JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Immunology and Infection

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Published: May 5th, 2023

DOI:

10.3791/64992

1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Sıtma, parazit Plasmodium'un neden olduğu ölümcül bir hastalıktır ve dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla bulaşır. Omurgalı konakçıların derisinde sivrisinekler tarafından biriktirilen Plasmodium'un sporozoit aşaması, klinik sıtmaya başlamadan önce karaciğerde zorunlu bir gelişim aşamasına girer. Karaciğerdeki Plasmodium gelişiminin biyolojisi hakkında çok az şey biliyoruz; sporozoit aşamasına erişim ve bu tür sporozoitleri genetik olarak değiştirme yeteneği, Plasmodium enfeksiyonunun doğasını ve karaciğerde ortaya çıkan bağışıklık tepkisini incelemek için kritik araçlardır. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitlerinin üretimi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Kan evresi P. berghei'yi genetik olarak değiştiriyoruz ve bu formu kan yemeği aldıklarında Anofel sivrisineklerini enfekte etmek için kullanıyoruz. Transgenik parazitler sivrisineklerde geliştikten sonra, in vivo ve in vitro deneyler için parazitin sporozoit aşamasını sivrisinek tükürük bezlerinden izole ediyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) alt birimi 11'i (GFP11) eksprese eden yeni bir P. berghei suşunun sporozoitlerini üreterek protokolün geçerliliğini gösteriyoruz ve karaciğer evresi sıtmanın biyolojisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

İlaç geliştirme ve sıtmanın önlenmesi ve tedavisine yönelik araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, sıtmanın küresel hastalık yükü yüksek olmaya devam etmektedir. Her yıl yarım milyondan fazla insan sıtmadan ölüyor ve en yüksek ölüm oranları Sahra altı Afrika gibi sıtmanın endemik olduğu bölgelerde yaşayan çocuklar arasında görülüyor1. Sıtmaya, paraziti tükürük bezlerinde taşıyan dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla insanlara bulaşan parazit Plasmodium neden olur. Plasmodium'un enfeksiyöz aşaması - sporozoitler - bir kan yemeği sırasında omurgalı konakçıların derisinde birikir ve eritrosi....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Laboratuvarımızda omurgalı hayvanlarla ilgili tüm araştırmalar, Georgia Üniversitesi hayvan kullanım yönergelerine ve protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. P. berghei ile enfekte farelerin üretimi

  1. Vahşi tip P. berghei parazitleri kullanarak erkek veya dişi, 6-8 haftalık C57BL / 6 (B6) farelerinde kan evresi enfeksiyonunu başlatın. Bunu yapmak için, 400 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sulandırılan dondurula.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şizontların sıklığını ve gelişimini belirlemek, yeterli sayıda canlı parazitin transfeksiyon için en uygun aşamada olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Olgunlaşmamış şizontlar, RBC'nin tüm hücre içi boşluğunu doldurmayan daha az merozoitin varlığı ile tamamen olgun şizontlardan ayırt edilebilir (Şekil 1B). Kültürlenmiş kandan kan yayması yapılırken, enfekte olmuş eritrositlerin kırılabileceğini ve bunun da kan yaymasında serbest, hücre dı.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Laboratuvarımızda birkaç transgenik P. berghei paraziti hattı oluşturmak için yukarıdaki protokolü kullandık. P. berghei için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu protokolü transgenik P. yoelii sporozoitleri üretmek için de başarıyla kullandık. Transfekte edilen şizontları farelere enjekte ettikten sonra, parazitler tipik olarak en geç 3 d.p.i. plazmid kontrolü de dahil olmak üzere tüm gruplarda. Elektroporasyonu takiben parazitlerin yaşayabilirliğini sağlamak için .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından SPK'ya AI168307 desteklenmiştir.  UGA CTEGD Akış Sitometrisi Çekirdeğine ve UGA CTEGD Mikroskopi Çekirdeğine teşekkür ederiz. Ayrıca Ash Pathak, Anne Elliot ve UGA Sporocore personelinin protokolü optimize etmedeki katkılarını da takdir ediyoruz. Değerli içgörüler, tartışmalar ve GFP 11 ve GFP 1-10 içeren ana plazmitler için Dr. Daichi Kamiyama'ya teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Kurup laboratuvarı üyelerine sürekli destekleri, sabırları ve teşvikleri için teşekkür ederiz.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
30 G x 1/2" Syringe needleExel international26437
Alsever's solutionSigma-AldritchA3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2LonzaVMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)TCI AmericaT1420
Blood collection tubesBD bioscience365967for serum collection
C-Chip disposable hematocytometerINCYTODHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture DishGreiner Bio-One627860
Centrifuge 5425Eppendorf5405000107
Centrifuge 5910REppendorf5910RFor gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope systemOlympusIX-71
Dimethyl SulfoxideSigmaD5879-500ml
Fetal bovine serumGenClone25-525
GFP11 plasmidKurup LabpSKspGFP11Generated from PL0017 plasmid
Giemsa StainSigma-Aldritch48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cellsKurup LabHepa GFP1-10Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse SerumUsed for mosquito dissection media
NaClMillipore-SigmaSX0420-51.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector IIAmaxa Biosystems (Lonza)Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipetteVWR14673-043
Penicillin/StreptomycinSigma-AldritchP0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)Cytivia17-0891-02Details in protocol
PL0017 PlasmidBEI ResourcesMRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)Sigma46706Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640Corning15-040-CV
SoftWoRx microscopy softwareApplied Precisionv6.1.3

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved