Fluorescence-Activated Nucleus Sorting을 사용한 지방 조직을 사용한 지방 세포 특이적 ATAC-Seq

우리는 핵 형광 표지가 있는 형질전환 리포터 마우스에서 분리된 지방 조직으로 핵 분류를 사용하는 지방 세포에 특히 고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용하여 전치사 효소 접근 가능한 염색질 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

고처리량 염기서열 분석(ATAC-seq)을 통한 전이효소 접근 가능 염색질 분석은 게놈 차원의 염색질 접근성 프로파일링을 가능하게 하는 강력한 기술입니다. 이 기술은 다양한 생물학적 과정에서 유전자 발현의 조절 메커니즘을 이해하는 데 유용했습니다. ATAC-seq는 다양한 유형의 샘플에 대해 변형되었지만 지방 조직에 대한 ATAC-seq 방법의 효과적인 변형은 없었습니다. 지방 조직의 문제에는 복잡한 세포 이질성, 큰 지질 함량 및 높은 미토콘드리아 오염이 포함됩니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 형질전환 리포터 NuTRAP(Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Pification) 마우스의 지방 조직으로 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 지방 세포 특이적 ATAC-seq를 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 낭비되는 염기서열 분석 판독을 최소화하면서 핵 입력 및 시약의 양을 줄이면서 고품질 데이터를 생성합니다. 이 논문은 마우스 지방 조직에서 분리된 지방 세포 핵의 사용을 위해 검증된 ATAC-seq 방법에 대한 자세한 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 자극에 대한 지방 세포의 염색질 역학 조사에 도움이 될 것이며, 이는 새로운 생물학적 통찰력을 가능하게 할 것입니다.

지질 분자의 형태로 과도한 에너지를 저장하는 데 특화된 지방 조직은 대사 조절의 핵심 기관입니다. 지방세포 형성 및 유지의 엄격한 제어는 지방 조직 기능과 전신 에너지 항상성에 매우 중요하다¹. 많은 전사 조절자는 지방 세포 분화, 가소성 및 기능의 조절에 중요한 역할을 합니다. 이러한 조절인자 중 일부는 인간의 대사 장애와 관련이 있습니다 ^2,3. 유전자 발현 및 후성유전체학 분석을 위한 고처리량 염기서열 분석 기술의 최근 발전은 지방세포 생물학의 분자 조절인자의 발견을 더욱 용이하게 했다⁴. 지방 조직을 사용한 분자 프로파일링 연구는 이러한 조직의 이질성으로 인해 수행하기 어렵습니다. 지방 조직은 주로 지방 저장을 담당하는 지방 세포로 구성되지만 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 다양한 다른 세포 유형도 포함합니다⁵. 또한, 지방조직의 세포 조성은 온도 및 영양 상태와 같은 병태생리학적 변화에 반응하여 극적으로 변화한다⁶. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 이전에 Cre 재조합효소 의존적 방식으로 GF....

동물 관리 및 실험은 인디애나 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 절차에 따라 수행되었습니다.

1. 실험 시작 전 준비 사항

1. 조직 준비
   1. 지방세포 핵 표지의 경우, NuTRAP 마우스를 지방세포 특이적 아디포넥틴-Cre 라인(Adipoq-Cre)과 교차시켜 Adipoq-Cre 및 NuTRAP 모두에 대해 반구성인 Adipoq-NuTRAP 마우스를 생성합니다.
   2. 앞서 ?.......

이 ATAC-seq 프로토콜을 사용하여 지방 조직을 분석하기 위해 차우 사료를 먹인 Adipoq-NuTRAP 마우스를 생성했습니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 부고환 백색 지방 조직(eWAT), 사타구니 백색 지방 조직(iWAT) 및 갈색 지방 조직(BAT)에서 지방 세포 핵을 분리했습니다. 분리된 핵을 태깅에 사용한 후, DNA 정제, PCR 증폭, 품질 검사 단계, 염기서열 분석 및 데이터 분석이 위에서 설명한 바와 같습니다. ?.......

이 논문에서 우리는 생체 내에서 지방 세포 특이적 염색질 접근성을 평가하기 위해 최적화된 ATAC-seq 프로토콜을 제시했습니다. Adipoq-NuTRAP 마우스를 사용하는 이 ATAC-seq 프로토콜은 지방 세포 특이적 염색질 접근성 프로파일을 성공적으로 생성했습니다. 성공적이고 재현 가능한 ATAC-seq 실험을 위한 가장 중요한 요소는 핵 품질입니다. 해부된 지방 조직을 액체 질소에서 즉시 급속 동결하고 ?.......

이 연구는 IUSM Showalter Research Trust Fund (H.C.R.), IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 to H.C.R.) 및 American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 to H.C.R.)의 지원을 받았습니다.