Un protocolo simple para mapear los rasgos de arquitectura del sistema radicular de la planta

Resumen

Utilizamos herramientas de laboratorio simples para examinar la arquitectura del sistema radicular (RSA) de Arabidopsis y Medicago. Las plántulas se cultivan hidropónicamente sobre malla y se extienden usando un pincel artístico para revelar el RSA. Las imágenes se toman mediante escaneo o una cámara de alta resolución, luego se analizan con ImageJ para mapear rasgos.

Resumen

El conocimiento integral del desarrollo de la arquitectura del sistema radicular de las plantas (RSA) es fundamental para mejorar la eficiencia del uso de nutrientes y aumentar la tolerancia de los cultivadores de cultivos a los desafíos ambientales. Se presenta un protocolo experimental para configurar el sistema hidropónico, el crecimiento de las plántulas, la propagación de RSA y la obtención de imágenes. El enfoque utilizó un sistema hidropónico basado en caja magenta que contenía malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato. Los ajustes experimentales se ejemplifican evaluando el RSA de las plántulas bajo un suministro variable de nutrientes (fosfato [Pi]). El sistema se estableció para examinar el RSA de Arabidopsis, pero es fácilmente adaptable para estudiar otras plantas como Medicago sativa (Alfalfa). Las plántulas de Arabidopsis thaliana (Col-0) se utilizan en esta investigación como ejemplo para comprender la planta RSA. Las semillas se esterilizan en la superficie mediante el tratamiento de etanol y lejía comercial diluida, y se mantienen a 4 °C para su estratificación. Las semillas se germinan y se cultivan en un medio líquido semi-MS sobre una malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato. Las plántulas se cultivan en condiciones de crecimiento estándar durante el número deseado de días, se recogen suavemente de la malla y se sumergen en placas de agar que contienen agua. Cada sistema de raíces de las plántulas se extiende suavemente sobre la placa llena de agua con la ayuda de un pincel de arte redondo. Estas placas de Petri se fotografían o escanean a alta resolución para documentar los rasgos RSA. Los rasgos de la raíz, como la raíz primaria, las raíces laterales y la zona de ramificación, se miden utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente. Este estudio proporciona técnicas para medir las características de las raíces de las plantas en entornos ambientales controlados. Discutimos cómo (1) cultivar las plántulas y recolectar y esparcir muestras de raíces, (2) obtener imágenes de muestras RSA extendidas, (3) capturar las imágenes y (4) usar software de análisis de imágenes para cuantificar los atributos de la raíz. La ventaja del método actual es la medición versátil, fácil y eficiente de los rasgos RSA.

Introducción

La arquitectura del sistema radicular (RSA), que es subterránea, es un órgano vital para el crecimiento y la productividad de las plantas ^1,2,3. Después de la etapa embrionaria, las plantas experimentan sus cambios morfológicos más significativos. La forma en que crecen las raíces en el suelo afecta en gran medida el crecimiento de las partes de la planta sobre el suelo. El crecimiento de la raíz es el primer paso en la germinación. Es un rasgo informativo ya que responde de manera única a diferentes nutrientes disponibles 1,2,3,4. El RSA exhibe un alto grado de plasticidad del desarrollo, lo que significa que el ambiente siempre se utiliza para tomar decisiones sobre el desarrollo ^2,5. Los cambios en el medio ambiente han dificultado la producción de cultivos en el escenario actual. De forma continua, el RSA incorpora señales ambientales en las opciones de desarrollo⁵. Como resultado, una comprensión profunda de los principios detrás del desarrollo de las raíces es esencial para aprender cómo las plantas responden a los ambientes cambiantes ^2,5.

El RSA detecta concentraciones variables de nutrientes y produce alteraciones fenotípicas 4,6,7,8,9,10,11,12. Los estudios sugieren que la morfología de la raíz/RSA es altamente plástica en comparación con la morfología del brote ^1,3. El mapeo de rasgos RSA es altamente efectivo para registrar el efecto de cambiar el ambiente del suelo circundante 1,11,12.

En general, las discrepancias en el efecto de diversas deficiencias de nutrientes en el fenotipo de la raíz han sido reportadas en muchos estudios anteriores 3,11,13,14,15. Por ejemplo, hay varios informes contrastantes sobre los cambios inducidos por la inanición de fosfato (Pi) en el número, la longitud y la densidad de las raíces laterales (LR). Se ha reportado un aumento en la densidad de LR bajo la condición deficiente Pi ^6,8. En contraste, una disminución en la densidad de LR en condiciones deficientes de Pi también ha sido reportada por otros autores 3,13,16. Una de las causas prominentes de estas inconsistencias es el uso del medio gelificante propenso a la contaminación elemental, que el agar a menudo contiene¹⁰. Los investigadores suelen cultivar sus plantas experimentales en un sistema de placas a base de agar y registran los rasgos de la raíz. Numerosos rasgos de RSA están frecuentemente ocultos o arraigados dentro del material de agar y no pueden ser documentados. Los experimentos relacionados con la inducción de deficiencia de nutrientes, en los que los usuarios a menudo excluyen un componente totalmente del medio, no pueden realizarse en un medio gelificante propenso a la contaminación elemental^11,14,15. Numerosos nutrientes están frecuentemente presentes en cantidades significativas en los medios de agar, incluyendo P, Zn, Fe, y muchos más^11,14,15. Además, el crecimiento de RSA es más lento en medios basados en agar que en medios líquidos no basados en agar. Como resultado, es necesario establecer un enfoque alternativo no basado en agar para cuantificar y registrar cualitativamente el fenotipo de RSA. En consecuencia, se ha desarrollado el método actual, en el que las plántulas se crían en un sistema hidropónico basado en caja magenta sobre una malla de polipropileno soportada por cuñas de policarbonato 1,10,11.

Este estudio presenta una versión improvisada detallada del método anterior descrito por Jain et ^al.10. Esta estrategia se ha ajustado para las demandas actuales en la biología de las raíces de las plantas y también se puede utilizar para plantas como la alfalfa, que no sean plantas modelo. El protocolo es la forma principal de medir los cambios en RSA, y solo requiere un equipo simple. El presente protocolo ilustra cómo fenotipar varias características radiculares, como las raíces primarias y laterales en medio normal y modificado (Pi deficiente). Se proporcionan instrucciones paso a paso y otros consejos útiles extraídos de las experiencias del autor para ayudar a los investigadores a seguir las metodologías ofrecidas en este método. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un método simple y eficaz para revelar todo el sistema radicular de las plantas, incluidas las LR de orden superior. Este método consiste en extender manualmente el sistema radicular con un pincel de arte de acuarela redonda, lo que permite un control preciso sobre la exposición de las raíces 1,10,11,12. No requiere equipos costosos ni software complicado. Este método ha mejorado la absorción de nutrientes y la tasa de crecimiento; Las plantas tienen una solución rica en nutrientes fácilmente absorbida por sus raíces. El presente método es adecuado para investigadores que desean mapear los rasgos del sistema radicular de una planta en detalle, particularmente durante el desarrollo temprano (10-15 días después de la germinación). Es adecuado para sistemas radiculares pequeños, plantas modelo como Arabidopsis y tabaco, y plantas no convencionales como Alfalfa hasta que su sistema radicular encaje en las cajas magenta.

Los pasos para el análisis fenotípico del desarrollo de RSA en Arabidopsis se describen en este protocolo de la siguiente manera: (1) el método de esterilización de la superficie de la semilla para plantas (Arabidopsis), (2) los pasos para configurar el sistema hidropónico, seguido de la siembra de semillas en un medio, (3) procedimiento para extraer las siembras completas y esparcirlas en la placa de Petri para el análisis de RSA, (4) cómo grabar las imágenes para RSA, y (5) calcular parámetros RSA importantes utilizando el software ImageJ.

Protocolo

Todo el protocolo se resume esquemáticamente en la Figura 1, mostrando todos los pasos esenciales involucrados en la revelación de la arquitectura del sistema raíz (RSA) de las plántulas. Los pasos del protocolo se detallan a continuación:

1. Esterilización de la superficie de la semilla de Arabidopsis

1. Transfiera una pequeña cucharada (aproximadamente 100 semillas = aproximadamente 2,5 mg) de semillas a un tubo de microfuga y remoje durante 30 minutos en agua destilada a temperatura ambiente (RT). Todo este procedimiento se lleva a cabo en condiciones asépticas.
2. Centrifugar brevemente el tubo de microfuga que contiene semillas a 500 x g durante 5 s, utilizando cualquier centrífuga de mesa en RT para dejar que las semillas se asienten.
3. Decantar el agua, agregar 700 μL de etanol al 70% (v / v), vórtice durante unos segundos y girar. Repita el vórtice y el giro si es necesario, pero asegúrese de que el tiempo de tratamiento de etanol al 70% permanezca en 3 min.
4. Después de 3 minutos, enjuague inmediatamente una vez con agua estéril. Mantenga el paso de lavado de etanol lo más oportuno posible, ya que la exposición prolongada al etanol disminuye la germinación.
5. Tratar las semillas con lejía comercial diluida (4% v/v) con una gota de Tween-20 durante 7 min. Mezclar las semillas con una solución de lejía invirtiendo los tubos rápidamente 8-12 veces, seguido de una breve centrífuga (500 x g durante 5 s en RT). La espuma se ve aparecer en el tubo.
6. Decantar el sobrenadante con una pipeta de 1 ml y enjuagar las semillas con al menos cinco lavados con agua estéril, siguiendo el mismo procedimiento de vórtice.
7. Dejar las semillas esterilizadas en la superficie en agua e incubar durante 2-3 días a 4 °C para la estratificación¹⁰.

2. Establecimiento de un sistema hidropónico para la germinación de semillas

1. Llene a la mitad una caja magenta estándar con agua destilada y esterilize en autoclave. Autoclave la lámina de policarbonato (color claro y textura lisa) y corte rectángulos de 4 cm x 8 cm, con un punto medio entallado más de la mitad del rectángulo para que dos rectángulos puedan encajarse para formar una forma de X¹⁰. Utilice esta configuración para sostener la malla de polipropileno (cuadrados de 6 cm x 6 cm de tamaño de poro de 250 μm, o dependiendo del requisito) cortada de hojas de 12x 24 pulgadas¹⁰.
   NOTA: El polipropileno es altamente resistente a ácidos, álcalis y otros productos químicos; por lo tanto, se ha optado. El autoclave tiende a distorsionar la malla de polipropileno; Por lo tanto, se recomienda llevarlo por separado envuelto en papel de aluminio. Se recomiendan condiciones típicas de autoclave de 16 min, 121 °C, 15 psi o 775 mm Hg.
2. Agregue medios basales semi-MS estériles con vitaminas + 1.5% (p/v) de sacarosa, como lo describe Shukla et ^al.1, a cada caja para llegar al borde inferior de la malla de polipropileno en un flujo laminar. Todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones asépticas.
3. Siembre las semillas esterilizadas en la superficie en la malla (tamaño de poro de 250 μm) hidropónicamente y déjelas crecer durante 3 días.
4. Después de 3 días, transfiera las plántulas a una malla (tamaño de poro de 500 μm) y déjelas crecer durante 2 días.
5. Después de 2 días (total de 5 días), transfiera las plántulas al medio de control (es decir, medios nutritivos modificados para la EM 1 que contengan 2.0 mM NH 4 NO 3, 1.9 mM KNO₃, 0.15 mM MgSO 4·7H ₂O,^0.1 mM MnSO₄· H 2 O, 3.0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0.1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0.3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5.0 μM KI, 0.1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0.1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1.25 mM KH ₂PO ₄, 100 μM H 3 BO₃, 1 μM Na 2 MoO₄·2H₂O, sacarosa al1,5%, MES 1,25 mM, pH 5,7 ajustado con 0,1 M MES [pH 6,1]) y al tratamiento con medios experimentales (por ejemplo, P- [0 mM]); KH2 PO 4 se reemplaza con 0.62 mM K₂SO₄ de la composición del medio de control como se mencionó anteriormente¹. Para tratamientos de exceso de Pi, la concentración de KH 2 PO₄ se incrementa en el medio MS modificado [_2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]¹) y deja que las semillas crezcan durante 7 días.
   NOTA: Un tamaño de poro de malla más grande (500 μm) facilita la recolección suave de plántulas enteras sin ningún daño o necesidad de cortar en el hipocótilo. Las plántulas crecen en condiciones de crecimiento estándar (es decir, fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro, 150 μmol·^m-2·^s-1 intensidad de luz, 60%-70% de humedad) a 23 °C.

3. Examen de RSA

1. Preparar placas de agar (1,1%) para extender la raíz (tamaño de la placa de Petri: 150 mm x 15 mm).
2. Agregue 10-20 ml de agua del grifo filtrada en autoclave a la placa de Petri, como se mencionó anteriormente. Saque suavemente las plántulas de la malla (500 μm) y sumérjalas en agua en las placas.
3. Extienda suavemente la raíz de cada plántula en la placa llena de agua con la ayuda de un pincel de arte de acuarela redonda (tamaños: no. 14, 16, 18 y 20).
   NOTA: Mientras se lleva a cabo la propagación del sistema radicular, primero obtenga la raíz primaria y extiéndala en línea recta, ya que sirve como eje. Luego, extienda los LR simétricamente a cada lado de la raíz primaria, siempre que sea posible. Después de eso, difunda el LR de segundo orden vinculado al LR de primer orden. Este proceso de difusión es una especie de arte; hazlo suavemente, lentamente, como un artista dibujando una imagen de la RSA.
4. Incline la placa ligeramente para eliminar el agua.
   NOTA: En este punto, el procedimiento se puede pausar colocando estas placas extendidas a 4 °C. Más tarde, cuando se requiera procesamiento de imágenes, saque las placas y colóquelas en RT por un tiempo. Limpie el agua condensada y luego la imagen se puede procesar convenientemente.

4. Grabación de imágenes para RSA

1. Escanee o fotografíe estas placas de Petri apropiadamente.
   NOTA: Para obtener fotografías de alta calidad, se recomienda la resolución de 600 ppp para escanear, y se recomienda al menos una cámara de 12 megapíxeles para la fotografía.
2. Mida los rasgos de la arquitectura del sistema raíz utilizando el software ImageJ disponible gratuitamente (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Para seguir rápidamente los pasos para medir la longitud de la raíz utilizando el software ImageJ, consulte el ejemplo "medición de la longitud del contorno del ADN"¹⁷.
   NOTA: Estos pasos se siguen para medir las longitudes de raíz en las imágenes capturadas con un escáner o cámara de alta resolución.
   1. Utilice una distancia de longitud determinada para establecer la escala. La distancia conocida de la barra de escala en la Figura 3 es de 2 cm. Seleccione la herramienta Línea recta en la barra de herramientas ImageJ (quinta herramienta desde la izquierda). Utilice la herramienta Línea recta para crear una selección de línea que delinee la barra de escala. Para terminar de esbozar, haga clic con el botón secundario, haga doble clic o haga clic en el cuadro al principio.
   2. Mida la longitud de la barra de escala conocida en píxeles mediante la barra de herramientas Analizar > medir . Anota la longitud del píxel.
   3. Para abrir el cuadro de diálogo Definir escala, haga clic en la ficha Definir escala de la ficha Analizar. En el campo Distancia en píxeles, introduzca la longitud de píxeles (como se indicó anteriormente). A continuación, en el campo Distancia conocida, introduzca el valor, como se muestra en la barra de escala (aquí, es de 20 mm). Establezca la unidad de longitud como mm. La relación píxel-aspecto es 1.0. Ahora, la escala se especifica por el número x de píxeles por milímetro. Para bloquear la escala de esta imagen en particular, haga clic en Aceptar.
   4. Cree una selección de línea que describa la longitud de la raíz con la herramienta Línea segmentada . Para terminar de esbozar, haga clic con el botón secundario, haga doble clic o haga clic en el cuadro al principio. Haga clic y arrastre los pequeños "controles" en blanco y negro a lo largo del contorno para ajustar la selección de línea según sea necesario.
   5. Utilice el comando Medir de la ficha Analizar de ImageJ para cuantificar la longitud de la raíz. Para transferir los datos medidos a una hoja de cálculo, haga clic con el botón derecho en la ventana Resultados , seleccione Copiar todo en el menú emergente, cambie a la hoja de cálculo y, a continuación, pegue los datos.
      NOTA: Como se describió anteriormente, defina la escala utilizando la distancia conocida de la barra de escala en la opción ImageJ set scale. Esto da el número de píxeles por unidad de longitud. Se requiere ajustar la escala cada vez, cada vez que se analiza una nueva imagen.
3. Medición y cálculo de rasgos RSA
   1. Mida la longitud de la raíz primaria entre la unión del hipocótilo hasta el extremo de la punta de la raíz.
   2. Mida la longitud LR de primer y segundo orden.
   3. Mida la zona de ramificación (BZ) de la raíz primaria. La zona de ramificación de la raíz primaria (BZ^PR) abarca desde el primer punto emergente LR hasta el último punto emergente LR.
   4. Registre el número de LR, que es el número de LR originados dentro de los límites del^{BZ PR.}
   5. Medir la longitud media de los LR de primer orden y de orden superior. Obtener la longitud media de los LR de primer orden (1° LR) (centímetros por raíz) dividiendo la longitud total del 1° LR por el número total de 1° LR.
   6. Mida la longitud media de la LR de segundo orden. Calcule la longitud media de la LR de segundo orden (2° LR) dividiendo la longitud total de la LR de 2° por el número total de LR de 2°.
   7. Mida la densidad de 1° LR. Calcule la densidad de 1° LR (número de 1° LR por unidad de longitud de BZ PR⁾ dividiendo el número de 1° LR por la longitud del^{BZ PR.}
   8. Mida la densidad de 2° LR. Calcular la densidad de 2° LR dividiendo el número de 2° LR por la longitud de la BZ de 1° LR (número de 2° LR por unidad de longitud de la BZ de 1° raíces laterales).
   9. Mida la longitud total de la raíz (TRL). Este es el agregado de las longitudes de la raíz primaria, 1° LR y 2° LR (y más si está presente).

5. Medición del cabello de la raíz

NOTA: Aunque el sistema hidropónico no es bueno para promover el crecimiento y desarrollo del vello de la raíz, a pesar de ser tan robusto como lo es en medios de crecimiento sólidos, sigue siendo importante estudiarlo en el contexto actual. Siga los pasos a continuación para analizar el desarrollo del pelo de la raíz en una sección de 5 mm desde la punta de la raíz primaria de las plántulas.

1. Corte una sección de 2 cm de la raíz primaria desde la punta de la raíz.
2. Monte la sección de la raíz en un portaobjetos utilizando glicerol al 10% como medio de montaje.
3. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio estéreo.
4. Utilice el portador axial para visualizar y capturar imágenes de los pelos de la raíz.
5. Analice las imágenes para estudiar la estructura y las características de los pelos de la raíz utilizando el software ImageJ como se describió anteriormente.

Resultados

Los diferentes rasgos morfométricos de la arquitectura del sistema radicular (RSA) se miden utilizando herramientas de laboratorio simples, y los pasos se representan esquemáticamente en la Figura 1. Los detalles de la configuración hidropónica demuestran el potencial del protocolo en la medición del RSA (Figura 1 y Figura 2).

Dadas las diferencias observadas en los agentes gelificantes, se utilizó ...

Discusión

Este trabajo demostró el mapeo de RSA utilizando equipos de laboratorio simples. Usando este método, las alteraciones fenotípicas se registran a nivel refinado. El beneficio de esta estrategia es que la porción del brote nunca entra en contacto con los medios, por lo que el fenotipo de las plántulas es original. Este método implica la configuración de un sistema hidropónico para cultivar plántulas como se describe en el protocolo. Luego, cada plántula se saca intacta y se coloca en una placa de Petri llena de a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)