אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.

Abstract

המחקר של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים, דינמיקה וויסות בתאים חיים השתנה באופן עמוק עם הופעתן של טכניקות המאפשרות תיוג של גנים אנדוגניים לייצר חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לדמיין את התנהגות החלבונים בזמן אמת, ומספקות תובנות חשובות לגבי תפקודיהם ואינטראקציות שלהם בסביבה התאית. מחקרים רבים כיום על תיוג גנים משתמשים בתהליך דו-שלבי שבו סמנים נראים לעין, כגון שינויים בצבע העיניים, משמשים לזיהוי אורגניזמים מהונדסים גנטית בשלב הראשון, והסמן הנראה נכרת בשלב השני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חד שלבי לביצוע תיוג גנים אנדוגני מדויק ומהיר ב - Drosophila melanogaster, המאפשר סריקה לקווים מהונדסים ללא סמן העין הנראה, ומציע יתרון משמעותי על פני שיטות קודמות. כדי לסנן אירועי תיוג גנים מוצלחים, אנו משתמשים בטכניקה מבוססת PCR כדי לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים על ידי ניתוח מקטע קטן מהרגל האמצעית שלהם. זבובים שעוברים את קריטריוני הסינון משמשים לאחר מכן לייצור מלאי יציב. כאן, אנו מפרטים את התכנון והבנייה של פלסמידים לעריכת CRISPR ושיטות לסינון ואישור של קווים מהונדסים. יחד, פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי את יעילות תיוג הגנים האנדוגניים בדרוזופילה ומאפשר מחקרים של תהליכים תאיים in vivo.

Introduction

חלבונים פלואורסצנטיים התגלו ככלים רבי עוצמה להדמיית לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ואינטראקציות חלבון-חלבון בתאים בתוך אורגניזמים חיים ^1,2. תיוג גנים אנדוגניים בחלבונים פלואורסצנטיים מאפשר הדמיה חיה ארוכת טווח של תהליכים תאיים ברזולוציה תת-תאית. יתר על כן, לטכניקות תיוג גנים אנדוגניות אלה יש מספר יתרונות בהשוואה לגישות ביטוי יתר וצביעת חיסון. לדוגמה, ביטוי יתר של חלבונים עלול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, אינטראקציות חלבון-חלבון לא ספציפיות וחוסר לוקליזציה³. עד כה, חוקרים הצליחו ליצור ספריות עצומות של גנים אנדוגניים המאוחים לחלבונים פלואורסצנטיים עבור כמה אורגניזמים לדוגמה, כגון שמרים ניצנים, אשר יכולים לעבור רקומבינציה הומולוגית יעילה⁴. במקרה של Drosophila melanogaster, כלים שונים כגון MiMICs⁵, מלכודות משפר מבוסס טרנספוזון⁶, ו fosmids⁷ פותחו כדי לתייג גנים פלואורסצנטית.

פיתוח כלים מבוססי CRISPR-Cas9 איפשר לבצע ביעילות עריכת גנום, כולל תיוג חלבונים אנדוגניים, במגוון רחב של אורגניזם מודל ^8,9. Cas9 הוא אנזים מונחה רנ"א אשר חותך דנ"א דו-גדילי באופן יעיל וספציפי^{ביותר 8}, אשר לאחר מכן ניתן לתקן על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ) המוביל למוטציות נקודתיות או מחיקות. לחלופין, מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מאפשר שילוב של DNA הטרולוגי לתוך הכרומוזום.

שיטות קודמות לתיוג גנים מבוססי קריספר באורגניזם המודל, Drosophila melanogaster, הסתמכו על תהליך דו-שלבי 10,11,12. זה כרוך בשימוש בסמן צבע עיניים מובחן, Dsred, כדי לזהות אירועי HDR מוצלחים. לאחר מכן, סמן Dsred יוסר באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre/loxP. כדי לייעל ולזרז את התהליך, אנו מציגים כאן שיטה פשוטה ויעילה יותר. גישה זו עוקפת את הצורך בגנוטיפ קטלני ומאפשרת סריקה ישירה של זבובים בודדים. באופן ספציפי, אנו משתמשים בגישה מבוססת PCR כדי לחלץ דנ"א מקטע קטן של הרגל האמצעית של הזבוב, מה שמאפשר לנו לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים. יש לציין כי הליך זה אינו פוגע בחיוניות, בתנועה או ביכולות הרבייה של הזבוב שנדגם. רק האנשים המתאימים, המזוהים בשיטה זו, מתפתחים עוד יותר למניות יציבות.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת חלבון פלואורסצנטי מתויג זבובים שבו גנים אנדוגניים מסומנים עם כתבים פלואורסצנטיים. טכניקה זו משתמשת בעריכת גנום CRISPR-Cas9 כדי להתיך כל תג פלואורופור רצוי למסוף N או C של גן אנדוגני. להלן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של פלסמידים gRNA ופלסמיד תורם, אסטרטגיית סינון בצעד אחד לבחירת זבובים חיוביים לקריספר, וצעדים ליצירת קווים יציבים. באופן ספציפי, אנו מתארים אסטרטגיות לתיוג שעון ליבה אנדוגני גן דרוזופילה , נקודה, עם פלואורופור במסוף C. אנו גם מתארים בקצרה את ניסויי הבקרה שיש לבצע כדי לאשר שהחלבון המתויג הוא פונקציונלי וטכניקות הדמיה חיה כדי לדמיין את חלבון המחזור בנוירונים של שעון חי בתוך מוחות דרוזופילה שלמים¹³. הפרוטוקול המתואר כאן חל באופן נרחב גם על מועמדים לסינון מחיקות והחדרות של פיסות DNA ספציפיות על ידי עריכת גנום CRISPR-Cas9.

Protocol

1. תכנון ובנייה של ריאגנטים לעריכת גנים

הערה: כדי לבצע תיוג אנדוגני, חיוני לזהות את האיזופורמים השונים של הגן הרצוי. בהתאם למטרות הספציפיות של הניסוי, ניתן לשלב תג פלואורסצנטי באופן פנימי או במסוף N או C של איזופורמ(י) החלבון שנבחר. לעריכה אופטימלית בתיווך CRISPR, חיוני למקם את שני ה-sgRNA קרוב כראוי לאתר ה-knock-in המיועד. לאחר מכן, כדי לאפשר עריכה באמצעות רקומבינציה הומולוגית, יש להכין וקטור תורם הכולל רצפים הומולוגיים לגן המטרה, יחד עם התג הפלואורסצנטי. להלן מדריך שלב אחר שלב לתהליכים האלה (איור 1).

1. תכנון sgRNA כמתואר להלן.
   1. עיצוב sgRNA עבור Drosophila באמצעות אתרי אינטרנט אלה: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ או http://www.flyrnai.org/crispr2/.
   2. עבור אתר flycrispr, הזן את הרצף ±100 bp המקיף את מיקום הדפיקה הרצוי (מסוף N, מסוף C, או כל מוקד גנומי מעניין). אם אתה משתמש ב- nos-Cas9 attP2 כרקע להזרקה, בחר באפשרות הגנום Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). מערכת Nos-Cas9 מבטיחה ביטוי Cas9 ספציפי לקו הנבט.
   3. כדי לשפר את יעילות ביטוי ה-sgRNA, בחרו באפשרות מטרות CRISPR עם 5' G , מכיוון ש-sgRNA שמתחיל בגואנין ישפר את פעילות העריכה. לאחר מכן, לחץ על הלחצן Find CRISPR Targets . תוצג רשימה של רצפי sgRNA אפשריים.
   4. עבור כל רצף, לחץ על הלחצן Evaluat . פעולה זו בודקת אם יש מטרות פוטנציאליות עבור כל רצף בהתבסס על הגנום שנבחר קודם לכן. מהרשימה המוצגת, בחר 2 sgRNA שיש להם 0 מטרות off. ודא ש-sgRNA אחד נמצא במעלה הזרם והשני נמצא במורד הזרם ביחס למיקום הדפיקה. באופן אידיאלי, המיקומים שלהם צריכים להיות קרובים ככל האפשר לאתר הנוק-אין (<200 bp), אולם אסור שהם יחפפו זה לזה (איור 2).
      הערה: לפעמים קשה למצוא sgRNA מתאים לגן מטרה נתון. ניתן להגדיל את הפער בין sgRNA לבין מיקום הדפיקה ל-± 200 bp. שימוש ב-sgRNA שאינו מופעל עם G עשוי להפחית מעט את שיעור החיוביים.
2. בצע בחירת תג פלואורסצנטי כמתואר להלן.
   1. תגי פלורסנט מציעים מגוון רחב של מאפיינים, שלכל אחד מהם יתרונות וחסרונות ייחודיים ^1,2. בעת קביעת התג הפלואורסצנטי האידיאלי לסימון חלבון מסוים, שים לב לשיקולים המרכזיים המתוארים בשלבים הבאים שנכנסים לפעולה.
   2. בהתחשב בכך שרמות ביטוי החלבון הטבעיות הן בדרך כלל נמוכות בהרבה מאלה שנצפו בניסויי ביטוי יתר ^1,2, התחל עם התגים שהם בהירים וניתנים לצילום ושמתאימים למערך הניסוי. תגים פלואורסצנטיים מסוימים, במיוחד RFPs מסוימים כמו tdTomato ו- DsRed, נוטים ליצור multimers¹⁴ ועלולים להוביל לצבירת חלבונים.
   3. לקבלת רב-תכליתיות משופרת, קשר תגי אפיטופ (לדוגמה, FLAG או V5) לסמן הפלואורסצנטי באמצעות מקשר גמיש, המאפשר ניתוחים ביוכימיים כגון Western Blot או Co-Immunoprecipitation.
3. לעיצוב מקשר, בצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. לקבלת פונקציונליות מיטבית, ודא שגם החלבון האנדוגני המעניין וגם התג הפלואורסצנטי מתקפלים בנפרד לצורותיהם הפונקציונליות. כדי להשיג זאת, השתמש בפפטיד מקשר באורך של 2-20 חומצות אמינו. לדוגמה, מקמו שתי שאריות גליצין בין חומצת האמינו האחרונה של חלבון המחזור לבין חומצת האמינו הראשונה של החלבון הפלואורסצנטי mNeonGreen.
   2. ודא שרצפי פפטידי קישור אלה מורכבים מחומצות אמינו כמו גליצין וסרין, המקנות גמישות למבנה¹⁵. זה מבטיח כי ההתנהגות הטבעית והמיקום של החלבון האנדוגני להישאר ללא שינוי.
4. עיצוב וקטור תורם כמתואר להלן.
   הערה: וקטור התורם מציג את התג הפלואורסצנטי למיקום האנדוגני הרצוי באמצעות תהליך של תיקון מכוון הומולוגיה, אשר מופעל על ידי מחשוף CRISPR. ככזה, מלבד התג הפלואורסצנטי, וקטור התורם חייב להיות בעל רצפים הומולוגיים משני צידי התג.
   1. התחל את תכנון וקטור התורם על ידי ארגון רצף ה- DNA של הפפטיד המקשר והתג הפלואורסצנטי וודא שיש רצפים הומולוגיים משני הקצוות (זרועות הומולוגיה). לקבלת תוצאות מיטביות, ודאו שזרועות ההומולוגיה כוללות לפחות 800 נוקלאוטידים בכל צד של אתר הדפיקה המיועד (איור 2).
      הערה: דיווחים אחרונים מצביעים על כך שזרועות הומולוגיה יכולות להיות קצרות יותר (100-200 bp)¹⁶.
   2. ודא שכל רצפי PAM בתוך פלסמיד התורם משתנים באופן כזה שרצף חומצות האמינו של החלבון המתקבל יישאר ללא שינוי. אם רצף PAM ממוקם ב- UTR, הסר אותו לחלוטין.
   3. המיקום של קודון START ו- STOP תלוי במיקום התג. לתיוג פנימי, ודא שהתג הפלואורסצנטי נמצא במסגרת עם רצף הקידוד של גן היעד. לתיוג N-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון ההתחלה האנדוגני. לתיוג C-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון העצירה הטבעי והקפד לשמור על קודון התחלה אחד בלבד כדי למנוע בעיות תרגום פוטנציאליות.
5. לסנתז sgRNA ופלסמידים תורמים כמתואר להלן.
   1. ליצירת פלסמיד sgRNA, עקוב אחר הנחיות שיבוט U6-gRNA, שניתן למצוא flycrispr.org/protocols/grna/. השתמש בגישת השיבוט החלופית המבוססת על אנזים הגבלה (המכונה אסטרטגיה C במשאב שסופק) כדי להכניס רצף gRNA לפלסמיד pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
   2. שינוי צורה ב-DH5a E. coli (NEB, C2987H) בהתאם לפרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים שסופקו על ידי היצרן. לצורך אימות, בצע ריצוף Sanger על השיבוטים המתקבלים באמצעות פריימרים סטנדרטיים לריצוף T3 או T7.
   3. ליצירת פלסמיד תורם, רכשו DNA דו-גדילי עם רצף התורם הרצוי מספקים מסחריים (למשל, IDT). שלב אותו באתר השיבוט המרובה pBlueScriptII SK(-). רצף את פלסמיד התורם כדי להבטיח שרצפי sgRNA או PAM משתנים כראוי ואין SNPs נוכחים בפלסמיד.
      הערה: חלופה לשילוב באמצעות pBlueScriptII היא PCR את זרועות ההומולוגיה ואת קטעי התג הפלואורסצנטי בנפרד ולאחד אותם לתוך עמוד השדרה באמצעות טכניקות כמו Golden Gate Assembly או Gibson Assembly.
6. השתמש בסכימת ההזרקה והחצייה הבאה.
   1. כדי לרכוש זבובים ערוכים על ידי נבט, הזריקו במשותף פלסמידים של gRNA ואת פלסמיד התורם לרקע המתאים של Cas9 (למשל, nos-Cas9 III, BDSC 78782). אם אתה משתמש בשירותי הזרקה מסחריים, עקוב אחר הוראות הספק לביצוע הכנת פלסמיד.
      הערה: בדרך כלל, ריכוז פלסמיד gRNA צריך לעלות על 0.5 מיקרוגרם/μL, וריכוז פלסמיד התורם צריך להיות מעל 1.0 מיקרוגרם/μL. ציר זמן נפוץ משליחת דגימות פלסמיד לקבלת עוברים מוזרקים הוא כשבועיים. כאן מוצגת אסטרטגיה לסינון אירועי עריכת גנים בכרומוזום X באמצעות זן מאזן FM7/L. עבור גנים בכרומוזום השני או השלישי, השתמש בזני האיזון המתאימים.
   2. לאיסוף זבובים מוזרקים (G0), מרדימים בפחמן דו חמצני ומפרידים בין זבובים זכרים לנקבות בתולות. קבע צלבי זבובים על ידי זיווג כל זכר G0 עם לפחות שתי נקבות בתוליות FM7/L בבקבוקוני מזון CT צרים בודדים. הניחו בקבוקונים מוצלבים באינקובטור מאוורר הנשמר בטמפרטורה של 25°C ו~60% לחות עד שזבובי F1 ייסגרו (FM7/L הוא מאזן כרומוזום X הנפוץ ביותר). באופן דומה, זיווג כל נקבת G0 עם זבובים זכרי FM7/Y.
   3. להרדים ולאסוף לפחות 10 צאצאים נקבות בתולות (F1) הן מצלב זכר G0 והן מצלב נקבה. מצלבי נקבות G0 אספו לפחות 10 זבובי F1 זכרים (איור 3A). ודא שכל זבוב F1 מתויג עם פרטי ההורות שלו ומאוחסן בנפרד. המשך לשלב ההקרנה.
7. השתמש בפרוטוקול PCR הבא על רגל אחת.
   1. יצירת פריימר: עיצוב זוג פריימר המקיף את אתר העריכה של גן המטרה. באופן אידיאלי, טמפרטורות ההתכה של הפריימרים צריכות להיות דומות, סביב 55 מעלות צלזיוס.
   2. הכנת חיץ ליזיס: הכינו 10 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לכל דגימת זבוב. החיץ מורכב מ 10 mM Tris (pH 8.2), 1 mM EDTA (pH 8.0), 25 mM NaCl, ו 400 מיקרוגרם / מ"ל פרוטאינאז K. להכין את חיץ ליזיס כמו תערובת אב, ולאחר מכן להפיץ 10 μL לתוך כל באר של צלחת PCR 96 באר. ודאו שהחיץ נשאר קר לאורך כל תהליך נתיחת הרגל (איור 3B).
   3. התקנת צינורות: הכינו צינורות נימי זכוכית, מלאו קצה אחד במזון סוכרוז-אגר (2% אגר ו-4% סוכרוז), והניחו אותם בצלחת בעלת 96 בארות עמוקות, שתיקרא מלון הזבובים (איור 3C).
   4. דיסקציה של הרגל: הניחו את כרית ההרדמה של פחמן דו חמצני מתחת למיקרוסקופ סטריאו, הרדימו זבוב מועמד אחד וקטעו את אחת הרגליים האמצעיות. הכניסו את הרגל למאגר הליזיס, והבטיחו טבילה מלאה. אין צורך לשרטט את הרגל, אלא להמשיך ישירות לשלב פרוטוקול הליזיס (איור 3B). אחזו בכנף הזבוב בעזרת זוג מלקחיים עדינים ממתכת, העבירו את הזבוב למלון הזבובים ואטמו מיד את הצינור בחוט.
   5. דגימות בקרה: שני זבובי בר עשויים לשמש כבקרות שליליות לאחר אותו הליך דיסקציה של הרגל. פלסמיד תורם מדולל משמש כבקרה חיובית.
   6. טיפול לאחר נתיחה: שכן את מלון הזבובים באינקובטור מאוורר המתוחזק ב 25 ° C ו ~ 60% לחות. בעוד שזבובים יכולים לשרוד לילה, מומלץ להשלים את השלבים הבאים ואת ההזדווגות באותו היום.
   7. פרוטוקול ליזיס: הניחו את הרגליים הכרותות בתמיסת חיץ הליזיס בתרמוסייקלר שנקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולבסוף הוחזק ב -4 מעלות צלזיוס. זה יחלץ מספיק דנ"א מהרגל היחידה של כל זבוב (איור 3B).
   8. תגובת PCR: ארגן את תגובת ה-PCR לפי הוראות היצרן, תוך שימוש ב-1.5 μL של הליזט של רגל הזבוב כמקור ה-DNA.
   9. אלקטרופורזה בג'ל: יש להכפיף את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. לפרש את התוצאות מהג'ל בהתבסס על גודל הרצועה. בדרך כלל, זבובי בקרה שליליים יציגו פס נמוך יותר, ובקרות פלסמיד חיוביות יציגו פס גבוה יותר. ודא שגדלי הרצועה הספציפיים תואמים את עיצוב הפלסמיד המקורי של התורם. נקבות זבובים חיוביים יציגו שתי להקות כיוון שהן הטרוזיגוטיות, וזכרים חיוביים יציגו רצועה אחת (איור 3B).
      הערה: בדרך כלל, הקרנה של 70 זבובים ניתנת להשגה ביום אחד. הקפידו לזהות לפחות 10 זבובי F1 חיוביים על פני 4 עד 5 צלבי G0 שונים, מכיוון שמטוסי F1 מסוימים עשויים להיות סטריליים עקב מוטציות מחוץ למטרה.
8. בצע את ההגדרה הצולבת הבאה לאחר PCR.
   1. בהתבסס על תוצאות הג'ל, בחרו את הזבובים החיוביים ממלון הזבובים והצליבו אותם בנפרד עם זבובי איזון (FM7/L לתיוג גנים של כרומוזום X) כדי לייצר את דור F2. ברגע שדור ה-F2 מגיח, הקימו צלבי אחים כדי ליצור מלאי הומוזיגוטי יציב (איור 3D).
   2. השתמש במניות הומוזיגוטיות לריצוף Sanger של אתר העריכה כדי להבטיח דיוק. הצלבה אחורית של קווי זבובים מאומתים עם זבובי בר כדי להסיר מוטציות רקע. סנן כל דור באמצעות פרוטוקול PCR על רגל אחת.

תוצאות

בניסויים שלנו, מצאנו בדרך כלל שיעור הצלחה של ~20%-30% בבדיקות סקר לגנים מתויגים אנדוגניים שונים על כל הכרומוזומים (X, II, III). יעילותו של תהליך זה יכולה להשתנות בהתאם למספר גורמים, כגון בחירת gRNA, אופי הגן ואיכות ההזרקה. כאן, אנו ממחישים את התוצאות מהאסטרטגיה שלנו לתייג את גן התק...

Discussion

התוצאות מדגימות אסטרטגיה יעילה ופשוטה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה. בפרוטוקול, אנו משתמשים בשני gRNA כדי לגרום לשבירת DNA דו-גדילי ורקומבינציה הומולוגית בצורה יעילה יותר. ה-gRNA והפלסמיד התורם מוזרקים לעוברים של זבובי פירות, המבטאים את האנזים Cas9 בקו הנבט שלהם. עוברי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA pH8.0	Invitrogen	AM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987H
96-well deep well plate	BRAND	701354
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
BbsI-HF	NEB	R3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
EcoRI-HF	NEB	R3101S
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A142-212
Prolong Glass Antifade Mounting Medium	Invitrogen	P36982
Proteinase K	QIAGEN	19131
Schneider's Drosophila Medium	Gibco	21720001
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
XbaI	NEB	R0145S