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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Abstract

I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST) derivano dalle cellule di Schwann o dai loro precursori. Nei pazienti con sindrome da suscettibilità tumorale neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), le MPNST sono la neoplasia maligna più comune e la principale causa di morte. Questi sarcomi dei tessuti molli, rari e aggressivi, offrono un futuro difficile, con tassi di sopravvivenza libera da malattia a 5 anni del 34-60%. Le opzioni terapeutiche per gli individui affetti da MPNST sono deludentemente limitate, con la chirurgia deturpante che è l'opzione di trattamento principale. Molte terapie un tempo promettenti come il tipifarnib, un inibitore della segnalazione Ras, hanno fallito clinicamente. Allo stesso modo, anche gli studi clinici di fase II con erlotinib, che ha come bersaglio il fattore di crescita epidermico (EFGR), e sorafenib, che ha come bersaglio il recettore del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e Raf, in combinazione con la chemioterapia standard, non sono riusciti a produrre una risposta nei pazienti.

Negli ultimi anni, i metodi di screening genomico funzionale combinati con la profilazione genetica delle linee cellulari tumorali si sono dimostrati utili per identificare le vie di segnalazione citoplasmatiche essenziali e lo sviluppo di terapie specifiche per il bersaglio. Nel caso di tipi di tumori rari, una variante di questo approccio, nota come oncogenomica comparativa cross-species, viene sempre più utilizzata per identificare nuovi bersagli terapeutici. Nell'oncogenomica comparativa interspecie, la profilazione genetica e la genomica funzionale vengono eseguite in modelli murini geneticamente modificati (GEM) e i risultati vengono quindi convalidati nei rari campioni umani e nelle linee cellulari disponibili.

Questo articolo descrive come identificare le mutazioni del gene driver candidato nelle cellule MPNST umane e murine utilizzando il sequenziamento dell'intero esoma (WES). Descriviamo quindi come eseguire screening shRNA su scala genomica per identificare e confrontare le vie di segnalazione critiche nelle cellule MPNST di topo e umane e identificare bersagli farmacologici in queste vie. Queste metodologie forniscono un approccio efficace per identificare nuovi bersagli terapeutici in una varietà di tipi di cancro umano.

Introduzione

I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST) sono neoplasie a cellule fusiformi altamente aggressive che insorgono in associazione con la sindrome da suscettibilità tumorale neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), sporadicamente nella popolazione generale e nei siti di precedente radioterapia 1,2,3. I pazienti affetti da NF1 nascono con una copia wild-type del gene oncosoppressore NF1 e un secondo allele NF1 con una mutazione con perdita di funzione. Questo stato di aploinsufficienza rende i pazienti affetti da NF1 suscettibili a una seconda mutazione con perdita di funzione nel loro gene NF1 wild-type, che innesca la tumorigenesi. Quando questa mutazione NF1 "di secondo colpo" si verifica in una cellula della linea cellulare di Schwann, il tumore risultante è un neurofibroma dermico che insorge nella pelle o un neurofibroma plessiforme che si sviluppa in grandi nervi o plessi nervosi. Sebbene la patologia dei neurofibromi dermici e plessiformi sia identica, il loro comportamento biologico è molto diverso: sebbene sia i neurofibromi dermici che quelli plessiformi siano benigni, solo i neurofibromi plessiformi possono subire una trasformazione e dare origine a MPNST. Oltre alla perdita di neurofibromina, la proteina attivante la Ras GTPasi codificata dal gene NF1, le MPNST sono portatrici di mutazioni di molti altri geni oncosoppressori, tra cui TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 e PTEN 10, mutazioni di geni che codificano componenti del complesso repressivo polycomb 2 11,12 (PRC2 ; geni SUZ12 e EED) e l'espressione aberrante dei recettori tirosin-chinasici 1,2. Mutazioni di NF1 e degli altri geni sopra menzionati sono presenti anche nelle MPNST sporadiche e indotte da radiazioni11,12.

Sebbene questi progressi nella nostra comprensione delle anomalie genomiche nelle MPNST siano stati preziosi per la comprensione della loro patogenesi, non hanno ancora portato allo sviluppo di nuove terapie efficaci per le MPNST. Uno dei principali ostacoli che ostacolano lo sviluppo di nuovi trattamenti è il fatto che gli MPNST sono tumori rari. Per questo motivo, è difficile ottenere il gran numero di campioni di pazienti necessari per le analisi globali che definiscono le mutazioni chiave come quelle intraprese dal Cancer Genome Atlas (TCGA). In base alla nostra esperienza, l'accumulo anche di un numero modesto di campioni umani di MPNST può richiedere anni. Per superare tali limitazioni, molti ricercatori che studiano altri tipi di cancro rari si sono rivolti all'uso dell'oncogenomica comparativa interspecie per identificare le mutazioni geniche driver essenziali, definire le vie di segnalazione citoplasmatiche essenziali nel loro tumore di interesse e identificare nuovi bersagli terapeutici. Poiché le vie di segnalazione essenziali per la tumorigenesi sono altamente conservate tra gli esseri umani e altre specie di vertebrati, l'applicazione di approcci di genomica funzionale come gli screening shRNA su scala genomica può essere un mezzo efficace per identificare queste nuove mutazioni driver, vie di segnalazione e bersagli terapeutici 13,14,15,16,17,18,19 , in particolare quando si studiano tipi di tumori umani rari che sono disponibili in numero limite20.

Nelle metodologie qui presentate, descriviamo questo approccio per eseguire la profilazione genomica in linee cellulari umane di MPNST e colture di MPNST di passaggio precoce derivate da topi P 0-GGFβ3, un modello murino geneticamente modificato (GEM) in cui la sovraespressione specifica delle cellule di Schwann del fattore di crescita neuregulina-1 (NRG1) promuove la patogenesi dei neurofibromi plessiformi e la loro successiva progressione verso MPNSTs21, 22,23. Il primo passo in questo approccio consiste nell'identificare i geni driver candidati nelle MPNST P 0-GGFβ3, nelle linee cellulari umane MPNST e nelle MPNST umane resecate chirurgicamente. Per convalidare funzionalmente le vie di segnalazione influenzate da queste mutazioni, utilizziamo quindi screening shRNA su scala genomica per identificare i geni necessari per la proliferazione e la sopravvivenza in linee cellulari MPNST umane e murine. Dopo aver identificato i geni necessari per la proliferazione e la sopravvivenza, identifichiamo i prodotti genici farmacologici all'interno della raccolta di "hit" utilizzando il Drug Gene Interaction Database. Confrontiamo anche gli "hit" nelle cellule MPNST umane e murine, per determinare se il modello GEM e le MPNST umane dimostrano una dipendenza simile dagli stessi geni e vie di segnalazione. L'identificazione delle sovrapposizioni nei geni necessari per la proliferazione e la sopravvivenza e le vie di segnalazione interessate serve come mezzo per convalidare il modello murino P 0-GGFβ3 a livello molecolare. Questo approccio sottolinea anche l'efficacia della combinazione di schermi umani e murini per identificare nuovi bersagli terapeutici, in cui il modello murino può fungere da complemento agli schermi umani. Il valore di questo approccio interspecie è particolarmente evidente quando si cercano bersagli terapeutici nei tumori rari, dove i tumori umani e le linee cellulari sono difficili da ottenere.

Protocollo

Prima dell'inizio degli studi, le procedure e i protocolli per la manipolazione dei vettori virali devono essere esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC). Le procedure qui descritte sono state approvate dai consigli IACUC e IBC dell'Università di Medicina della Carolina del Sud e sono state eseguite da personale adeguatamente addestrato in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.

1. Analisi WES-SEQ e identificazione di varianti patogene

  1. Isolare il DNA genomico da un campione tumorale o da cellule MPNST sub-confluenti (70%) coltivate su un piatto da 60 mm, utilizzando metodi standard disponibili in commercio a base di gel di silice (consultare il protocollo dei produttori per i passaggi dettagliati). Il flusso di lavoro generale è illustrato nella Figura 1.
  2. Inviare almeno 10 μL di DNA genomico a 50 ng/μL al nucleo di sequenziamento, a meno che non siano specificate quantità o concentrazioni diverse di DNA genomico.
    1. La struttura centrale frammenta il DNA genomico mediante sonicazione e quindi lo purifica utilizzando il metodo preferito. La cattura dell'esoma e la costruzione della libreria vengono eseguite utilizzando il kit di sequenziamento dell'esoma preferito e i tag indice vengono aggiunti all'esoma catturato amplificato.
    2. Inviare i campioni al nucleo di sequenziamento per eseguire il sequenziamento dell'intero esoma a due estremità (WES; sequenziato a 100 bp da ciascuna estremità).
    3. I file FASTQ generati dal core vengono forniti allo sperimentatore. Utilizzare solo file FASTQ che superano le metriche di qualità per l'analisi.
  3. Allineare e analizzare i file FASTQ utilizzando programmi software disponibili in commercio (ad esempio, DNAStar19,20, Partek21 o Varsome). Allineare i file FASTQ al genoma di riferimento del topo GRCm38/mm10 utilizzando le impostazioni predefinite.
    NOTA: Utilizzando DNAStar e un campione MPNST di topo come esempio, il flusso di lavoro generale è schematizzato in Figura 1 e brevemente spiegato di seguito.
    1. Apri il software DNAStar e scegli il flusso di lavoro SeqMan NGen.
    2. Scegliere Flusso di lavoro selezionando Variant Analysis/Resequencing (Analisi delle varianti/Risequenziamento ) e il tipo di analisi di sequenziamento : Amplicone basato su NGS, pannello genico o esoma. Fare clic su Next (Avanti).
    3. Scegli la sequenza di riferimento preferita selezionando Scarica pacchetto genoma e il genoma di riferimento appropriato (ad esempio Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip o Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Se la struttura principale ha fornito un file di letto, caricare questo file ausiliario. Fare clic su Next (Avanti).
    4. Scegliere Sequenze di input selezionando la tecnologia di sequenziamento appropriata, Illumina, e indicare che le letture di sequenziamento sono accoppiate-end. Selezionare quindi l'impostazione dell'esperimento, il multicampione e caricare i file FASTQ di sequenziazione selezionando Aggiungi. Se si eseguono più campioni, designare ogni set di estremità accoppiate con un esperimento univoco o un nome di campione Tumore, Linea cellulare o A18, A202... Fare clic su Next (Avanti).
    5. Impostare il set di dati del controllo , se presente. Fate clic su Succ (Next ), quindi di nuovo su Succ (Next ) in Opzioni assieme (Assembly Options). In Opzioni di analisi, fare clic sulla modalità di rilevamento delle varianti appropriata come Diploide, quindi fare clic su Avanti. In Output assieme, assegnare un nome e designare il percorso di salvataggio dei file del progetto; fare clic su Avanti. Eseguire l'assembly nel computer locale o nel cloud.
      NOTA: I file di allineamento risultanti possono essere aperti nel flusso di lavoro ArrayStar per l'annotazione delle varianti dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) rilevati. Questo flusso di lavoro rileva gli SNP, non i guadagni o le perdite del numero di copie del gene. Un'analisi separata, chiamata array SNP ad alta densità, rileva le variazioni del numero di copie; Il sequenziamento dell'intero esoma non rileva in modo affidabile le variazioni del numero di copie. Consultare la guida per l'utente del programma per i passaggi specifici da eseguire con il programma di allineamento.
    6. Applica filtri definiti dall'utente all'annotazione delle varianti degli SNP rilevati per includere o escludere determinati dati. Per ottenere un elenco condensato di varianti probabilmente rilevanti dal punto di vista funzionale, applicare i seguenti filtri ai set di dati delle varianti in questa gerarchia: non nel controllo (se è disponibile un campione di controllo normale), frequenza della popolazione (gnomAD, ExAC, frequenze di 1.000 genomi), frequenza allelica (includere ≤0,001 o 0,1%), profondità di copertura (escludere patogenicità o classe ClinVar (includere: patogeno, probabilmente patogeno; escludere: incerto, probabilmente benigno, benigno) e, se desiderato, il tipo di SNP e l'impatto della codifica (includere: non sinonimo, missenso, assurdità, frameshift, in-frame, splicing).
      NOTA: Un elenco di geni tumorali rilevanti noti può anche essere applicato all'elenco finale per estrarre solo geni specifici rilevanti per la malattia, vedere il passaggio 1.3.7. Questi filtri possono ridurre l'elenco dei geni varianti a meno di 20 geni.
      1. Utilizzare la frequenza allelica variante per filtrare gli SNP degli errori di sequenziamento. Le varianti omozigoti ed eterozigoti saranno rappresentate approssimativamente al 100% e al 50%, rispettivamente per una popolazione cellulare pura non contaminante (una linea cellulare derivata dal tumore dovrebbe rappresentare una singola popolazione di cellule tumorali isogeniche). In questo caso, applicare come filtro le frequenze alleliche del 100-90% e del 50-40% per le varianti, rimuovendo così tutte le varianti al di sotto di tale valore. Se per lo stesso set di dati sono disponibili anche dati di array SNP ad alta densità, applicare il guadagno o la perdita del numero di copie agli SNP con frequenze alleliche varianti inferiori ai rapporti omozigoti o eterozigoti (ad esempio, il guadagno del numero di copie risultante in 2 copie dell'allele A e 1 copia dell'allele B renderebbe appropriate le frequenze alleliche varianti del 75%, 25%, rispettivamente).
    7. Dopo aver identificato le varianti patogene con ArrayStar, esporta e salva l'elenco dei geni delle varianti come file csv, txt o xls e confronta i geni contenenti queste mutazioni con quelli della coorte di tumori generati da P 0-GGFβ3 per determinare elenchi di geni mutati sovrapposti e unici. Confrontare i geni mutati con i geni mutati noti associati alle loro controparti umane (ad esempio l'elenco dei geni del cancro del laboratorio Bushman o un elenco curato dall'utente).
      1. Facoltativo, prima di applicare qualsiasi filtro definito dall'utente (1.3.6), esportare e salvare il file annotato come file VCF.
        NOTA: Questo file VCF può essere caricato in un altro software predittivo di varianti Varsome o VEP per il confronto come analisi secondaria. L'analisi biologica e di pathway può essere eseguita anche sulle liste di geni varianti filtrate.
    8. Esegui la classificazione funzionale dell'elenco dei geni varianti tramite un database preferito dall'utente per ottenere informazioni sulla classe delle proteine, sul percorso, sul componente del percorso, sulla famiglia genica e sull'ontologia.
      NOTA: PANTHER (pantherdp.org) viene utilizzato come esempio qui.
      1. Carica l'elenco dei geni filtrati con l'ID del gene.
      2. Selezionare l'organismo (Mus musculus).
      3. Selezionare l'analisi (classificazione funzionale visualizzata nell'elenco dei geni) e fare clic su Invia analisi biologica e del percorso negli elenchi di geni varianti filtrati.

2. Screening shRNA su scala genomica

NOTA: Sono disponibili diverse librerie shRNA e CRISPR che possono essere utilizzate per screening funzionali su scala genomica con colture tumorali a basso passaggio. Qui, descriviamo l'uso delle librerie shRNA CELLECTA DECIPHER come esempio. Le librerie lentivirali shRNA di CELLECTA DECIPHER sono ottimizzate per gli screening genetici RNAi in formato pooled. Ogni trascritto è bersagliato da almeno 5-6 shRNA unici e ogni vettore lentivirale di shRNA contiene un codice a barre genetico univoco affiancato da siti primer PCR. Queste librerie coprono la maggior parte dei geni rilevanti per le malattie umane e murine, ma non coprono tutti i geni del genoma. I pool di DNA plasmidico della libreria umana Cellecta sono disponibili in tre moduli (Human Module I, II, III; si rivolge a 15.377 geni) mentre i pool di plasmidi della libreria murina sono disponibili in due moduli (Mouse Modules I e II; target 9.145 geni). Queste librerie sono utilizzate per eseguire saggi di "drop-out" in cui i geni mirati necessari per la proliferazione e/o la sopravvivenza sono espressi in modo differenziato in diversi punti temporali dopo la trasduzione virale.

  1. Confezionamento lentivirale
    1. Giorno 0: Piastra 10 piastre da 10 milioni di cellule 293T/15 cm in DMEM da 30 ml/piatto privo di antibiotici contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS).
    2. Giorno 1: Verificare che le cellule siano confluenti al ~80% il giorno successivo e pronte per la trasfezione. In una provetta conica da 50 mL, miscelare quanto segue in questo ordine: 600 μL di miscela plasmidica di confezionamento (0,5 μg/μL), 60 μL di libreria di codici a barre plasmidici, 12 mL di DMEM (senza siero o antibiotici) e 600 μL di reagente di trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    3. Mettere 900 μL di reagente di trasfezione e 12 mL di DMEM in una provetta conica separata da 15 mL e miscelare mediante vortex. Aggiungere 12,9 mL della miscela di reagente di trasfezione/DMEM alla miscela di DNA e mescolare per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti senza mescolare ulteriormente. Aggiungere 2,5 mL di questa miscela, goccia a goccia, a ciascun piatto da 15 cm di cellule 293T e incubare per una notte in un incubatore per colture tissutali.
    4. Giorno 2: Sostituire i terreni il giorno seguente con terreni di coltura regolari contenenti antibiotici.
    5. Giorno 3: Raccogliere il virus raccogliendo il terreno e facendolo passare attraverso un'unità di filtrazione da 0,2 μm e aliquotandolo in provette coniche da 15 mL; preparare anche cinque aliquote da 1 mL di virus filtrato in crioviali da utilizzare nel titolo virale (considerato virus 48 h); conservare il virus in un congelatore a -80 °C. Sostituire il terreno con 30 ml di terreno di coltura sulle piastre uno alla volta per evitare che le cellule si secchino.
    6. Giorno 4: Raccogliere il virus raccogliendo il terreno e facendolo passare attraverso un'unità di filtrazione da 0,2 μm. Aliquote del virus in provette coniche da 15 ml. Questo è considerato virus 72 h; conservare il virus in un congelatore a -80 °C.
  2. Pool lentivirali titolati
    1. Aggiungere 65 μL di polimero cationico (10 mg/mL) a 65 mL di terreno di crescita delle cellule tumorali. Pipettare 1 mL/pozzetto del terreno contenente polimero in undici piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. Tripsinizzare le cellule tumorali di passaggio precoce e contare le cellule utilizzando il metodo preferito in modo che ogni pozzetto riceva 50.000 cellule/mL/pozzetto. Scongelare 1 mL di aliquote di lentivirus 48 h dal congelatore a bagnomaria a 37 °C.
    2. Per ogni modulo virale, preparare l'infezione come mostrato nella Tabella 1.
    3. Collocare tutte le piastre a 6 pozzetti in un incubatore per colture tissutali. Il giorno seguente, rimuovere i substrati virali e rifornirli con nuovi substrati di crescita. A 48 ore, aggiungere il terreno contenente puromicina a tutti i pozzetti che ricevono la selezione. Prima che le cellule di controllo siano confluenti, eseguire la conta cellulare dei cloni sopravvissuti utilizzando il metodo preferito.
      NOTA: La concentrazione di puromicina necessaria per uccidere le cellule non trasdotte deve essere predeterminata empiricamente testando un intervallo di concentrazioni in una curva di "uccisione". Utilizzare la concentrazione più bassa che induce uniformemente la morte delle colture non trasdotte.
  3. Infezione lentivirale delle cellule bersaglio
    1. Tripsinizzare le cellule MPNST e contarle. Piastra 2,5 milioni di cellule per piatto da 15 cm per un totale di venti piatti da 15 cm per modulo. Scongelare il virus e trasdurre le cellule con il virus a un MOI di 0,5 in presenza di 5 μg/mL di polimero cationico (Figura 2A).
    2. Rimuovere il terreno contenente virus la mattina seguente e sostituirlo con un terreno di coltura fresco. Coltivare le cellule per altri 2 giorni per consentire l'espressione del marcatore di selezione e quindi aggiungere puromicina alle colture per eliminare le cellule non trasdotte.
    3. Tre giorni dopo l'aggiunta di puromicina, tripsinizzare le cellule e centrifugare metà della popolazione cellulare a 200 × g per 5 minuti in una centrifuga da tavolo. Conservare le cellule pellettate nel congelatore a -80 °C per la futura preparazione del DNA genomico; questo è il punto temporale di riferimento, o punto temporale 1 (T1).
    4. Riplaccare l'altra metà della popolazione cellulare e farla crescere per circa 7 raddoppi di popolazione prima di raccogliere e centrifugare come sopra. Questo pellet cellulare servirà come punto temporale finale (punto temporale 2, T2) e viene conservato a -80 °C per il futuro isolamento del DNA genomico (Figura 2).
  4. Isolare il DNA genomico da cellule trasdotte con pool virali
    1. Scongelare il pellet cellulare dal congelatore a -80 °C e risospendere il pellet in 10 mL di tampone di risospensione con l'aggiunta di RNAsi e dividere immediatamente in due provette di polimetilpentene da 15 mL (Figura 2B).
    2. Aggiungere 500 μL di SDS al 10% per 5 mL, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Successivamente, posizionare le provette in un dispositivo di taglio del DNA per sonicare il DNA per 25 cicli di 30 s acceso/30 s spento, assicurandosi di mantenere la temperatura a 4 °C.
    3. Aggiungere 5 mL di fenolo/cloroformio, pH 8,0 (conservato a 4 °C), avendo cura di mescolare bene il fenolo/cloroformio prima dell'uso. Dopo l'aggiunta di fenolo/cloroformio, mescolare bene agitando energicamente alla massima temperatura per 45-60 s. Centrifugare per 60 min, -20 °C a 7.200 × g.
      NOTA: Un aspetto schiumoso/lattiginoso dopo il vortice segnalerà la completa risospensione.
    4. Trasferire 3 mL della fase superiore trasparente in una provetta fresca da 15 mL e aggiungere 0,5 mL di acetato di sodio 3 M e 4 mL di isopropanolo e mescolare bene (Figura 2C). Centrifugare per 30 min a 20 °C a 7.200 × g.
    5. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e quindi pipettare con cura il liquido rimanente. Aggiungere 0,5 mL di etanolo al 70% e rimuovere il pellet pipettando su e giù. Trasferire il pellet risospeso in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e combinare entrambi i pellet dello stesso campione in un'unica provetta da centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare alla massima velocità in una centrifuga da banco per 5 min.
    6. Scartare il surnatante e utilizzare una salvietta da laboratorio per assorbire l'etanolo residuo al 70%. Risospendere il pellet in 0,5 mL di acqua distillata, facendo attenzione a non lasciare che il pellet si asciughi in quanto ciò renderebbe difficile la risospensione. Conservare i campioni a 4 °C prima di misurare la concentrazione di DNA.
  5. PCR nidificata per amplificare i codici a barre shRNA
    NOTA: Recuperare il DNA dalla conservazione e metterlo sul ghiaccio. Se la concentrazione di DNA è inferiore a 100 ng/μL, asciugare rapidamente il DNA sotto vuoto e risospenderlo in un volume appropriato di acqua distillata. Si consiglia di elaborare un solo modulo alla volta (punto temporale 1 (T1) o punto temporale 2 (T2)). Eseguire due preparazioni di ogni punto temporale che devono essere raggruppate alla fine; Pertanto, è importante non elaborare i punti temporali replicati nello stesso giorno. Il seguente protocollo è per un punto temporale del DNA genomico.
    1. Impostare 7 provette ed etichettarle come descritto: controllo negativo, controllo positivo, 4 provette per il DNA genomico e una per una miscela master (Figura 3A). Il controllo negativo è l'acqua distillata; il controllo positivo è il DNA plasmidico utilizzato nella trasfezione 293T per generare lentivirus.
    2. Aggiungere prima l'acqua in ogni tubo come indicato nella Tabella 2.
    3. Preparare un Master Mix (MM) come mostrato nella Tabella 3.
    4. Aggiungere 18 μL di MM a ciascuna provetta contenente acqua. Successivamente, aggiungere 25 μL di DNA genomico a ciascuna delle 4 provette stampo. Quindi, aggiungere 1 μL di controllo positivo (10 ng/μL) alla provetta di controllo positivo, facendo attenzione a non contaminare altre provette con DNA di controllo positivo. Infine, aggiungere 2 μL di polimerasi a ciascuna provetta, aggiungendo prima alle 4 provette del campione e infine alla provetta di controllo positivo; mescolare e centrifugare le provette PCR (Figura 3).
    5. Eseguire la reazione PCR nelle condizioni indicate nella Tabella 4.
    6. Mentre la prima PCR è in esecuzione, preparare le provette per la2a PCR come indicato nella Tabella 5. Impostare sette provette: controllo negativo, controllo positivo, 4 provette per il DNA genomico e una per il MM (Figura 3B).
    7. Aggiungere 22 μL di MM a ciascuna provetta contenente acqua e attendere il completamento del primo ciclo di PCR prima di aggiungere il DNA e la polimerasi.
      1. Una volta completato il primo ciclo di PCR, unire 4 provette in una provetta per microcentrifuga e mescolare.
      2. Aggiungere 25 μL a ciascuna provetta contenente acqua.
      3. Successivamente, aggiungere 2 μL del primo controllo negativo della PCR e 2 μL del primo controllo positivo della PCR alle provette opportunamente etichettate.
      4. Aggiungere 2 μL di polimerasi a ciascuna provetta, aggiungendo prima alle 4 provette del campione e infine al controllo negativo.
    8. Eseguire la reazione PCR come indicato nella Tabella 6.
      NOTA: Dopo aver analizzato i risultati della prima reazione di PCR mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 3,5%, se si ottiene un'abbondanza di prodotto, il numero di cicli può essere ridotto a 9-10 per la successiva ripetizione di questa procedura; Allo stesso modo, se la resa del prodotto è bassa, i cicli possono essere aumentati a 14.
    9. Al termine della seconda reazione PCR, combinare 4 campioni in una provetta per microcentrifuga più 80 μL di colorante di caricamento 6x. Per i controlli positivi e negativi, utilizzare 20 μL del campione.
      1. Preparare un gel di agarosio al 3,5% in tampone Tris-Borato-EDTA (TBE) (Figura 4A). Per accogliere l'ampio volume del campione, creare un pozzetto grande nel pettine gel fissando diversi pozzetti insieme (se non è disponibile un pettine adatto al volume), assicurandosi di lasciare disponibili due pozzetti per i controlli positivo e negativo. Far funzionare il gel a 90 V per 1 ora.
    10. Visualizzare il gel e confermare la presenza di una banda a circa 250 paia di basi (bp).
  6. Prima purificazione: estrazione del gel
    1. Usando un bisturi pulito o una lametta da barba, asportare la fascia da 250 bp, tagliando quanto più gel possibile. Sezionare la banda grande in 4 pezzi e trasferire ogni pezzo in una provetta per microcentrifuga pulita. Misura e registra il peso di ogni fetta di gel.
      NOTA: Ogni pezzo deve essere di circa 200 mg o meno per provetta.
    2. Aggiungere 6 volumi di tampone di solubilizzazione (ad esempio, se il pezzo di gel pesa 200 mg, aggiungere 1,2 mL di tampone). Mettere i tubi a bagnomaria a 50 °C e ruotare ogni 10-15 minuti fino a quando le fette di gel non si sono sciolte. Quindi, aggiungere 1 volume di isopropanolo a ciascuna provetta (ad esempio, 0,2 ml di isopropanolo se il pezzo di gel pesa 200 mg).
    3. Utilizzando due colonne rotanti per la purificazione, caricare i campioni di tutte e 4 le provette nelle colonne. Eseguire più rotazioni per elaborare tutto il volume del campione poiché le colonne contengono solo 750 μL. Ruotare le colonne a 17.900 × g per 1 minuto in una microcentrifuga da banco convenzionale ed eliminare il flusso ogni volta.
    4. Lavare le colonne con 750 μL di tampone di lavaggio e centrifugare a 17.900 × g per 1 min. Dopo il lavaggio, eliminare il flusso e asciugare la colonna centrifuga centrifugando a 17.900 × g per 3 min. Eluire il DNA con 50 μL di acqua distillata per colonna e centrifugare come in precedenza per 1 minuto e unire entrambe le provette per un volume totale di 100 μL del campione.
  7. Seconda purificazione
    1. Questa fase successiva di purificazione utilizzerà il tampone legante 2 (dal kit di purificazione PCR), che non elimina i piccoli frammenti. Aggiungere 400 μL di tampone ai 100 μL di DNA e caricarlo su una colonna di spin (Figura 4B). Centrifugare il campione a 17.900 × g per 1 min.
    2. Successivamente, lavare la membrana con 650 μL di tampone di lavaggio e centrifugare come precedentemente eseguito. Asciugare la colonna di centrifugazione con centrifugazione aggiuntiva come sopra per 3 minuti.
    3. Eluire il DNA con 30 μL di acqua distillata e centrifugare alla massima velocità per 1 min. Dopo l'eluizione, controllare la concentrazione su uno spettrofotometro; assicurarsi che la concentrazione non sia inferiore a 10 ng/μL o superiore a 70-80 ng/μL. Conservare il DNA in un congelatore a -20 °C.
  8. Sequenziamento di codici a barre amplificati
    1. Per il sequenziamento, diluire i codici a barre purificati a 0,75 ng/μL utilizzando un tampone di eluizione (EB). Per aggiungere diversità di sequenza, gli ampliconi sono raggruppati a 17 pM, incluso il 30% (v/v) di PhiX. Eseguire il clustering single-end (SE) su un sistema di generazione cluster automatizzato in base al protocollo del produttore.
    2. Fare in modo che il core di sequenziamento esegua un totale di 36 cicli di sequenziamento single-end su un sequenziatore NextGen (Figura 4C). Aggiungere il primer personalizzato GexSeqS ai primer di sequenziamento Illumina a 0,5 μM.
    3. Utilizzare il software di analisi di riferimento per generare file Fastq ed elaborarli utilizzando il software per ridurre le lunghezze di lettura a 18 nucleotidi.
    4. Utilizza il software Barcode Analyzer e Deconvoluter per decontorcere le letture tagliate. Calcola i punteggi di deplezione della piega per ogni shRNA come rapporto tra i conteggi delle letture al punto temporale di riferimento (T1) rispetto al punto temporale finale (T2).
  9. Analisi dei risultati dello screening shRNA e identificazione di bersagli terapeutici candidati
    NOTA: Nella libreria shRNA di Cellecta, la maggior parte dei geni è bersagliata da 5 (67%) o 6 diversi shRNA (32%). Tuttavia, diversi geni housekeeping, che dovrebbero essere colpiti nella maggior parte delle cellule, sono bersagliati da un gran numero di shRNA e fungono da controlli che definiscono l'intervallo di punteggi per i negativi.
    1. Per prevenire pregiudizi verso i geni presi di mira da un numero maggiore di shRNA, i punteggi di deplezione sono stati trasformati logaritmicamente. Eseguire una stima quantilica calcolando l'80° percentile per ciascun gene dalla sua distribuzione empirica.
    2. Per generare una distribuzione nulla dei punteggi di deplezione della piega logaritmica, si supponga che il >95% dei geni non sarà esaurito e che i loro punteggi dei quantili logaritmici avranno una distribuzione normale. Usa la mediana della distribuzione empirica per stimare la media della distribuzione nulla. Utilizzando questa distribuzione nulla, classificare tutti i geni con punteggi di deplezione log-fold che sono più grandi del 95° percentile della distribuzione nulla come "hit".
      NOTA: Tutti gli hit devono avere almeno due shRNA con punteggi di deplezione superiori al punto di taglio (Figura 5).
    3. Per valutare la qualità dei dati dello screening dell'RNAi dropout e la validità del cut-point, utilizzare una serie di geni che sono stati definiti come "core essential" dall'iniziativa di screening RNAi COLT Cancer RNAi24,25 per il confronto. Rimuovere i CEG dall'elenco dei riscontri per produrre l'elenco iniziale dei potenziali bersagli terapeutici.
      NOTA: I geni nel set COLT hanno ottenuto un punteggio positivo nel >50% delle 72 linee cellulari tumorali che sono state sottoposte a screening da COLT. L'elenco dei geni essenziali contiene 640 geni.
    4. Per identificare potenziali bersagli terapeutici che sono comunemente o uniformemente richiesti da più linee cellulari MPNST, costruire diagrammi di Venn dei risultati non CEG identificati negli screening di diverse linee cellulari MPNST o colture di passaggio precoce (Figura 6A). Assegnare la priorità ai riscontri non CEG necessari in tutte o nella maggior parte delle linee o delle impostazioni cultura MPNST.
      1. In alternativa, eseguire analisi del percorso sulla lista di risultati non CEG da ciascuna linea cellulare o coltura di passaggio precoce per identificare i geni i cui prodotti codificano componenti delle vie di segnalazione necessarie per la proliferazione e/o la sopravvivenza delle cellule tumorali. Quindi, confrontare le vie di segnalazione identificate nell'analisi della via dei non-CEG con le vie di segnalazione che sono state identificate come influenzate da mutazioni identificate con WES.
        NOTA: Troviamo particolarmente utile identificare le vie di segnalazione che sono costantemente influenzate dalle mutazioni identificate in WES e confrontarle con le vie di segnalazione identificate come critiche negli screening shRNA.
    5. Per identificare i bersagli farmacologici per i quali sono già disponibili agenti terapeutici, esaminare l'elenco dei risultati rimanenti dopo la rimozione dei geni essenziali di base utilizzando il Drug Gene Interaction Database (dgidb.org).
      NOTA: Questo database consente di inserire e sottoporre a screening un elenco di geni contemporaneamente e fornisce indicazioni sui farmaci attualmente disponibili per colpire questi geni.
    6. Convalidare prima i bersagli ad alto interesse farmacologico identificati abbattendo la loro espressione genica con shRNA distinti da quelli utilizzati nella schermata iniziale della libreria in un singolo formato batch (non un formato libreria-batch appena descritto). Per abbattere l'espressione genica, utilizzare due o tre shRNA lentivirali distinti. Tre o quattro giorni dopo l'infezione, determinare l'effetto che questo ha sulla proliferazione e sulla sopravvivenza delle cellule tumorali come descritto di seguito.

3. Eseguire saggi citometrici del numero di cellule e della vitalità nelle cellule MPNST sfidate con agenti terapeutici candidati

  1. Far crescere le cellule MPNST in DMEM fino all'80% di confluenza. Risciacquare le celle con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) a temperatura ambiente.
    NOTA: Non far crescere le cellule fino alla confluenza poiché la crescita di queste cellule sarà ritardata per un po' di tempo dopo la riplaccatura.
  2. Staccare le cellule dal substrato coprendo le cellule per 30 secondi a 1 minuto con una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica. Aggiungere 5 mL di DMEM per 1 mL di soluzione di dissociazione e pipettare delicatamente le cellule su e giù per staccarle dal substrato.
  3. Conta le cellule usando un emocitometro. Piastre con una densità di 1.200 cellule per pozzetto in piastre a 96 pozzetti con pareti nere; Piastra almeno tre pozzetti per ogni diluizione del farmaco che verrà testata ed eseguire tre repliche biologiche di questi esperimenti.
  4. Per determinare le concentrazioni iniziali del farmaco che verrà testato, esaminare la letteratura per valutare quali concentrazioni sono state efficaci contro altri tipi di cellule tumorali. Negli esperimenti iniziali, testare un intervallo di due ordini di grandezza al di sopra e due ordini di grandezza al di sotto della concentrazione del farmaco utilizzato con altri tipi di cancro.
  5. Preparare le diluizioni del farmaco da testare e aggiungere ogni diluizione o veicolo ad almeno tre pozzetti replicati.
  6. Valutare il numero di cellule dirette 1, 3, 5 e 7 giorni dopo l'aggiunta dei farmaci. Aggiungere Hoechst 33342 a una concentrazione finale di 5 μg/mL e incubare le piastre per 30 minuti a 37 °C. Lettura delle piastre su un citometro per imaging ad alto rendimento utilizzando l'opzione di conteggio diretto delle cellule per il numero totale di cellule con tempi di esposizione di 100.000 ms.
  7. Analizza le letture utilizzando il software ed esportale in un foglio di calcolo e utilizza un software appropriato per le analisi statistiche.
  8. Se si osservano riduzioni statisticamente significative del numero di cellule nei pozzetti trattati con il farmaco, eseguire un test "Vivo/Morto" per determinare se questa riduzione è dovuta, in parte, all'induzione della morte cellulare.
    1. Celle a piastre in piastre a 96 pozzetti con pareti nere, come descritto al punto 3.3.
    2. Preparare e aggiungere i farmaci come descritto al punto 3.5.
    3. Valutare la vitalità cellulare e la morte 1, 3, 5 e 7 giorni dopo l'aggiunta del farmaco. Aggiungere calceina AM a una concentrazione finale di 1 μM e ioduro di propidio a una concentrazione finale di 1 μM in ciascun pozzetto. Incubare le cellule per 15 minuti a 37 °C.
    4. Immagini di cellule su un citometro per imaging utilizzando l'opzione software Live+Dead . Analizza le letture utilizzando il software ed esportale in un foglio di calcolo e utilizza un software appropriato per le analisi statistiche.

Risultati

I grafici della Figura 5 mostrano i punteggi di deplezione dei geni essenziali fondamentali (GEM) etichettati come TRUE rispetto ai non-CEG (etichettati come FALSE) in ciascuna linea cellulare umana sottoposta a screening. I punti rappresentano log2 dei punteggi di deplezione della piega per i singoli geni, che sono tracciati su una rappresentazione boxplot della distribuzione complessiva del punteggio. Il test t di Student è stato utilizzato per verificare una differenza significa...

Discussione

I metodi dettagliati qui presentati sono stati sviluppati per studiare la neoplasia del sistema nervoso periferico e la patogenesi della MPNST. Sebbene abbiamo riscontrato l'efficacia di questi metodi, è necessario riconoscere che esistono alcune potenziali limitazioni ai metodi descritti in questa sede. Di seguito, discutiamo alcune di queste limitazioni e le potenziali strategie per superarle in altri sistemi modello.

Abbiamo scoperto che il sequenziamento dell'intero esoma identifica effic...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), il National Cancer Institute (R01 CA122804 a S.L.C.) e il Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioruptor Sonication SystemDiagenode UCD-600
CASAVA 1.8.2
CbotIllumina, San Diego, CAN/A
Celigo Image CytometerNexcelomN/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve HybridDecon Laboratories5989-27-5
Corning 96-well Black MicroplateMillipore SigmaCLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubesDiagenode C30010009
dNTP mixClontech639210
Eosin YThermo Scientific7111
Elution bufferQiagen 19086
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Excel Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’HPLC purified
GraphPad PrismDotmatics
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
Illumina HiScanSQIllumina, San Diego, CAN/A
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
PLUS Transfection ReagentThermo Scientific11514015
Polybrene Transfection ReagentMillipore SigmaTR1003G
PureLink Quick PCR Purification KitInvitrogenK310001
Qiagen Buffer P1Qiagen 19051
Qiagen Gel Extraction KitQiagen28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymeraseClontech639210
Trimmomatic softwarewww.usadellab.org

Riferimenti

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