Analisi dell'effetto dello stress salino composto sulla germinazione dei semi e analisi della tolleranza al sale del pepe (Capsicum annuum L.)

Riepilogo

Il documento seguente presenta un protocollo per misurare la germinazione dei semi, la crescita delle piantine e gli indici fisiologici di due varietà di peperoni con differenze di tolleranza alla salinità in risposta a sei concentrazioni di sale miste. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la tolleranza al sale delle varietà di pepe.

Abstract

Per determinare la tolleranza al sale e il meccanismo fisiologico del pepe (Capsicum annuum L.) nella fase di germinazione, le varietà Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, che hanno grandi differenze nella tolleranza al sale, sono impiegate come materiali di studio. Vengono utilizzate sei concentrazioni di sale miste di 0, 3, 5, 10, 15 e 20 g/L derivate utilizzando rapporti molari uguali di Na 2 CO 3, NaHCO₃, NaCl, CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 e Na ₂ SO₄. Per determinare i loro effetti, vengono misurati i relativi indici di germinazione dei semi, crescita della piantina e fisiologia e la tolleranza al sale viene valutata in modo completo utilizzando l'analisi della funzione di appartenenza. I risultati mostrano che all'aumentare della concentrazione di sale misto, il potenziale di germinazione, l'indice di germinazione, il tasso di germinazione, l'indice di vigore della germinazione dei semi, la lunghezza delle radici e il peso fresco delle due cultivar diminuiscono significativamente, mentre il tasso di sale relativo aumenta gradualmente. La lunghezza dell'ipocotile e il peso fresco fuori terra aumentano prima e poi diminuiscono, mentre l'attività di malondialdeide (MDA), prolina (Pro), catalasi (CAT), perossidasi (POD) e superossido dismutasi (SOD) diminuisce e poi aumenta. Il potenziale germinativo, l'indice di germinazione, il tasso di germinazione, l'indice di vigore della germinazione dei semi, la lunghezza della radice, il peso fresco della radice, il contenuto di MDA e Pro e l'attività CAT dei semi di Hongtianhu 101 sono superiori a quelli di Xinxiang 8 per tutte le concentrazioni di sale impiegate qui. Tuttavia, la lunghezza dell'ipocotile, il peso fresco fuori terra e il tasso di sale relativo sono inferiori in Hongtianhu 101 rispetto a Xinxiang 8. La valutazione completa della tolleranza al sale rivela che i valori ponderati totali dei due indici delle funzioni di appartenenza aumentano prima e poi diminuiscono all'aumentare della concentrazione di sale misto. Rispetto a 5 g / L, che ha il più alto valore di funzione di appartenenza, l'indice sotto le concentrazioni di sale di 3 g / L, 10 g / L e 15 g / L diminuisce rispettivamente del 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% e 41,4% -45,1%. Questo studio fornisce una guida teorica per l'allevamento di varietà di pepe tolleranti al sale e un'analisi dei meccanismi fisiologici coinvolti nella tolleranza al sale e nella coltivazione tollerante al sale.

Introduzione

La salinità è un importante fattore limitante per la produttività delle colture in tutto il mondo¹. Attualmente, quasi il 19,5% delle terre irrigate del mondo e il 2,1% delle terre aride sono colpite dalla salinità e circa l'1% dei terreni agricoli degenera in terreni salino-alcalini ogni anno. Entro il 2050, si prevede che il 50% dei seminativi sarà interessato dalla salinizzazione ^2,3. Oltre ai fattori naturali, come gli agenti atmosferici naturali delle rocce e l'acqua piovana salata vicino o intorno alla costa, la rapida evaporazione superficiale, le scarse precipitazioni e i metodi di gestione agricola irragionevoli hanno esacerbato il processo di salinizzazione del suolo. La salinizzazione del suolo inibisce la crescita delle radici delle piante e riduce l'assorbimento e il trasporto di acqua e sostanze nutritive dalle radici delle piante alle foglie. Questa inibizione provoca carenze fisiologiche di acqua, squilibri nutrizionali e tossicità ionica, che portano a una riduzione della produttività delle colture e a una completa perdita di resa delle colture. La salinizzazione dei terreni coltivati sta gradualmente diventando uno dei fattori di stress abiotici più critici che influenzano la produzione alimentare agricola globale⁴. Lo stress salino riduce i seminativi disponibili per l'agricoltura, il che può comportare uno squilibrio significativo tra l'offerta e la domanda di futuri prodotti agricoli. Pertanto, esplorare gli effetti della salinizzazione del suolo sulla crescita delle colture e sui meccanismi fisiologici e biochimici favorisce l'allevamento di varietà tolleranti al sale, l'utilizzo sostenibile del suolo salino e la sicurezza dei prodotti agricoli.

Il pepe (Capsicum annuum L.) è piantato in tutto il mondo grazie al suo alto valore nutrizionale e medicinale. Ad esempio, la capsaicina è un alcaloide responsabile del sapore piccante del pepe. La capsaicina può essere utilizzata per alleviare il dolore, perdita di peso, migliorare cardiovascolare, tratto gastrointestinale, e sistemi respiratori, e in diverse altre applicazioni⁵. Il pepe è anche ricco di sostanze bioattive, in particolare diversi composti antiossidanti (carotenoidi, fenoli e flavonoidi) e vitamina C⁶. Attualmente, il pepe è segnalato per essere la coltura vegetale con la più grande area di coltivazione in Cina, con un'area di piantagione annuale di oltre 1,5 x 10⁶ ettari, rappresentando così l'8% -10% della superficie totale di piantagione di ortaggi in Cina. L'industria del pepe è diventata una delle più grandi industrie vegetali in Cina e ha il più alto valore di produzione⁷. Tuttavia, la coltivazione del peperone è spesso soggetta a una varietà di stress biologici (parassiti e funghi) e abiotici, in particolare lo stress salino, che ha un impatto negativo diretto sulla germinazione, la crescita e lo sviluppo dei semi, con conseguente riduzione della resa e della qualità del frutto del pepe⁸.

La germinazione dei semi è il primo stadio di interazione tra le piante e l'ambiente. La germinazione dei semi è altamente sensibile alle fluttuazioni dei mezzi circostanti, in particolare allo stress salino del suolo, che può esercitare effetti invertiti sulla fisiologia e sul metabolismo e alla fine disturbare la normale crescita, lo sviluppo e la morfogenesi delle colture⁹. In studi precedenti, la germinazione dei semi di pepe e la crescita della piantina sotto stress salino sono state ampiamente studiate; tuttavia, la maggior parte degli studi ha utilizzato NaCl come unico sale per l'induzione dello stress^10,11,12. Tuttavia, il danno salino del suolo è dovuto principalmente alla tossicità degli ioni Na+, Ca 2+, Mg ²⁺, Cl-, CO₃ 2- e SO₄^2- generata dalla dissociazione dei sali di sodio, calcio e magnesio. A causa della sinergia e dell'antagonismo tra ioni, gli effetti del sale misto e del sale singolo sulla crescita e lo sviluppo delle colture possono essere molto diversi. Tuttavia, le caratteristiche corrispondenti della germinazione dei semi di pepe e della crescita nel sale misto non sono ancora chiare. Pertanto, due varietà di pepe con notevoli differenze nella tolleranza al sale sono utilizzate come materiali in questo studio. L'analisi degli effetti delle diverse concentrazioni di sale sulla germinazione dei semi di pepe, sulla crescita e sugli indici fisiologici e biochimici dopo la miscelazione equimolare di sette sali può rivelare il meccanismo di risposta della germinazione dei semi di pepe allo stress di salinità. Può anche fornire una base teorica per la coltivazione di forti piantine di peperone, nonché una coltivazione ad alta resa e di alta qualità in terreni coltivati a soluzione salina.

Protocollo

NOTA: Qui presentiamo un protocollo per valutare le caratteristiche di risposta e i meccanismi interni della germinazione dei semi di pepe e della crescita della piantina sotto diversi stress salini misti, che può servire come metodo di riferimento per la valutazione della tolleranza al sale di semi.

1. Preparazione sperimentale

1. Preparare i semi delle colture per le cultivar: Hongtianhu 101 con forte tolleranza al sale e Xinxiang 8 con bassa tolleranza.
2. Preparare la soluzione di KMnO₄ allo 0,2% come reagente di disinfezione delle sementi. In primo luogo, pesare 4,0 g di KMnO₄, quindi aggiungere 2.000 ml di acqua distillata.
   NOTA: Il permanganato di potassio è solitamente instabile a causa della sua forte ossidazione; Di conseguenza, viene preparato immediatamente prima dell'uso.
3. Preparare i sali miscelati usando sette sali, tra cui carbonato di sodio, bicarbonato di sodio, cloruro di sodio, cloruro di calcio, cloruro di magnesio, solfato di magnesio e solfato di sodio¹³. Aggiungi la stessa quantità molare di ciascuno, che successivamente rappresenta rispettivamente il 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% e 19,8% del rapporto di massa totale dei sali misti.
4. Preparare piastre di Petri (monouso) e carta da filtro (carta da filtro qualitativa a media velocità), entrambe con un diametro di 9 cm.
   NOTA: Il materiale della capsula di Petri può essere modificato; tuttavia, il diametro della piastra di Petri e della carta da filtro deve essere lo stesso.

2. Ammollo dei semi e preparazione per la germinazione

1. Per l'ottimizzazione dei semi, selezionare semi di pepe con dimensioni coerenti e particelle piene da ciascuna varietà, con un diametro medio di 4,2 mm e 3,7 mm per i semi di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, rispettivamente. Calcola il numero totale di semi selezionati in base al carico di lavoro del test.
2. Per la disinfezione dei semi, immergere i semi di pepe selezionati in una soluzione KMnO₄ allo 0,2% per 15 minuti e quindi risciacquare cinque volte con acqua distillata.
3. Per l'ammollo dei semi, trasferire i semi sterilizzati in acqua distillata e lasciarli in ammollo per 24 ore. Risciacquare i semi più volte con acqua distillata e asciugarli per un ulteriore utilizzo.
   NOTA: Il tempo di ammollo dei semi per diverse colture può variare.

3. Germinazione dei semi e crescita della piantina

1. Preparare sei concentrazioni dei sali miscelati: 0 (controllo), 3, 5, 10, 15 e 20 g/L. Misurare la conducibilità della soluzione salina utilizzando un misuratore di conducibilità; i valori EC di conducibilità della soluzione sono rispettivamente 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 e 15,22 ms/cm.
2. Per la preparazione dei semi, posizionare uniformemente 40 semi di pepe in una piastra di Petri con due strati di carta da filtro. Preparare i semi per sei trattamenti sperimentali e ripetere ogni trattamento cinque volte.
3. Per la germinazione dei semi, aggiungere una quantità adeguata delle sei concentrazioni di sale misto alla piastra di Petri per assicurarsi che la carta da filtro sia mantenuta umida. Mettere i semi in un incubatore ad aria a 28 ° C e 80% di umidità dell'aria per la germinazione al buio.
4. Dopo la germinazione dei semi, lasciare che le piantine continuino a crescere in luce (intensità luminosa di circa 450 Lux; ciclo luminoso di 12/12h) nell'incubatrice per 14 giorni dopo la semina. La temperatura e l'umidità nella fase di crescita della piantina devono essere le stesse utilizzate nella fase di germinazione.
5. Reintegrare la soluzione nel piatto di coltura ogni 12 ore per conservare una carta da filtro umida e lavare completamente la carta da filtro ogni 24 ore con la corrispondente concentrazione della soluzione salina mista per mantenere una concentrazione salina mista costante nella capsula di Petri.
   NOTA: La quantità di soluzione salina aggiunta ai semi umidi può essere regolata in base alle fasi di germinazione e crescita dei semi. Sono disponibili molti metodi per mantenere una concentrazione costante di soluzioni saline nei piatti di coltura. Oltre ai metodi descritti in questo esperimento, è possibile utilizzare la strategia di aggiungere acqua distillata in base al peso.

4. Misurazione e calcolo degli indicatori

1. Determinazione degli indici di germinazione dei semi
   1. Determinare il tasso di germinazione giornaliero dopo la semina, con il rivestimento del seme che rompe la radichetta che raggiunge la metà della lunghezza del diametro del seme come marcatore di germinazione.
   2. Calcolare il tasso di germinazione, il potenziale di germinazione, il tasso di sale relativo, l'indice di germinazione e l'indice di vigore della germinazione dei semi utilizzando le seguenti formule:
      Tasso di germinazione (%) = (numero di semi germinati normali il giorno 7 dopo la semina/numero di semi testati) × 100
      Potenziale germinativo (%) = (numero di semi germinati normali il giorno 3 dopo la semina/numero di semi testati) × 100
      Tasso relativo di sale (%) = (tasso di germinazione di controllo - tasso di germinazione del trattamento)/tasso di germinazione di controllo × 100
      calcolato utilizzando il tasso di germinazione dei semi il giorno 7 dopo la semina
      Indice di germinazione (GI) = ∑ [Gt/Dt]
      dove Gt si riferisce al numero di germinazione dei semi in un periodo di tempo (t) dopo la semina e Dt si riferisce ai corrispondenti giorni di germinazione
      Indice di vigoria germinativa dei semi (VI) = GI x S
      dove S è la lunghezza della radice
2. Determinazione dell'indice di crescita della piantina
   1. Il giorno 14 dopo la semina, selezionare casualmente 10 piantine rappresentative da ciascuna piastra di Petri e misurare la lunghezza della radice e la lunghezza dell'ipocotile.
   2. Usa un coltello per dividere le piantine di pepe in due parti: radichetta e parti fuori terra. Rimuovere l'acqua dalle piantine pulendo e pesare le piantine separatamente per determinare il peso fresco.
3. Determinare l'attività dell'enzima antiossidante, il livello di malondialdeide (MDA) e il contenuto di prolina (Pro) nel pepe come segue.
   1. Per preservare le piantine di peperone, selezionare piantine di peperoni interi rappresentativi (circa 24,0 g) da ciascun trattamento il giorno 14 dopo la semina. Dopo aver rimosso l'acqua superficiale, congelare immediatamente le piantine in azoto liquido per 1 minuto e conservarle in frigorifero a temperatura ultrabassa (-80 °C).
      NOTA: Il numero di campioni di piantine di peperoni conservate nel frigorifero a temperatura ultrabassa dovrebbe essere sufficiente, nel caso in cui alcuni indicatori debbano essere nuovamente testati.
   2. Prelevare circa 1,0 g di campione di piantina da ogni trattamento raccolto in triplice copia. Mettere il campione di piantina in una provetta da centrifuga, aggiungere azoto liquido e macinare il campione usando una barra di macinazione per determinare gli indici fisiologici delle piantine. Gli indici determinati e lo schema di misurazione sono mostrati di seguito.
   3. Determinare l'attività enzimatica protettiva della piantina (perossidasi [POD], catalasi [CAT], superossido dismutasi [SOD]), malondialdeide (MDA) e prolina (Pro) utilizzando un kit disponibile in commercio (basato sulla spettrofotometria) per ciascun fattore¹⁴.
      NOTA: Osservazioni precedenti non hanno rivelato alcuna differenza nello stress salino tra le concentrazioni di sale misto di 15 e 20 g/L. Di conseguenza, vengono misurate solo cinque concentrazioni di sale (0, 3, 5, 10 e 15 g / L).
4. Valutazione completa della tolleranza al sale utilizzando il metodo della funzione di appartenenza
   NOTA: la funzione di appartenenza utilizza un metodo di matematica fuzzy, che converte la valutazione qualitativa in valutazione quantitativa¹⁵, per valutare una varietà di indici fisiologici affetti da danni salini.
   1. Calcola il valore della funzione di appartenenza usando la seguente formula di Zhoubin Liu et ^al.15:
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Se un tratto è correlato negativamente con la tolleranza al sale, calcolare la funzione di appartenenza inversa utilizzando:
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Accumula i valori di appartenenza di ciascun indice fisiologico, dove Xi è il valore misurato di un certo tratto, Xmax e Xmin sono i valori massimo e minimo per Xi, rispettivamente, e Ri è il valore di appartenenza di quel tratto.
   2. Includere i seguenti indicatori rilevanti: caratteristiche di germinazione dei semi (potenziale di germinazione, tasso di germinazione, indice di germinazione e indice di vigore della germinazione dei semi), caratteristiche di crescita della piantina nella fase di germinazione (lunghezza della radice, lunghezza dell'ipocotile, peso fresco della radice e peso fresco fuori terra), MDA, Pro e attività enzimatica protettiva (CAT, POD, SOD) per il calcolo del valore della funzione di appartenenza. I valori della funzione di appartenenza sono ottenuti da ciascun indicatore.
5. Utilizzare fogli di calcolo e software SPSS (versione 22.0) per analizzare ed elaborare i dati del test e applicare il metodo della differenza meno significativa (LSD) per confronti multipli per identificare differenze significative. Utilizza l'analisi di correlazione di Pearson per studiare la correlazione tra la germinazione dei semi e gli indici fisiologici della piantina di pepe sotto stress salino composto.

Risultati

Caratteristiche di germinazione dei semi
All'aumentare della concentrazione di sale misto, il potenziale di germinazione e l'indice di germinazione di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuiscono significativamente. Entrambe le cultivar hanno un forte calo delle concentrazioni di sale da 0-3 g / L e un lento e costante declino per le concentrazioni di sale da 3-20 g / L (Figura 1A, B). Il tasso di germinazione delle due varietà diminuisce gradualmente all'au...

Discussione

Questo metodo di ricerca comprende quattro passaggi chiave che influenzano l'accuratezza dei risultati sperimentali. In primo luogo, a causa della scarsa dissoluzione dei sali misti causata dall'aumento del contenuto di soluti nelle soluzioni ad alta concentrazione salina e della bassa solubilità di reagenti come il cloruro di calcio, che sono più difficili da solubilizzare in acqua, i reagenti pesati devono essere completamente macinati in una malta. Inoltre, i reagenti devono essere sciolti tramite onde ultr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)