Disociación de muestras de tejido tumoral humano y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para disociar rápidamente muestras de tumores humanos y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula.

Resumen

Las muestras de tumores humanos contienen una gran cantidad de información sobre su microambiente y su repertorio inmunitario. La disociación efectiva de muestras de tejido humano en suspensiones celulares viables es un insumo necesario para la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq). A diferencia de los enfoques de secuenciación masiva de ARN, scRNAseq nos permite inferir la heterogeneidad transcripcional en muestras tumorales a nivel de una sola célula. La incorporación de este enfoque en los últimos años ha dado lugar a muchos descubrimientos, como la identificación de estados y programas celulares inmunitarios y tumorales asociados a las respuestas clínicas a las inmunoterapias y otros tipos de tratamientos. Además, las tecnologías unicelulares aplicadas a tejidos disociados se pueden utilizar para identificar el repertorio de receptores de células T y B de las regiones de cromatina accesibles, y la expresión de proteínas, utilizando anticuerpos con código de barras de ADN (CITEseq).

La viabilidad y la calidad de la muestra disociada son variables críticas cuando se utilizan estas tecnologías, ya que pueden afectar drásticamente a la contaminación cruzada de células individuales con ARN ambiental, a la calidad de los datos y a la interpretación. Además, los protocolos de disociación largos pueden conducir a la eliminación de poblaciones celulares sensibles y a la regulación positiva de una firma génica de respuesta al estrés. Para superar estas limitaciones, ideamos un protocolo de disociación universal rápida, que ha sido validado en múltiples tipos de tumores humanos y murinos. El proceso comienza con la disociación mecánica y enzimática, seguida de la filtración, la lisis de sangre roja y el enriquecimiento de muertos vivos, adecuado para muestras con un bajo aporte de células (por ejemplo, biopsias con aguja). Este protocolo garantiza una suspensión unicelular limpia y viable, primordial para el éxito de la generación de emulsiones de gel (GEM), códigos de barras y secuenciación.

Introducción

Aunque muchos avances en la investigación del cáncer han llevado al desarrollo y la aprobación de la FDA de agentes dirigidos a los receptores inhibidores expresados en las células inmunitarias y tumorales, conocidos como inhibidores del bloqueo de puntos de control, la resistencia a la terapia y la identificación de los mecanismos que impulsan la respuesta del paciente siguen^{siendo un desafío}. El complejo desafío de caracterizar la heterogeneidad tumoral en su diversidad molecular y la intrincada interacción entre las células tumorales y el microambiente inmunitario requiere nuevos enfoques para diseccionar este complejo ecosistema con una res....

Protocolo

Este estudio cumplió con todas las directrices institucionales en cuanto a la toma de muestras de tejido humano. Se recibió el consentimiento informado de los pacientes y se anonimizaron los datos de las muestras identificables. Las muestras se recogen en el quirófano, se colocan en una solución de RPMI, solución salina o PBS, y se confirma que son cancerosas a través del departamento de patología antes de su uso en la investigación. Todos los pasos, excepto los indicados, deben realizarse a 4 °C o con hielo. Trabaje dentro de una capucha de bioseguridad cuando procese tejido humano. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos lo....

Resultados

Se obtuvo una biopsia de melanoma suspendida en RPMI e inmediatamente se colocó en hielo. La muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenía 420 μL de RPMI y enzimas de digestión, se picó en trozos pequeños con tijeras y se sometió a una digestión enzimática posterior durante 15 min en un mezclador térmico colocado verticalmente a 37 °C (Figura 1). Después de la digestión, la muestra se filtró a través de un filtro desechable estéril de 50 μm y el.......

Discusión

Este protocolo describe la disociación de muestras de tumores humanos o murinos en una suspensión unicelular para la secuenciación de ARNc utilizando el sistema microfluídico 10x Genomics. En el procesamiento de tejidos que a menudo provienen de cánceres raros o que forman parte de ensayos clínicos en curso o experimentos largos para tumores murinos, la muestra debe conservarse de manera óptima y cuidadosa entre todos los pasos. Todos los pasos deben llevarse a cabo rápidamente en hielo o a 4 °C para mantener lo.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C