マウスの足をつまんで正しく麻酔されていることを確認したら、μCTの走査ベッドに動物を置きます。最適な姿勢は仰臥位(うつ伏せ)です。
7. 制御ソフトウェアで、ライブモード(透視モード)を開始して、腹部領域をスキャナーの視野(FOV)に配置します。これを行うには、希望の位置になるまでベッドを前後左右に動かします。X線管と検出器を90°回転させ、スキャンベッドをy軸に動かして動物を完全に中央に配置します。
8. FX μCTイメージングシステムを使用して、μCTスキャン画像には、30 mm FOV、26 sの取得時間、90 kVの電流電圧、200 μAの電流アンペア数のパラメータを使用します。
9. スキャンが終了したら、動物をケージに戻して回復させます。動物が麻酔から回復するまで体温サポートを行い、飼育舎に戻るまで監視します。
10. μCT取得では、各スキャンで250 Mbサイズのファイルが得られます。作成されたデータファイルはVOX形式です。画像解析ソフトウェアでアクセスできるようにするには、μCTのデータベース管理ソフトウェアを使用してファイルをDICOM形式に変換します。 作成したファイルのバッチをポータブルハードディスクに保存して、利用可能なイメージングソフトウェアを備えた任意のコンピューターを使用して分析します。
    注:画像解析中、盲腸は放射線密度の高い内容物(イオパミロ)を持つ拡張した腸として局在し、多くの場合、尾側腹部の左側に局在します。盲腸の内臓屈曲では、隣接する腸領域と比較して、壁の肥厚が観察されます。肥厚は腫瘍の成長に対応します。
11. 腫瘍が局在したら、さまざまなビュー(軸、冠状、矢状)で最大直径を見つけます。これら3つの軸を測定し、楕円体式に従って腫瘍体積を計算します:体積= 4/3πx(x-semiaxis x y-semiaxis x z-semiaxis)¹⁰。

4. 同所性腫瘍を有するマウスへの治療的介入

1. 同所性腫瘍を有するマウスを毎週監視します。
2. ほとんどのマウスで腫瘍のμCTスキャン信号が検出されたら、翌週にもう一度μCTスキャンを行い、腫瘍の存在を確認します。
   注:治療を開始する時間は、使用するPDXモデルによって異なり、盲腸への腫瘍細胞接種後3〜12週間で異なります。
3. マウスをビヒクル群(n = 10〜15匹のマウス)、試験薬群(n = 10〜15匹のマウス)、標準治療化学療法群(n = 10〜15匹のマウス)、および併用治療群(n = 10〜15匹のマウス)の4つのグループに無作為化します。
4. 生理食塩水(ビヒクル群)、試験薬(20mg/kg)(試験薬群)、イリノテカン(50mg/kg)(標準治療群)、または試験薬(20mg/kg)とイリノテカン(50mg/kg)(併用治療群)でマウスを腹腔内治療する。実験が終了するまで週に1回投与を行います。
5. 実験の過程で、μCTスキャンによって腫瘍の成長を毎週監視します。
6. 実験の最後に、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させ、肝臓、肺、および他の臓器のその他の可能性のある病変を収集します。
7. 組織サンプルをカセットに入れ、4%ホルマリン中で一晩インキュベートします。盲腸に腫瘍のないマウスの腸組織を対照として使用します。
8. カセットをホルマリンから取り出し、70%エタノールと少なくとも3時間インキュベートします。
9. 組織病理学施設の標準プロトコルを使用して、カセットにパラフィンを埋め込みます。
10. 盲腸、肝臓、肺からのヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を、病理組織学施設の標準プロトコルを使用して実施します。

結果

患者由来のがん細胞を同所的に移植したマウスを、μCTスキャンによって毎週モニターしました。実験の最後に、動物は安楽死させられました。腸、盲腸(図1A、B)、肝臓、肺、およびその他の可能性のある病変を採取し、カセットに入れ、4%ホルマリンで一晩固定しました。盲腸に腫瘍のないマウスの腸組織を対照として使用しました(図1C

ディスカッション

過去数十年にわたり、多くの新しい抗がん療法が開発され、大腸がん(CRC)を含むさまざまな種類の腫瘍の患者でテストされてきました。前臨床モデルでは多くの症例で有望な結果が観察されているが、進行性転移性CRC患者における治療効果はしばしば制限されている。したがって、臨床的に関連する転移シナリオで新しい治療薬の有効性をテストできる前臨床モデルが緊急に必要とされてい?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083