تحليل مبيدات الآفات الكلورية العضوية في عينة التربة بواسطة نهج QuEChERS المعدل باستخدام فورمات الأمونيوم

Summary

يصف البروتوكول الحالي استخدام فورمات الأمونيوم لتقسيم الطور في QuEChERS ، جنبا إلى جنب مع كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة ، لتحديد بقايا مبيدات الآفات الكلورية العضوية بنجاح في عينة التربة.

Abstract

حاليا ، تمثل طريقة QuEChERS بروتوكول تحضير العينات الأكثر استخداما في جميع أنحاء العالم لتحليل بقايا مبيدات الآفات في مجموعة واسعة من المصفوفات في كل من المختبرات الرسمية وغير الرسمية. أثبتت طريقة QuEChERS باستخدام فورمات الأمونيوم سابقا أنها مفيدة مقارنة بالنسخة الأصلية والإصدارين الرسميين. من ناحية ، فإن الإضافة البسيطة ل 0.5 غرام من فورمات الأمونيوم لكل غرام من العينة كافية للحث على فصل الطور وتحقيق أداء تحليلي جيد. من ناحية أخرى ، يقلل فورمات الأمونيوم من الحاجة إلى الصيانة في التحليلات الروتينية. هنا ، تم تطبيق طريقة QuEChERS المعدلة باستخدام فورمات الأمونيوم للتحليل المتزامن لبقايا مبيدات الآفات الكلورية العضوية (OCP) في التربة الزراعية. وعلى وجه التحديد، تم ترطيب 10 g من العينة ب 10 mL من الماء، ثم استخلاصها ب 10 mL من الأسيتونيتريل. بعد ذلك ، تم فصل الطور باستخدام 5 غرام من فورمات الأمونيوم. بعد الطرد المركزي ، تعرض الطافي لخطوة تنظيف استخراج المرحلة الصلبة المشتتة مع كبريتات المغنيسيوم اللامائية ، والأمين الأولي الثانوي ، وأوكتاديسيلسيلان. تم استخدام كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي كتقنية تحليلية. تم إثبات طريقة QuEChERS باستخدام فورمات الأمونيوم كبديل ناجح لاستخراج بقايا OCP من عينة التربة.

Introduction

أدت الحاجة إلى زيادة إنتاج الغذاء إلى الاستخدام المكثف والواسع النطاق لمبيدات الآفات في جميع أنحاء العالم على مدى العقود القليلة الماضية. يتم تطبيق المبيدات الحشرية على المحاصيل لحمايتها من الآفات وزيادة غلة المحاصيل ، ولكن عادة ما ينتهي الأمر بقاياها في بيئة التربة ، وخاصة في المناطق الزراعية¹. علاوة على ذلك ، فإن بعض المبيدات ، مثل مبيدات الآفات الكلورية العضوية (OCPs) ، لها بنية مستقرة للغاية ، لذلك لا تتحلل بقاياها بسهولة وتستمر في التربة لفترة طويلة². بشكل عام ، تتمتع التربة بقدرة عالية على تجميع بقايا المبيدات ، خاصة عندما تحتوي على نسبة عالية من المواد العضوية³. ونتيجة لذلك ، تعد التربة واحدة من الأجزاء البيئية الأكثر تلوثا ببقايا المبيدات. على سبيل المثال ، وجدت إحدى الدراسات الكاملة حتى الآن أن 83٪ من 317 تربة زراعية من جميع أنحاء الاتحاد الأوروبي ملوثة بواحد أو أكثر من بقايا المبيدات⁴.

قد يؤثر تلوث التربة بمخلفات مبيدات الآفات على الأنواع غير المستهدفة ووظيفة التربة وصحة المستهلك من خلال السلسلة الغذائية بسبب السمية العالية للمخلفات ^5,6. وبالتالي ، فإن تقييم بقايا مبيدات الآفات في التربة ضروري لتقييم آثارها السلبية المحتملة على البيئة وصحة الإنسان ، لا سيما في البلدان النامية بسبب عدم وجود لوائح صارمة بشأن استخدام مبيدات الآفات⁷. وهذا يجعل تحليل المخلفات المتعددة لمبيدات الآفات ذا أهمية متزايدة. ومع ذلك ، فإن التحليل السريع والدقيق لبقايا مبيدات الآفات في التربة يمثل تحديا صعبا بسبب العدد الكبير من المواد المتداخلة ، فضلا عن مستوى التركيز المنخفض والخصائص الفيزيائية والكيميائية المتنوعة لهذه التحليلات⁴.

من بين جميع طرق تحليل بقايا المبيدات ، أصبحت طريقة QuEChERS الخيار^الأسرع والأسهل والأرخص والأكثر فعالية وقوة وأمانا 8. تتضمن طريقة QuEChERS خطوتين. في الخطوة الأولى ، يتم إجراء استخراج مجهري يعتمد على التقسيم عن طريق التمليح بين طبقة مائية وطبقة أسيتونيتريل. في الخطوة الثانية ، يتم إجراء عملية تنظيف باستخدام استخراج المرحلة الصلبة المشتتة (dSPE) ؛ تستخدم هذه التقنية كميات صغيرة من عدة مجموعات من المواد الماصة المسامية لإزالة المكونات المتداخلة مع المصفوفة وتتغلب على عيوب SPE⁹ التقليدية. ومن ثم ، فإن QuEChERS هو نهج صديق للبيئة مع القليل من المذيبات / المواد الكيميائية التي تضيع والتي توفر نتائج دقيقة للغاية وتقلل من المصادر المحتملة للأخطاء العشوائية والمنهجية. في الواقع ، تم تطبيقه بنجاح للتحليل الروتيني عالي الإنتاجية لمئات المبيدات الحشرية ، مع قابلية تطبيق قوية في جميع أنواع العينات البيئية والغذائية الزراعية والبيولوجية تقريبا ^8,10. يهدف هذا العمل إلى تطبيق والتحقق من صحة تعديل جديد لطريقة QuEChERS التي تم تطويرها مسبقا واقترنت ب GC-MS لتحليل OCPs في التربة الزراعية.

Protocol

1. إعداد حلول المخزون

ملاحظة: يوصى بارتداء قفازات النتريل ومعطف المختبر ونظارات السلامة خلال البروتوكول بأكمله.

1. تحضير محلول مخزون في الأسيتون عند 400 ملغم / لتر من مزيج تجاري من OCPs (انظر جدول المواد) عند 2000 ملغم / لتر في الهكسان: التولوين (1: 1) في دورق حجمي 25 مل. ويبين الجدول 1 كل من OCPs المختارة.
2. تحضير محاليل المخزون اللاحقة في الأسيتون بتركيزات 50 ملغم / لتر ، 1 ملغم / لتر ، و 0.08 ملغم / لتر في قوارير حجمية سعة 10 مل ، وتخزينها في قوارير زجاجية كهرمانية عند -18 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن استخدام نفس الحلول طوال العمل ، ولكن من المهم تخزينها في ظل هذه الظروف بعد كل استخدام مباشرة.
3. تحضير محاليل المخزون في الأسيتون بتركيزات 20 ملغم / لتر و 0.4 ملغم / لتر من معيار تجاري 4،4'-DDE-d8 عند 100 ملغم / لتر في الأسيتون في قوارير حجمية 10 مل ، وتخزينها في قوارير زجاجية كهرمانية عند -18 درجة مئوية. استخدم 4،4'-DDE-d8 كمعيار داخلي (IS).

2. جمع العينات

1. اجمع حوالي 0.5 كجم من الطبقة العلوية 10 سم من التربة الزراعية في وعاء زجاجي. تم جمع كائن التربة لهذه الدراسة في منطقة زراعية تقليدية لمحاصيل البطاطس.
   ملاحظة: تم أخذ عينات سطحية باستخدام ملعقة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤثر عمق التربة على خصائصها الفيزيائية والكيميائية. لذلك ، إذا كان محتوى الكربون العضوي يختلف باختلاف العمق ، فمن الضروري أخذ عينات على أعماق مختلفة.
2. خذ عينة التربة إلى المختبر ، ونخلها بمنخل قطره 1 مم ، وقم بتخزينها حتى تحليلها عند 4 درجات مئوية في وعاء زجاجي كهرماني.
   ملاحظة: يمكن استخدام نفس عينة التربة طوال العمل ، ولكن من المهم تخزينها في ظل هذه الظروف بعد كل استخدام مباشرة.

3. تحضير العينة عبر طريقة QuEChERS المعدلة باستخدام فورمات الأمونيوم

ملاحظة: يوضح الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا لطريقة QuEChERS المعدلة.

1. قم بوزن 10 جم من عينة التربة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول IS بمعدل 20 مجم / لتر لإنتاج 100 ميكروغرام / كجم. ولأغراض الاستعادة، تضاف أيضا محاليل مبيدات الآفات المعدة في الخطوة 1-2 لإنتاج 10 ميكروغرام/كغ، و50 ميكروغرام/كغ، و200 ميكروغرام/كغ (ن = 3 لكل منها).
2. هز الأنبوب باستخدام دوامة لمدة 30 ثانية لدمج السنبلة في العينة بشكل أفضل.
3. أضف 10 مل من الماء. هز الأنبوب باستخدام شاكر آلي على حرارة 10 × جم لمدة 5 دقائق.
4. أضف 10 مل من الأسيتونيتريل. هز الأنبوب مرة أخرى عند 10 × جم لمدة 5 دقائق.
5. أضف 5 جم من فورمات الأمونيوم (انظر جدول المواد) ، وهز الأنبوب بقوة لمدة دقيقة واحدة باليد ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1800 × جم لمدة 5 دقائق.
6. انقل 1 مل من مستخلص الأسيتونيتريل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على 150 مجم من MgSO₄ اللامائي ، و 50 مجم من الأمين الأولي الثانوي (PSA) ، و 50 مجم أوكتاديسيلسيلان (C₁₈) (انظر جدول المواد) لأغراض التنظيف عن طريق استخراج الطور الصلب المشتت (d-SPE) ⁸ ، دوامة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 5 دقائق.
7. انقل 200 ميكرولتر من المستخلص إلى قارورة أخذ عينات أوتوماتيكية تحمل علامة مناسبة مع ملحق منصهر 300 ميكرولتر ، وقم بإجراء تحليل فعال باستخدام نظام GC-MS (الخطوة 4).
   ملاحظة: يتم إجراء المعايرة المطابقة للمصفوفة باتباع نفس الخطوات السابقة باستخدام مستخلصات فارغة، ولكن يتم تنظيف 5 مل من المادة الطافية في أنابيب سعة 15 مل في خطوة d-SPE (الخطوة 3.6) ولا تتم إضافة محاليل السنبلة ومثبت الصور حتى الخطوة 3.7. أضف حلول المعايرة القياسية في قوارير أخذ العينات الأوتوماتيكية لإنتاج 5 ميكروغرام / كجم ، و 10 ميكروغرام / كجم ، و 50 ميكروغرام / كجم ، و 100 ميكروغرام / كجم ، و 200 ميكروغرام / كجم ، و 400 ميكروغرام / كجم ، وتتبخر حتى تجف ، وتضاف 200 ميكرولتر من مستخلصات المصفوفة.

4. التحليل الآلي بواسطة GC-MS

1. إجراء تحليلات GC-MS باستخدام نظام GC-MS مع مطياف كتلة رباعي الأقطاب واحد وواجهة تأين إلكترونية (−70 eV) (انظر جدول المواد).
2. اضبط خط نقل MS على 280 درجة مئوية ومصدر الأيونات على 230 درجة مئوية.
3. استخدم عمودا بنسبة 5٪ -phenyl-methylpolysiloxane 30 م × 250 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر (انظر جدول المواد) ونقاوة فائقة هو كغاز ناقل بمعدل تدفق ثابت 1.2 مل / دقيقة.
4. حافظ على فرن GC عند 60 درجة مئوية في البداية لمدة 2 دقيقة ، ثم ارفع درجة الحرارة إلى 160 درجة مئوية عند 25 درجة مئوية / دقيقة ، واستمر لمدة 1 دقيقة. ثم ، قم بزيادة درجة الحرارة إلى 175 درجة مئوية عند 15 درجة مئوية / دقيقة ، واستمر لمدة 3 دقائق. ثم قم بزيادتها إلى 220 درجة مئوية عند 40 درجة مئوية / دقيقة ، واستمر لمدة 3 دقائق. مرة أخرى ، قم بزيادة إلى 250 درجة مئوية عند 30 درجة مئوية / دقيقة ، واستمر لمدة 2 دقيقة. أخيرا ، ارفع درجة الحرارة إلى 310 درجة مئوية عند 30 درجة مئوية / دقيقة ، واستمر لمدة 2 دقيقة. إجمالي وقت التحليل هو 22.125 دقيقة.
5. قم بإجراء ضبط تلقائي كامل وفحص الهواء والماء لمرض التصلب العصبي المتعدد قبل كل تسلسل.
   1. افتح برنامج الاستحواذ MassHunter الذي يتحكم في جميع معلمات نظام GC-MS.
      ملاحظة: يتضمن نظام الأدوات برنامج اقتناء MassHunter افتراضيا.
   2. افتح خيار "عرض" على شريط الأدوات ، وانقر فوق التحكم في الفراغ ، وانقر فوق ضبط ، وانقر فوق ضبط تلقائي. سينتهي الضبط التلقائي بعد بضع دقائق.
   3. افتح خيار "عرض" ، وانقر على التحكم في الأداة.
   4. انقر فوق نعم ، واحفظ ملف النغمة الجديد للضبط التلقائي.
   5. افتح خيار "عرض" على شريط الأدوات ، وانقر فوق التحكم في الفراغ ، وانقر فوق ضبط مرة أخرى ، وانقر فوق فحص الهواء والماء. سينتهي فحص الهواء والماء بعد بضع ثوان.
   6. افتح خيار "عرض" ، وانقر على التحكم في الأداة.
   7. انقر فوق نعم ، واحفظ ملف النغمة الجديد لفحص الهواء والماء.
6. قم بإجراء الحقن باستخدام أخذ العينات الأوتوماتيكي (انظر جدول المواد) عند 280 درجة مئوية في الوضع غير المقسم ، مع الحفاظ على حجم الحقن 1.5 ميكرولتر. بعد 0.75 دقيقة من الحقن ، افتح الانقسام بمعدل تدفق 40 مل / دقيقة.
   ملاحظة: بين الحقن ، يجب غسل حقنة 10 ميكرولتر ثلاث مرات مع أسيتات الإيثيل وثلاث مرات مع سيكلو هكسان. جميع الحقن في نسختين.
7. تحليل التحليلات في وضع مراقبة الأيونات المحددة (SIM). هذا هو الوضع القياسي المستخدم في أنظمة MS مع رباعي قطب واحد.
   ملاحظة: يبين الجدول 1 أوقات الاستبقاء (دقيقة) ومعلمات القياس الكمي استنادا إلى استخدام كمية واحدة وأيوني تعريف ل OCPs و IS. يعتمد التحليل الكمي على نسبة منطقة الذروة لأيون الكمية إلى أيون IS.

5. الحصول على البيانات

1. افتح برنامج الاستحواذ MassHunter الذي يتحكم في جميع معلمات نظام GC-MS.
2. افتح خيار "التسلسل" على شريط الأدوات ، وقم بتحرير التسلسل ، بما في ذلك اسم العينة ورقم القارورة وعدد الحقن وطريقة الأدوات واسم الملف المراد إنشاؤه. أضف العديد من الصفوف حسب الضرورة.
3. انقر فوق "موافق" ، واحفظ التسلسل الجديد.
4. افتح خيار "التسلسل" على شريط الأدوات مرة أخرى ، وانقر فوق تشغيل التسلسل في القائمة المنسدلة. سيتم فتح نافذة جديدة لتأكيد طريقة الحقن والمجلد الذي سيتم حفظ العينات فيه. انقر فوق تشغيل التسلسل مرة أخرى ، وسيبدأ الحقن.

النتائج

تم إجراء التحقق الكامل من الطريقة التحليلية من حيث الخطية وتأثيرات المصفوفة والاسترداد والتكرار.

واستخدمت في تقييم الخطية منحنيات معايرة مطابقة للمصفوفة مع عينات فارغة مسننة عند ستة مستويات تركيز (5 ميكروغرام/كغ، و10 ميكروغرام/كغ، و50 ميكروغرام/كغ، و100 ميكروغرام/كغ، و200 ميكر...

Discussion

يستخدم^{الإصدار 9} الأصلي والنسختان الرسميتان^13,14 من طريقة QuEChERS كبريتات المغنيسيوم مع أملاح كلوريد الصوديوم أو الأسيتات أو السيترات لتعزيز فصل خليط الأسيتونيتريل / الماء أثناء الاستخراج. ومع ذلك ، تميل هذه الأملاح إلى أن تترسب كمواد صلبة على الأس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL disposable glass conical centrifuge tubes	PYREX	99502-15
2 mL centrifuge tubes	Eppendorf	30120094
50 mL centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-169
5977B mass-selective detector	Agilent Technologies	1617R019
7820A gas chromatography system	Agilent Technologies	16162016
Acetone	Supelco	1006582500
Acetonitrile	VWR	83642320
Ammonium formate	VWR	21254260
Automatic shaker KS 3000 i control	IKA	3940000
Balance	Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co	ENTRIS224I-1S
Bondesil-C18, 40 µm	Agilent Technologies	12213012
Bondesil-PSA, 40 µm	Agilent Technologies	12213024
Cyclohexane	VWR	85385320
EPA TCL pesticides mix	Sigma Aldrich	48913
Ethyl acetate	Supelco	1036492500
G4567A automatic sampler	Agilent Technologies	19490057
HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column	Agilent Technologies	19091S-433UI
Magnesium sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	434183-1KG
Mega Star 3.R centrifuge	VWR	521-1752
Milli-Q gradient A10	Millipore	RR400Q101
p,p'-DDE-d8	Dr Ehrenstorfer	DRE-XA12041100AC
Pipette tips 2 - 200 µL	BRAND	732008
Pipette tips 5 mL	BRAND	702595
Pipette tips 50 - 1000 uL	BRAND	732012
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL	BRAND	704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL	BRAND	704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL	BRAND	704778
Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL	BRAND	704782
Vials with fused-in insert	Sigma Aldrich	29398-U
OCPs		CAS registry number
α-BHC		319-84-6
β-BHC		319-85-7
Lindane		58-89-9
δ-BHC		319-86-8
Heptachlor		76-44-8
Aldrin		309-00-2
Heptachlor epoxide		1024-57-3
α-Endosulfan		959-98-8
4,4'-DDE-d8 (IS)		93952-19-3
4,4'-DDE		72-55-9
Dieldrin		60-57-1
Endrin		72-20-8
β-Endosulfan		33213-65-9
4,4'-DDD		72-54-8
Endosulfan sulfate		1031-07-8
4,4'-DDT		50-29-3
Endrin ketone		53494-70-5
Methoxychlor		72-43-5