Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolde, bir fare modelinde GC-MS kullanılarak BAT ile optimize edilmiş arteriyovenöz metabolomikler ile ilgili yöntemler özetlenmiştir. Bu yöntemler, organizma düzeyinde BAT aracılı metabolit değişimi hakkında değerli bilgiler edinilmesine izin verir.

Özet

Kahverengi yağ dokusu (BAT), titremeyen termojenez olarak bilinen benzersiz bir enerji harcama süreci yoluyla metabolik homeostazın düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bunu başarmak için BAT, yüksek metabolik talebini desteklemek için dolaşımdaki besinlerden oluşan çeşitli bir menü kullanır. Ek olarak, BAT, metabolik yakıtlar veya sinyal molekülleri olarak hizmet edebilen metabolit kaynaklı biyoaktif faktörleri salgılar ve BAT aracılı doku içi ve/veya dokular arası iletişimi kolaylaştırır. Bu, BAT'ın keşfedilmeye başlanan ilginç bir özellik olan sistemik metabolit değişimine aktif olarak katıldığını göstermektedir. Burada, in vivo fare düzeyinde optimize edilmiş BAT arteriyovenöz metabolomikler için bir protokol sunuyoruz. Protokol, termojenik stimülasyonlar için ilgili yöntemlere ve interskapular BAT kaynaklı venöz kanı ve sistemik arteriyel kanı seçici olarak boşaltan Sulzer damarını kullanan bir arteriyovenöz kan örnekleme tekniğine odaklanmaktadır. Daha sonra, bu kan örneklerini kullanan bir gaz kromatografisi tabanlı metabolomik protokol gösterilmiştir. Bu tekniğin kullanımı, BAT tarafından metabolitlerin net alımını ve salınımını ölçerek organlar arası düzeyde BAT tarafından düzenlenen metabolit değişiminin anlaşılmasını genişletmelidir.

Giriş

Kahverengi yağ dokusu (BAT), hem mitokondriyal ayrılmayan protein 1 (UCP1) bağımlı hem de UCP1'den bağımsız mekanizmaları 1,2,3,4,5 içeren, titremeyen termojenez (NST) olarak bilinen benzersiz bir enerji harcama özelliğine sahiptir. Bu ayırt edici özellikler, sistemik metabolizmanın düzenlenmesinde ve obezite, tip 2 diyabet, kardiyovasküler hastalık ve kanser kaşeksisi dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezinde BAT'ı içerir 6,7,8. Son retrospektif çalışmalar, insanlarda BAT kütlesi ve/veya metabolik aktivitesi ile obezite, hiperglisemi ve kardiyometabolik sağlık arasında ters bir ilişki olduğunu göstermiştir 9,10,11.

Son zamanlarda, BAT, termojenik yakıtolarak önemli miktarda dolaşımdaki besin maddesini gerektirdiğinden, NST'nin korunmasından sorumlu bir metabolik lavabo olarak önerilmiştir 6,7. Ayrıca BAT, endokrin ve/veya parakrin sinyaller olarak işlev gören kahverengi adipokinler veya BATokinler olarak adlandırılan biyoaktif faktörleri üretebilir ve serbest bırakabilir, bu da sistem düzeyinde metabolik homeostaza aktif katılımını gösterir 12,13,14,15. Bu nedenle, BAT'ın besin metabolizmasını anlamak, termoregülasyon organı olarak geleneksel rolünün ötesinde, insanlarda patofizyolojik önemi hakkındaki anlayışımızı geliştirmelidir.

Metabolize edilemeyen radyoizleyiciler kullanan klasik besin alım çalışmaları ile birlikte kararlı izotop izleyicileri kullanan metabolomik çalışmalar, hangi besin maddelerinin BAT tarafından tercihen alındığını ve nasıl kullanıldığını anlamamızı önemli ölçüde geliştirmiştir 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Örneğin, radyoaktif izleyici çalışmaları, soğukla aktive olan BAT'ın glikoz, lipoproteine bağlı yağ asitleri ve dallı zincirli amino asitleri aldığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Metabolomik çalışmalarla birleştirilen son izotop izleme, bu besinlerin dokular ve kültürlenmiş hücreler içindeki metabolik kaderini ve akışını ölçmemize izin verdi 24,25,26,28,29,30. Bununla birlikte, bu analizler öncelikle besinlerin bireysel kullanımına odaklanmakta ve bizi BAT'ın organ metabolit değişimindeki sistem düzeyindeki rolleri hakkında sınırlı bilgi bırakmaktadır. BAT tarafından tüketilen dolaşımdaki besinlerin spesifik serileri ve bunların karbon ve nitrojen açısından nicel katkıları ile ilgili sorular belirsizliğini korumaktadır. Ek olarak, BAT'ın besinleri kullanarak metabolit kaynaklı BATokinler (örneğin lipokinler) üretip salgılayamayacağının araştırılması daha yeni başlıyor 12,13,14,15,31,32.

Arteriyovenöz kan analizi, organlarda/dokularda dolaşan moleküllerin spesifik alımını veya salınımını değerlendirmek için kullanılan klasik bir fizyolojik yaklaşımdır. Bu teknik daha önce oksijen ve çeşitli metabolitleri ölçmek için sıçanların interskapular BAT'ına uygulanmış, böylece katabolik potansiyeli 33,34,35,36,37 ile BAT'ı adaptif termojenezin ana bölgesi olarak oluşturmuştur. Son zamanlarda, sıçan interskapular BAT kullanılarak yapılan bir arteriyovenöz çalışma, termojenik olarak uyarılmış BAT38 tarafından salınan keşfedilmemiş BATokinlerin tanımlanmasına yol açan bir trans-omik yaklaşımla birleştirildi.

Yüksek hassasiyetli gaz kromatografisi ve sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi (GC-MS ve LC-MS) tabanlı metabolomiklerdeki son gelişmeler, organa özgü metabolit değişiminin kantitatif analizi için arteriyovenöz çalışmalara olan ilgiyi yeniden alevlendirmiştir 39,40,41. Bu teknikler, yüksek çözme güçleri ve kütle doğrulukları ile, küçük numune miktarları kullanılarak çok çeşitli metabolitlerin kapsamlı analizini sağlar.

Bu gelişmelerle uyumlu olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışma, arteriyovenöz metabolomikleri fare düzeyinde BAT'yi incelemek için başarıyla uyarladı ve farklı koşullar altında BAT'deki metabolit değişim aktivitelerinin kantitatif analizini sağladı42. Bu makale, bir C57BL/6J fare modelinde GC-MS kullanılarak BAT hedefli bir arteriyovenöz metabolomik protokol sunmaktadır.

Protokol

Tüm deneyler Sungkyunkwan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Fareler, günlük 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünün ardından 22 °C ve %45 nemde ayarlanmış bir temiz odada bulunan IACUC onaylı bir hayvan tesisine yerleştirildi. Havalandırmalı raflarda tutuldular ve standart bir yemek diyetine (%60 karbonhidrat, %16 protein ve %3 yağ içeren) erişebildiler. Yatak ve yuvalama malzemeleri haftalık olarak değiştirildi. Bu çalışma için, 12 haftalık ve 25 g ile 30 g arasında ağırlığa sahip erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Bu hayvanlar ticari bir tedarikçiden temin edilmiştir (bkz.

1. Kahverengi yağ dokusunun metabolik aktivitesinin sıcaklık iklimlendirme ve farmakolojik stimülasyon yoluyla modülasyonu

NOT: Birkaç gün ila haftalar boyunca sıcaklık alıştırma veya β-adrenerjik reseptör agonistleri kullanılarak farmakolojik stimülasyon, BAT aktivitesinimodüle etmek için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir 1. Bu nedenle, okuyucuların gerektiği gibi uygun yaklaşımı seçmelerini sağlamak için yönteme kısa bir genel bakış aşağıda verilmiştir. Metabolik olarak inaktif (daha az termojenik) BAT elde etmek için, C57BL/6J fareler için termonötralite (28-30 °C) olarak adlandırılan bir temel sıcak sıcaklık seçilir. Bu aralık, farelerin sabit bir vücut ısısını korumak için fazladan enerji harcamasına gerek kalmamasını sağlar. Metabolik olarak orta veya yüksek derecede aktif (termojenik) BAT elde etmek için sırasıyla hafif soğuk (20-22 °C) veya şiddetli soğuk (6 °C) sıcaklıklar seçilebilir. Bu deneyin amaçları doğrultusunda, fareler, fareler için hafif soğuk olmasına rağmen, herhangi bir farmakolojik uyarım içermeyen 22 ° C'de standart barınma koşulları altında yetiştirildi.

  1. Sıcaklık iklimlendirme
    1. Fareleri, sıcaklık alıştırmasına başlamadan en az 1 hafta önce kafes başına 1 veya 2 fareyi barındıracak şekilde ayırın. Havalandırma, sıcaklık ve nem kontrolü ile donatılmış kemirgen inkübatörlerini istenen koşullarda hazırlayın.
    2. Kafesleri, seçilen sıcaklık alıştırma türü için uygun günlerde ilgili kemirgen kuluçka makinelerine taşıyın.
    3. Fare sayılarının dağılımının, kafes başına 1 veya 2 fare olacak şekilde tüm gruplarda eşit olduğundan emin olun. Tek konut, grup konutuna göre sıcaklığa bağlı fizyolojik değişikliklere daha duyarlı olduğu için tercih edilir43. Her grup için özel barınma koşulları şunlardır:
      1. Termonötralite (30 °C) grubu: Bu gruptaki fareleri dört haftaya kadar sürekli olarak 30 °C sıcaklıkta tutun.
      2. Şiddetli soğuk grubu: Başlangıçta, bu gruptaki fareleri herhangi bir yuvalama malzemesi olmadan 18 °C'de barındırın. Dördüncü haftada 6 °C'ye ulaşan kademeli bir haftalık sıcaklık düşüşü yaşayacaklar. Sıcaklık ilerlemesi şu şekildedir: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Hafif soğuk grubu (20-22 °C): Bu gruptaki fareleri kemirgen inkübatörlerinde daha önce bahsedilen standart barınma koşullarıyla aynı koşullarda barındırın.
      4. Akut soğuk algınlığı zorlukları: Akut soğuk algınlığı zorlukları için, herhangi bir yuvalama malzemesi olmadan kafes başına 1-2 fare yerleştirin ve bunları 8 saate kadar 6 °C'ye ayarlanmış bir kemirgen inkübatöre maruz bırakın.
        NOT: Bu barınma koşulları ve sıcaklık değişimleri, farklı sıcaklık ortamlarının BAT aktivitesi ve metabolizması üzerindeki etkilerini incelemek için gereklidir.
    4. Kafesleri değiştirin ve her hafta yiyecek ve su doldurun. Kafesleri takviyeden en az 24 saat önce, ilgili sıcaklıklarında (kemirgen kuluçka makinesi) önceden iklimlendirin.
      NOT: Uygun sıcaklık uyaranının bozulmasını önlemek için, yuva oluşumuna yol açabilecek fare zenginleştirmelerinin sağlanmaması önemlidir. Şiddetli soğuğa yanıt olarak, fareler vücut ısısını korumak için daha fazla enerji harcarlar, bu da gıda alımının artmasına ve daha yüksek atılım oranlarına neden olur. Bu nedenle, farelerin yeterli miktarda yiyecek ve suya sahip olduğundan ve kafeslerin aşırı ıslak olmadığından emin olmak için kafesleri haftada en az iki ila üç kez (yerel kurumsal yönergeleri izleyerek) kontrol etmek çok önemlidir. Bu izleme, çalışma sırasında farelerin refahını ve sağlığını korumak için gereklidir.
  2. Farmakolojik stimülasyon1 β3-adrenerjik reseptör agonisti CL316,243 kullanılarak
    1. Uyarıcı etkiyi en üst düzeye çıkarmak için, fareleri enjeksiyonlardan önce 2-4 hafta boyunca termonötralitede (30 ° C) önceden barındırın.
    2. Alışma döneminden sonra intraperitoneal olarak 1 mg / kg CL316,243 enjekte edilir.
      NOT: β3-adrenerjik reseptör agonisti ile kronik stimülasyon için (ör. 3 günden 1,44,45. haftaya kadar), ilaç stabilitesi nedeniyle günlük enjeksiyonlar gereklidir. Seyreltilmiş CL316,243, stabilite nedeniyle enjeksiyon gününde hazırlanmalıdır.

2. Arteriyovenöz kan örneklemesi

NOT: 12-14 haftadan büyük fareler, arteriyovenöz kan örneklemesi için en iyi şekilde önerilir. Daha genç fareler, interskapular BAT46'dan venöz kanı spesifik olarak boşaltan ayrı bir kan damarı olan Sulzer damarlarına yeterince büyüklükte olmayabilir.

  1. İndüksiyon için %3 izofluran (205 x 265 x 200 mm boyutlu bir odada) ve bakım için %2 izofluran (gaz anestezi maskesi ile) içeren kalibre edilmiş buharlaştırıcıyı kullanarak nazikçe uyuşturun.
    NOT: Tüm arteriyovenöz kan örnekleme prosedürü anesteziden hemen sonra yapılmalıdır. Çekirdek vücut ısısını korumak için anestezi sırasında su ısıtmalı bir ısıtma pedi kullanılabilir.
    DİKKAT: İzofluran solunduğunda oldukça uçucu ve toksiktir. Bu nedenle, birincil anestezik bir çeker ocak altında yapılmalıdır.
  2. Anestezinin uygun bir derinliğe ulaştığını doğrulamak için hayvanın pençe geri çekilmesi gibi reflekslerini doğrulayın.
  3. Sulzer'in damarından venöz kan toplanması
    1. Fareyi sırt derisini ortaya çıkaracak şekilde konumlandırın, kesiyi yapmadan hemen önce bir ayak parmağı kıstırma yoluyla anestezi derinliğini onaylayın. Saçların ayrılmasını önlemek için sırt derisini bol miktarda %70 etanol ile nemlendirin ve göğüs kafesinin alt kısmından boyuna kadar sırt boyunca bir kesi yapın.
      NOT: İnterskapular BAT, ince beyaz yağ dokuları ile kaplı iki yağ yastıkçığından oluşan derinin hemen altında bulunur. Gaz anestezi maskesi aracılığıyla farenin anestezi altında kalmasını sağlamak önemlidir.
    2. İnterskapular BAT'ı bükülmüş uçlu forseps ile nazikçe kaldırın ve çoğu kas olan bağlı dokuları dikkatlice kesin. Yağ yastığını başa doğru kaldırın, bağlı dokuları kesmeye devam edin ve Sulzer'in damarı (interskapular BAT'ın her iki yağ yastığına bağlı büyük 'Y' şeklinde koyu kırmızı bir damar) açığa çıkana kadar bölgeyi dikkatlice açın.
      NOT: İnterskapular BAT'ın ön ve yan bölgesi ile bağlantılı kas dokularının kılcal damarlarını kesmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak Sulzer damarından akan kanın miktarını ve kalitesini önemli ölçüde azaltacaktır.
    3. Sulzer'in damarını dikkatlice kesin ve alttan kesilmiş 200 μL pipet uçları ve bir P100 pipet kullanarak yaklaşık 40 μL kan toplayın. Kanı bir kan alma tüpünde saklayın ve serum toplama işlemine kadar tüpü buz üzerinde tutun.
      NOT: Superior vena kava47'den kan kontaminasyonunu önlemek için Sulzer damarının Y şeklindeki bölünme noktasının hemen altından kan almak önemlidir. Çok fazla kan toplamak Sulzer'in damarının özelliklerini azaltacaktır. Bu nedenle, analiz için Sulzer'in damarından gereken minimum miktarda kan topladığınızdan emin olun. Kan alma tüplerini seçerken dikkatli olun, çünkü serum ve plazma farklı metabolit profilleriverir 48,49,50. Plazma toplama için heparin kaplı tüplerin kullanılması gerekir. Bu deneyde, serum elde etmek için pıhtılaşma aktivatörü kaplı tüpler seçildi. EDTA kütle spektrometrisi sinyallerini51,52 önemli ölçüde etkilediğinden, hiçbir koşulda EDTA kaplı tüpler kullanılmamalıdır.
  4. Sol ventrikülden arteriyel kan toplanması
    1. Ventral cildi ortaya çıkarmak için burun konisine teması kaybetmeden fareyi çevirin. Kesi yapmadan önce anestezi derinliğini bir ayak parmağı kıstırma ile onaylayın. Saç ayrılmasını önlemek için ventral cildi bol miktarda %70 etanol ile nemlendirin ve herhangi bir iç yapıya zarar vermeden kalbi açığa çıkarmak için göğüs boşluğunu makasla dikkatlice açın.
    2. 29 G (1/2") iğne ile 1 mL'lik bir şırınga kullanarak sol ventrikülün apeks bölgesini doğru bir şekilde delin. 1/2 inçlik bir iğnenin üçte ikisini kalbin tepesinin sağ yataline 3-5 mm'ye kadar sokun (Şekil 1B) ve sol ventrikülden (50-100 μL) kan almak için şırıngayı geri çekin. Sol ventrikülden gelen kan, parlak kırmızı olan oksijenli arteriyel kandır. Kanı bir kan alma tüpünde saklayın ve serum toplama işlemine kadar tüpü buz üzerinde tutun.
      NOT: Kalbe erişim için göğüs boşluğunda minimal bir kesi yapılmalıdır. Aşırı kesi lokal kanamaya neden olabilir ve bu da daha sonra düşük tansiyona neden olabilir. Bu, sol ventrikülden toplanan arteriyel kanın kalitesini etkileyebilir. Sol ventrikülün kesin konumunu belirlemeyi zorlaştıracağından kalbi döndürmekten veya çevirmekten kaçının.
    3. Ötenazi yapın ve yerel kurumların yönergelerini izleyerek uygun bir yöntemle sağlayın. Örneğin, ötenazi servikal çıkık yoluyla yapılabilir ve kalp atışının kesilmesiyle doğrulanabilir.
  5. Kan örneklerini 10.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice toplayın. Süpernatant, kullanılan kan alma tüpünün tipine bağlı olarak serum veya plazma içermelidir. Burada durulabilir ve GC-MS analizi için serum işlemine kadar numuneler -20 °C'de saklanabilir.
    NOT: Kırmızı renkli süpernatan gözlenirse hemoliz potansiyel olarak meydana gelmiş olabilir. Hemolizi önlemek için, pıhtılaşma tamamlanmadan önce numuneyi vorteksleyin. Glutamin ve laktat dahil olmak üzere bazı kırmızı kan hücresi ile zenginleştirilmiş metabolitler, verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir, ancak çoğu metabolit hemolizden önemli ölçüde etkilenmeyebilir. Serum / plazmanın bir hafta içinde analiz edilmesi önerilir.

3. Serumdan metabolit ekstraksiyonu ve kimyasal türevlendirme

  1. Ekstraksiyon için hazırlık
    NOT: Metabolit ekstraksiyonu, türevlendirme ve veri analizi dahil olmak üzere tüm yöntemler, daha önce açıklanan yöntemlerinbiraz değiştirilmiş versiyonlarıdır 53,54.
    1. MS dereceli metanole 100 μM DL-norvalin çözeltisi, dahili standart (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek ekstraksiyon tamponunu hazırlayın.
    2. Tüm deneysel prosedürlerin buz üzerinde yapıldığından emin olun.
  2. Sulzer damarından veya sol ventrikülden ekstrakte edilen 10 μL fare serumunu, 40 μL ekstraksiyon tamponu içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  3. Hücre kalıntılarını ve proteini çıkarmak için, serum örneklerini kısaca vorteksleyin, ardından 4 ° C'de 30 dakika boyunca maksimum hızda (18.000 x g) santrifüjleyin.
  4. Santrifüjlemeden sonra, 40 μL süpernatantı dikkatlice bir cam şişeye aktarın ve ardından 4 °C'de bir vakumlu santrifüjde 3 saat kurutun.
    NOT: Sonraki türevlendirme adımı boyunca kullanılan plastik-reaktif kimyasallar nedeniyle plastik tüpler yerine bir cam ek parça ( Malzeme Tablosuna bakınız) önerilir.
  5. Kurutulmuş numuneleri, serum metabolitlerinin GC-MS analizi için iki ardışık türevlendirme adımına tabi tutun.
    NOT: Solventlerin tahriş riski nedeniyle aşağıdaki adımlar çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir.
    1. Kurutulmuş serum ekstraktlarını piridin içinde çözünmüş 30 μL 10 mg / mL metoksiyamin hidroklorür (Malzeme Tablosuna bakınız) içinde yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    2. Metabolitlerin sililasyonu için numuneleri, 70 ° C'de 70 ° C'de 1 saat boyunca 70 μL N-metil-N-tert-butildimetilsililrifloroasetamid (MTBSTFA, Malzeme Tablosuna bakınız) ile türevlendirin.
      NOT: Plastikle reaksiyona giren türevlendirme çözücüleri nedeniyle aşağıdaki adımlarda plastik uç yerine cam şırınga kullanılması tavsiye edilir.

4. GC-MS kullanarak metabolomik analiz

NOT: Sulzer damarından ve sol ventrikülden türetilmiş örneklerde karbonhidratlar, amino asitler ve TCA döngüsü ara ürünleri dahil olmak üzere çeşitli serum metabolitlerini ölçmek için tek dörtlü GC-MS (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı. Alternatif olarak başka sütunlar da kullanılabilir, ancak sıcaklık programı da dahil olmak üzere deneysel ayarlar kullanılan sütun türlerine bağlı olarak değişebilir.

  1. 1 μL türetilmiş numuneyi, 280 °C'de (giriş sıcaklığı) bölünmesiz modda, 1.500 mL/dak akış hızına (ayar noktası) sahip bir taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak GC'ye enjekte edin.
  2. Dört kutuplu 200 °C'de GC-MS arayüzü ile 300 °C'ye ayarlayın.
    NOT: Tüm metabolit analizleri için fırın programı 60 °C'de başlar, 1 dakika tutulur ve daha sonra sıcaklık 320 °C'ye ulaşana kadar 10 °C/dk hızında artırılır.
  3. 70 eV'ye ayarlanmış elektron iyonizasyonu (EI) ile veri toplayın ve örnek verileri tarama modunda (50-550 m/z)53 alın. Bu çalışmada kullanılan tüm metabolitler, kütle spektrumlarını ve alıkonma sürelerini doğrulamak için daha önce standartlarla doğrulanmıştır.
  4. Piyasada bulunan bir analiz yazılımı kullanarak pik alan entegrasyonunu gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  5. Bileşikleri, her bir TBMDS türevinin ürün iyonu ile eşleştirin. Ardından, parça iyonunun m/z değerini karşılık gelen tepe alanına entegre ederek ekstraksiyon iyon kromatogramını (EIC) elde edin ve ardından dışa aktarın. Parça iyonları Tablo 1'de gösterilmiştir.
    NOT: Her bir bileşiğin EIC'si, her numunedeki DL-norvalininki ile normalleştirildi. Veriler, her normalleştirilmiş EIC değeri kullanılarak Log2 Sulzer veni ile sol ventriküle (Log2(SV/LV)) temsil edilir.

Sonuçlar

Şekil 1 , BAT için optimize edilmiş AV metabolomiklerinin deneysel şemasını göstermektedir. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, diferansiyel olarak uyarılmış kahverengi yağ dokuları elde etmek için fareler, kemirgen inkübatörleri kullanılarak sıcaklığa alıştırılır veya β-adrenerjik reseptör agonistleri gibi farmakolojik uygulama alırlar. Daha sonra fareler uyuşturulur ve metabolomik analiz için kan örnekleri alınır (Şekil 1A

Tartışmalar

BAT'ın tüm vücut enerji dengesindeki metabolik potansiyelini anlamanın kritik bir adımı, hangi besinleri tükettiğini, metabolik olarak nasıl işlendiğini ve dolaşıma hangi metabolitlerin salındığını tanımlamaktır. Bu protokol, yakın zamanda Park ve ark.42 tarafından geliştirilen ve onaylanan C57BL/6J farelerde interskapular BAT venöz vaskülatürüne ve sistemik arteriyel vaskülatüre erişim sağlayan özel bir arteriyovenöz örnekleme tekniğini tanıtmaktadır. Aşağı...

Açıklamalar

Yazarlar, bildirecekleri herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Metodolojik tartışma için Choi ve Jung laboratuvarlarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Tavsiye ve geri bildirimleri için C. Jang ve D. Guertin'e teşekkür ederiz. Makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için M.S. Choi'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma NRF-2022R1C1C1012034 tarafından S.M.J.'ye finanse edilmiştir; NRF-2022R1C1C1007023'ten DWC'ye; NRF-2022R1A4A3024551'den S.M.J. ve D.W.C.'ye Bu çalışma W.T.K. için Chungnam Ulusal Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 ve Şekil 2 BioRender (http://biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5-20 µL Filter TipsAxygenAX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"BD Biosciences309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)AgilentG7077B
Agilent 7693A AutosamplerAgilentG4513A
Agilent 8890 GC SystemAgilentG3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UIAgilent19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)AgilentG3335-90240
C57BL/6J mouseDBLC57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)LABCONCO 7811041
DL-NorvalineSigma-AldrichN7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430REppendorf5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30120086
Glass insert 250 μL Agilent5181-1270
Methanol (LC-MS grade)Sigma-AldrichQ34966-1L
Methoxyamine hydrochlorideSigma-Aldrich226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat baseSarstedt20.1290.100
MTBSTFASigma-Aldrich394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)Sigma-Aldrich270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum ConcentratorsLABCONCO 7310041
Rodent dietSAFESAFE R+40-10
Rodent incubatorPower scientificRIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"BD Biosciences328203
Vial Cap 9 mmAgilent5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mLAgilent5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40AxygenPCR-02-C

Referanslar

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 200Kahverengi Ya DokusuBATTitremeyen TermojenezMetabolik HomeostazDola mdaki BesinlerEnerji Harcama S reciBiyoaktif Fakt rlerMetabolik Yak tlarSinyal Molek lleriDoku i leti imDokular Aras leti imFare D zeyinde Optimize Edilmi BAT Arterioven z MetabolomiklerTermojenik Stim lasyonlarArteriyoven z Kan rnekleme Tekni iSulzer DamarGaz Kromatografisi Tabanl Metabolomik ProtokolOrganlar Aras D zeyde Metabolit De i imi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır