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要約

マイコプラズマ・ニューモニエ感染症では、血清学的検査は良好な結果を生み出すことができますが、免疫学的交差反応のために特異性は低くなります。この論文に記載されている社内抗原捕捉ELISAは、高い種特異性を保証し、肺炎球菌の正確な診断のための信頼できるスクリーニング検査であることが示されています。

要約

マイコプラズマ・ニューモニエ は細胞壁欠損原核生物であり、主にヒトの気道にコロニーを形成し、流行していることが知られており、年長の子供や若年成人では6年ごとに流行のピークがあります。 M.肺炎 の診断は、病原体の潔癖な性質と無症候性の運搬の可能性があるため、困難です。患者の血清サンプル中の抗体滴定に基づく 肺炎 菌感染症の臨床検査は、依然として最も実践されている方法である。 M. pneumoniaeに対するポリクローナル血清の使用による免疫学的交差反応性の潜在的な問題のために、血清学的診断の特異性を改善するために抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が開発されました。ELISAプレートは、 M. pneumoniae ポリクローナル抗体でコーティングされ、ウサギで飼育され、 M. pneumoniae 種と抗原を共有する、および/または気道にコロニーを形成することが知られている異種細菌のパネルに対する吸着後に特異的になります。反応した M. pneumoniae 相同抗原は、次いで、血清サンプル中のそれらの対応する抗体によって特異的に認識される。抗原捕捉ELISAが受ける物理化学的パラメータのさらなる最適化は、非常に特異的で、感度が高く、再現性の高いELISAにつながりました。

概要

マイコプラズマは 、最も小さく、最も単純な既知の原核生物の一つです。それらは主に細胞壁構造の欠如によって他の細菌と区別される。したがって、 マイコプラズマは モリキューテス1という名前の別のクラスに分類されました。細胞壁欠損症は、いくつかの抗菌剤に対してこれらの微生物に対する固有の耐性を与え、それらの多型の主な原因です。 マイコプラズマは ゲノムが小さく、サイズが小さく、代謝および生合成能力が制限され、寄生および腐生の性質を説明しています1。

マイコプラズマ・ニューモニエは、人間に感染するマイコプラズマの1つであり、最も毒性が高いと考えられています2。M.肺炎は上気道にコロニーを形成し、小児および若年成人に非定型肺炎を引き起こします。肺炎球菌感染によって引き起こされる臨床徴候はインフルエンザのようなもので、頭痛、発熱、咳3があります。宿主細胞に対するM. pneumoniaeの細胞付着は、P1主要な接着およびいくつかの付属品タンパク質を含む付着オルガネラによって媒介される4,5。気道粘膜へのM.肺炎の密接な付着に起因する局所的な炎症および宿主免疫系の刺激のために、より多くの臨床症状が発生する可能性があります6。肺炎は肺炎菌感染の特徴ですが、この細菌による感染は、中枢神経系、心臓、皮膚、関節などのさまざまな解剖学的部位における広範囲の非肺症状の原因にもなる可能性があることが明らかになっています7。

すべてのマイコプラズマ種に関して、M.肺炎の診断は困難です。マイコプラズマ症を誘発する臨床徴候はほとんど不明であり、特徴的ではありません8。肺炎球菌感染症を臨床症状と症状のみに頼って診断することは非常に難しいため、臨床検査は特に興味深いものです9。培養によるM.肺炎コロニーの検出は、適切な診断のためのゴールドスタンダードの方法です。しかし、慎重な成長要件と決定的な結果の提供に必要な長い時間(1〜2週間)は培養を複雑にし、したがってそれが日常的な診断に使用されることはめったにないことを意味します10。核酸増幅技術は速度と効率の点で検証されましたが、コストが比較的高く、一部の医療施設では利用できないため、これらの分子技術は第一選択の診断テストとは見なされません。市販のPCR検査が肺炎球菌感染症の診断に広く使用されているのは事実ですが、それでも血清学に取って代わることはできません。また、偽陰性と偽陽性の両方の結果が頻繁に発生するため、PCR9の使用が制限されています。日常的に、血清学は、肺炎球菌感染症の診断のために実験室で最も実践されています。冷赤血球凝集素、補体結合試験11、間接赤血球凝集試験12、免疫蛍光13、および1980年代初頭にマイコプラズマ血清学に最初に適用されたELISAの技術など、いくつかの血清学的アプローチが数十年にわたって報告されています14,15,16。肺炎球菌感染症のELISA血清診断を行う際に遭遇する主要な問題の1つは交差反応であり、これは技術の特異性をかなり低下させる。M.肺炎抗原によるヒト血清の非特異的吸着は以前に報告されています。実際、ヒト血清中のELISAによって検出された抗体の多くは、一部の細菌18,19および一部の動物およびヒト組織とのM.肺炎の共通性のために、マイコプラズマ抗原17に常に結合しているとは限りません20。

実験室で実施された従来のELISA検査で観察された高いバックグラウンド測定値のために、結果の解釈はしばしば複雑であり、したがって適切な肺炎球菌診断の提供は困難な課題でした。この問題に直面しながら、我々は、M. pneumoniae抗原と試験する抗体との非特異的反応を除去することにより、M. pneumoniae ELISAを改善することを選択しました。この目的のために、吸着技術を用いて非特異的肺炎球菌抗原の選択的枯渇に取り組みました。実際、抗原捕捉ELISAの主な目的は、ヒト血清サンプル中の肺炎球菌免疫グロブリン(Ig)Gを特異的に検出することです。このELISAの概念は、主にヒト血清サンプルを追加する前に、肺炎球菌特異的抗原を選択的に捕捉することで構成されています。この選択性は、実験室でウサギで産生されたM.肺炎粗抗原をM.肺炎ポリクローナル抗血清とインキュベートし、モリキューテスクラスに属するかどうかにかかわらず、M.肺炎と抗原を共有する異種細菌のパネルに対する吸着によって種特異的にすることによって保証されます。 種および/または気道にコロニーを形成することが知られている。吸着手順を3回繰り返し、交差反応性を排除する効率をイムノブロッティングで試験した。開発されたELISAアッセイは、サンドイッチELISAと間接ELISAの組み合わせです。簡単に説明すると、ELISAプレートのウェルは、最初にM.ニューモニエに特異的なポリクローナル抗血清でコーティングされる。次いで、M. pneumoniae抗原が添加され、抗血清と試験対象の血清サンプル中に存在する抗体との間に捕捉される。形成された免疫学的複合体は、二次酵素結合抗体(ペルオキシダーゼ結合IgG)によって検出される。反応は発色基質の添加によって視覚化され、吸光度は分光光度法で測定されます。この社内ELISAを図1に模式的に示します。自家製のELISAは、肺炎球菌感染を特異的に検出するのに効率的であることが証明され、現在、日常的な診断活動で最も実践されている検査の1つです。

プロトコル

本研究は、チュニスパスツール研究所の倫理委員会によって確立された倫理的側面に準拠して実施された。

1. ELISA前のステップ:前提条件と前処理

  1. 細菌株および増殖培地
    注:本研究で使用されたモリキューテス種と壁に囲まれた細菌、およびそれらの増殖培地を 表1に示します。
    1. モリキューテス種の成長
      1. 各種のグリセロールストックから200 μLを1,800 μLの培地に接種します。
      2. pH変化が観察されるまで、5%CO2 で37°Cで2〜4日間静的にモリキューテス種を成長させます(pHインジケーターはフェノールレッドです)。
      3. 培養物の1/10倍 希釈液を培地に加え、培養液を10 mLにスケールアップし、同じ条件で再び増殖させます。
        注:代謝によると、一部のヒトモリキューテス種(M.ニューモニエ、M. ジェニタリウム、およびM. ファーメンタン)はグルコース発酵により培地を酸性化し、他の種(M.ホミニス および尿素プラズマ)はそれぞれアルギニン加水分解または 尿素加水分解によって培地をアルカリ化します。鳥類マイコプラズマに関しては、フレイ培地の酸性化はM. ガリセプティカムの存在を示し、そのアルカリ化は M.模倣物の成長を証明します。
      4. 50 μLの培養液を寒天プレートに広げ、細菌の増殖を確認します。寒天プレートを5%CO2 で37°Cに維持し、典型的な目玉焼きコロニー(マイコプラズマ)および暗いウニ様コロニー(尿素プラズマ)の外観について顕微鏡下で定期的に観察します。
    2. 非モリキューテス種の成長
      1. 非モリキューテス菌を3mLの培地中で37°Cで一晩培養する(200rpmで振とう)。
      2. 培養液の濁度を対照培地と比較して、増殖を確認します。
      3. 培養物の1/100番目の 希釈液を培地に加えて培養液を10 mLにスケールアップし、同じ条件で再び増殖させます。
  2. 抗原調製
    1. モリキューテス種の抗原調製
      1. タンパク質全体( M. pneumoniae および他のモリキューテス種の確認された培養物に存在する)を、40,000 x g で4°Cで30分間遠心分離することにより回収します。
      2. 上清を廃棄し、同じ条件で一連の3回の遠心分離により、1 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)でペレットを3回洗浄します。
      3. 各抗原を500 μLのPBSに再懸濁します。
    2. 非モリキューテス種の抗原調製
      1. 非モリキューテス菌の一晩増殖培養物を1,500 x gで15分間遠心分離します。
      2. 各細菌ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。
        注:タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準21とする古典的なブラッドフォード定量法を使用して決定されます。モリキューテス種のタンパク質濃度は通常0.7〜4.8 mg / mLの範囲です。.他の細菌種の場合、タンパク質濃度は20 mg / mLに達する可能性があります。すべての抗原は、その後の使用まで-20°Cで保存されます。
  3. イムノブロッティングによる交差反応性スクリーニング
    1. 各抗原8 μLを等量のサンプルバッファー(0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、10%グリセロール[v/v]、10% SDS [w/v]、および0.2%ブロモフェノールブルー)と混合し、100°Cで5分間インキュベートして細菌タンパク質を変性させます。
      注:変性は、タンパク質を負電荷で覆い、それらの二次構造を破壊するために行われ、これにより、タンパク質がポリアクリルアミドゲルを横切って走り、分子量に従って分離することができます。
    2. 変性タンパク質(100 μgタンパク質/ウェル)を、12%分離ゲルと5%スタッキングゲルを含むLaemmliの方法22 によるドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にかけます。その後、Towbinらの方法23によりタンパク質をニトロセルロース膜に電気泳動で移す。
    3. ニトロセルロースメンブレンをPBSの5%スキムミルクに30分間浸して、空いている表面をブロックします。PBS-Tween 20で1/200に希釈したウサギポリクローナル M.肺炎 抗血清(チュニスパスツール研究所で製造)を使用して室温で2時間タンパク質ブロットをインキュベートし、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗ウサギIgGをPBS-Tween 20で1/2,000に希釈して室温で1時間インキュベートします。
    4. 未結合の抗体をPBSで洗い流し、ニトロセルロースシートを基質溶液(4−クロロ−1−ナフトール、H2O2)にさらすことによって結果を得た。5〜15分後に水を加えて反応を停止します。
  4. 吸着手順
    注:ポリクローナル M.肺炎 抗血清と異種細菌抗原との間の交差反応を排除するために、Ben AbdelmoumenとRoy24 によって以前に説明された吸着手順が採用されています。
    1. 肺炎 球菌と抗原を共有していると疑われる12種類の異種菌の抗原プールを用意し、微量遠心管で混合し、実験で吸着させる抗血清の半分に相当するタンパク質濃度を調整します。
      注:容量と濃度は、アッセイによって異なります。この工程は、主に吸着される抗体の濃度に依存する。例えば、抗体濃度=3.56mg/mLの場合、抗原プール(12個の異種細菌で構成)の濃度は1.78mg/mL(したがって、各抗原約0.148mg)である必要があります。
    2. 抗原混合物を14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、プールされたペレットを集めて、精製ポリクローナル抗M.肺 炎IgGをゆっくりと攪拌しながら37°Cで2時間インキュベートします。
    3. インキュベーション後、懸濁液を14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清(特定のポリクローナル M.肺炎 抗血清に相当)を回収します。
      注:ポリクローナル M.肺炎 抗血清の特異性を確保するために、吸着手順を3回繰り返します。ELISAアッセイで使用する前に、吸着されたポリクローナル M.ニューモニエ 抗血清を、含まれている細菌セットに対する交差反応がないことをイムノブロッティングによってテストする必要があります。

2. ELISAステップ:アッセイ自体

  1. 捕捉抗体によるマイクロプレートコーティング
    1. 捕捉抗体(M. pneumoniae 事前吸着ポリクローナル抗血清)を0.1 M炭酸塩-重炭酸塩バッファー(pH 9.6)で10 μg/mLの濃度に希釈します。
    2. 希釈した捕捉抗体100 μLを各ウェルに追加して、96ウェルELISAプレートをコーティングします。
    3. 4°Cで一晩インキュベートした後、コーティング溶液を取り出し、プレートを洗浄バッファー(組成[Lあたり]:NaCl146.29 g、トリス塩酸塩39.4 g、チメロサール0.2 g、Tween 20 0.5 mL、pH 7.3)で5回洗浄します。
  2. ブロッキング
    1. 各ウェルに100 μLのブロッキング溶液(PBS溶液0.5%カゼイン)を加えて、コーティングしたウェルの残りの結合面をブロックします。
    2. 室温で1時間インキュベートします。
    3. ブロッキング溶液をピペットで取り除き、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
  3. 抗原の応用
    1. 同量の M. pneumoniae 全タンパク質をすべてのコーティングウェル(10 ng/ウェル)に加えます。
    2. 室温で2時間反応させます。
    3. 過剰の抗原溶液を除去し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
  4. テストサンプルとコントロールの適用
    1. テストサンプル(ヒト血清)とコントロール(陽性および陰性血清を参照)をPBS-Tween1で1/200、1/400、および1/800に希釈します。
    2. 100 μLの希釈サンプルとコントロールを適切なウェルに加えます。各反応を二重に実行する。抗原も血清も含まないウェルをブランクとしてマークします。
    3. プレートを室温で90分間インキュベートした後、血清溶液を取り出し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
  5. 酵素結合検出抗体の応用
    1. 酵素結合検出抗体、HRP結合抗ウサギ、および抗ヒトIgGをPBS-Tween 20で1/10,000に希釈します。
    2. 検出抗体を適宜希釈した100 μLを各ウェルにピペットで入れます。
    3. プレートを暗所で室温で1時間インキュベートした後、結合していない検出抗体を除去し、プレートを洗浄バッファーで5回洗浄します。
  6. 検出とデータ分析
    1. 3,3', 5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)色原体溶液を100 μL添加し、抗原抗体結合を可視化します。
    2. プレートを室温で30分間発達させた後、100 μLの停止液(7.5%H2SO4)を加えて酵素反応を停止します。
    3. マイクロプレートリーダーを使用して450 nmの波長での吸光度を読み取り、陽性指数(IP)の計算に基づいて結果を整理します。
      IP =テストされた血清の吸光度/カットオフの吸光度
      IP < 0.7: 否定的な結果
      IP = 0.7:テストは2週間以内に繰り返す必要があります
      IP > 0.7: 肯定的な結果
      注:IPフォーミュラは実験室で考案され、0.7値は最適化後に設定されます。重複反応については、吸光度の平均値が計算されます。最適な血清希釈および抗原濃度は、ELISAチェッカーボード滴定法によって確立される(データは示さず)。カットオフ値=基準陽性血清(サンプルと同じ希釈液で希釈)のOD(光学濃度)。このODは、ネガティブコントロールのOD値の少なくとも3倍である必要があります。

3. ELISA後のステップ:結果の評価とテストの検証

  1. 検査された患者の肺炎球菌感染を特異的に診断する社内ELISAの能力は、肺炎球菌と異種細菌の抗原を使用した補足イムノブロットによって評価され、肺炎球菌抗体の検査ヒト血清の陽性と他の疑わしい細菌の陰性性が確認されます(データ示さず)。

結果

異種細菌に対する非吸着ポリクローナルマイコプラズマ・ニューモニエ抗血清のイムノブロッティング活性
イムノブロッティングの結果(図2)で示されているように交差反応性は実際に存在し、ポジティブコントロール(レーン1)と比較して、肺炎球菌抗原の一部はスクリーニングされた細菌と共有されています。こ?...

ディスカッション

この論文では、主に特定のスクリーニングを確実にするために開発された社内ELISAの一般的な説明を示します。 M. pneumoniae 感染症。ELISAアッセイ自体のプロトコルに関する詳細、およびいくつかの前処理および後処理ステップが提供されます。このアッセイの特異性は、吸着技術によって保証されます。この手順は、ヒトおよび鳥類の診断用に開発されたELISA試験で以前に説明されてい?...

開示事項

著者は、競合する利益はないと宣言しています。

謝辞

この研究は、チュニジア保健省とチュニジア高等教育科学研究省から資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

参考文献

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