Disociación de muestras de tejido tumoral humano y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para disociar rápidamente muestras de tumores humanos y de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula.

Resumen

Las muestras de tumores humanos contienen una gran cantidad de información sobre su microambiente y su repertorio inmunitario. La disociación efectiva de muestras de tejido humano en suspensiones celulares viables es un insumo necesario para la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq). A diferencia de los enfoques de secuenciación masiva de ARN, scRNAseq nos permite inferir la heterogeneidad transcripcional en muestras tumorales a nivel de una sola célula. La incorporación de este enfoque en los últimos años ha dado lugar a muchos descubrimientos, como la identificación de estados y programas celulares inmunitarios y tumorales asociados a las respuestas clínicas a las inmunoterapias y otros tipos de tratamientos. Además, las tecnologías unicelulares aplicadas a tejidos disociados se pueden utilizar para identificar el repertorio de receptores de células T y B de las regiones de cromatina accesibles, y la expresión de proteínas, utilizando anticuerpos con código de barras de ADN (CITEseq).

La viabilidad y la calidad de la muestra disociada son variables críticas cuando se utilizan estas tecnologías, ya que pueden afectar drásticamente a la contaminación cruzada de células individuales con ARN ambiental, a la calidad de los datos y a la interpretación. Además, los protocolos de disociación largos pueden conducir a la eliminación de poblaciones celulares sensibles y a la regulación positiva de una firma génica de respuesta al estrés. Para superar estas limitaciones, ideamos un protocolo de disociación universal rápida, que ha sido validado en múltiples tipos de tumores humanos y murinos. El proceso comienza con la disociación mecánica y enzimática, seguida de la filtración, la lisis de sangre roja y el enriquecimiento de muertos vivos, adecuado para muestras con un bajo aporte de células (por ejemplo, biopsias con aguja). Este protocolo garantiza una suspensión unicelular limpia y viable, primordial para el éxito de la generación de emulsiones de gel (GEM), códigos de barras y secuenciación.

Introducción

Aunque muchos avances en la investigación del cáncer han llevado al desarrollo y la aprobación de la FDA de agentes dirigidos a los receptores inhibidores expresados en las células inmunitarias y tumorales, conocidos como inhibidores del bloqueo de puntos de control, la resistencia a la terapia y la identificación de los mecanismos que impulsan la respuesta del paciente siguen^{siendo un desafío}. El complejo desafío de caracterizar la heterogeneidad tumoral en su diversidad molecular y la intrincada interacción entre las células tumorales y el microambiente inmunitario requiere nuevos enfoques para diseccionar este complejo ecosistema con una resolución de una sola célula. Comprender las complejidades moleculares dentro de los tumores y sus microentornos es fundamental para avanzar en estrategias terapéuticas y descifrar la compleja biología subyacente a^{la progresión del} cáncer. La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) se ha vuelto cada vez más popular porque proporciona análisis de alta resolución de células individuales dentro de muestras tumorales complejas ^3,4.

La heterogeneidad tumoral, que abarca diversidades genéticas, epigenéticas y fenotípicas, plantea un desafío para descubrir las complejidades de la biología del cáncer⁵. Los métodos convencionales de secuenciación masiva de ARN tienden a oscurecer los perfiles de expresión únicos y los fenotipos de las poblaciones celulares heterogéneas presentes dentro de los tumores, ya que estos métodos promedian las señales en poblaciones celulares enteras⁴. Por el contrario, scRNA-seq permite la disección de tipos de células individuales, revelando diversas expresiones génicas, patrones de represión y estados celulares que de otro modo se pasarían por alto ^4,6. La premisa de scRNA-seq radica en su capacidad para decodificar las firmas genéticas y moleculares de las células individuales, lo que es muy prometedor para descubrir nuevas^{terapias contra} el cáncer.

Al descifrar los perfiles de expresión génica de las células tumorales y las células estromales e inmunitarias circundantes, los investigadores pueden identificar nuevos objetivos terapéuticos y desarrollar estrategias de medicina genética de precisión adaptadas^{a pacientes individuales}. Además, la disección del repertorio inmunitario dentro del microambiente tumoral proporciona información crucial sobre la interacción entre las células tumorales y los efectores inmunitarios, allanando el camino para las intervenciones inmunoterapéuticas³. A pesar de los avances en el uso de scRNAseq en muestras clínicas, varios desafíos durante los pasos de procesamiento pueden dañar la integridad del ARN de la célula, la viabilidad y la calidad de los datos generados. Además, el procesamiento de tejidos con baja viabilidad celular puede aumentar los niveles de ARN ambiental en las gotas generadas durante la encapsulación de células individuales, lo que da lugar a una contaminación cruzada y a una anotación incorrecta de los tipos de células, mientras que los largos protocolos de disociación realizados a 37 °C pueden conducir a la regulación positiva de una firma génica de respuesta al estrés en múltiples tipos de células ^{8,9, 10}.

El procedimiento escalonado (Figura 1A) descrito en este protocolo comienza con una rápida disociación mecánica y enzimática de los tumores, seguida de la filtración y la eliminación de las células muertas, dependiendo de la viabilidad de cada muestra tumoral. En la actualidad, este procedimiento ha sido verificado en muestras de tumores de melanoma¹¹, colorrectal¹², carcinoma escamoso de cabeza y cuello¹³, páncreas y pulmón (datos no publicados). Estas técnicas garantizan la generación de suspensiones de células viables de alta calidad, cruciales para los análisis posteriores¹⁴. En particular, la eliminación de glóbulos rojos, desprovistos de ARN sintetizado, se vuelve imperativa para purificar la muestra¹⁵. La evaluación posterior de los recuentos celulares y la eliminación de las células muertas sirven como requisito previo para el éxito de la generación exitosa de emulsión de gel de gel (GEM), el código de barras y el aumento de la recuperación de transcripciones y células secuenciadas sin poner en peligro la exclusión de poblaciones sensibles (por ejemplo, neutrófilos y células epiteliales)¹⁶. Estos pasos son fundamentales para liberar el potencial del análisis de resolución de una sola célula dentro de muestras tumorales ^9,10, descubrir nuevos perfiles de expresión génica y firmas inmunitarias necesarias para impulsar intervenciones terapéuticas innovadoras e identificar nuevas vulnerabilidades tumorales.

Protocolo

Este estudio cumplió con todas las directrices institucionales en cuanto a la toma de muestras de tejido humano. Se recibió el consentimiento informado de los pacientes y se anonimizaron los datos de las muestras identificables. Las muestras se recogen en el quirófano, se colocan en una solución de RPMI, solución salina o PBS, y se confirma que son cancerosas a través del departamento de patología antes de su uso en la investigación. Todos los pasos, excepto los indicados, deben realizarse a 4 °C o con hielo. Trabaje dentro de una capucha de bioseguridad cuando procese tejido humano. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Obtención de la muestra

1. Obtener una muestra sólida del tumor en un tubo de medio y colocarla sobre hielo.
   1. Indique al personal del quirófano que transporte la muestra en un tubo que contenga suficiente RPMI, solución salina o PBS para sumergir completamente el tejido y evitar la deshidratación de la muestra.
      NOTA: Es importante asegurarse de que la muestra no esté desecada , ya que esto disminuirá la viabilidad.
2. Enfríe todas las centrífugas a 4 °C y lleve el mezclador térmico a 37 °C.
3. Retire las enzimas de disociación tumoral humanas o de ratón preparadas (Tabla de materiales), descongele en el mezclador térmico a 37 °C y pase a hielo una vez descongelado.
4. Recupere una alícuota de 20 ml de RPMI.
5. Registre la información relevante de la muestra (p. ej., identificación del paciente, desidentificador, tipo de muestra).
6. Transfiera la muestra a una placa de cultivo de tejidos de 60 mm (colocada sobre hielo) invirtiendo el tubo varias veces y vertiendo el contenido en la placa para garantizar que se transfiera todo el material de la muestra. Si la muestra no se entregó en un medio a su llegada, agregue un medio RPMI nuevo al plato.
   1. Si la muestra está fragmentada, centrifugar el tubo que contiene la muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min, desechar el sobrenadante, volver a suspender la muestra en 420 μL de RPMI y pasar a la sección 2.

2. Digestión mecánica y enzimática

1. Pipetear 420 μL de medio desde la placa de muestra de 60 mm a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Intente incluir los fragmentos de muestra suspendidos en el medio.
2. Transfiera el tejido de muestra de la placa de 60 mm al tubo de 1,5 ml que contiene el medio con pinzas. Cortar la muestra con unas tijeras limpias dentro del tubo para que las piezas tengan un máximo de 2-3 mm de diámetro.
3. Añadir enzimas de digestión, preparadas de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Tabla de Materiales), a la muestra en los siguientes volúmenes: 42 μL de enzima H (proteasas inespecíficas) para muestras humanas, enzima D (proteasas inespecíficas) para muestras murinas, 21 μL de enzima R (proteasas inespecíficas) y 5 μL de enzima A (nucleasa).
4. Agregue otros 420 μL de medio de la placa o hasta la marca de 1 mL en el tubo. No exceda los 420 μL de medio.
5. Agite el tubo durante 5 s y colóquelo en un mezclador térmico colocado verticalmente de lado (Figura 1B). Incubar a 37 °C, 450 rpm, durante 15 min.
   NOTA: Durante la incubación, saque todos los materiales 10x Genomics necesarios para la generación de GEM, ya que requieren 30 minutos para equilibrarse a temperatura ambiente

3. Filtrado de muestras

1. Coloque un filtro celular de 50 μm encima de un nuevo tubo cónico de 15 mL y cebe el filtro pasando 1 mL de medio RPMI fresco a través de él hacia el tubo.
2. Después de la digestión, transfiera la muestra al tubo de 15 ml utilizando una punta de pipeta ancha de baja retención de 1.000 μl. Lave el tubo de 1,5 ml con 1 ml de medio fresco y transfiera el medio al filtro para asegurarse de que todo el material de la muestra pase a través del filtro.
3. Obtenga una jeringa de plástico de 1 ml y saque solo el émbolo (deseche el resto de la jeringa). Con la parte posterior del émbolo de la jeringa, muela y empuje la muestra sobre el filtro con un movimiento giratorio.
4. Lave el filtro con 5 mL de medio y cualquier medio restante de la placa que contenía la muestra (sección 1) para recoger cualquier célula que pueda haberse desprendido del tejido.
5. Coloque un filtro celular de 30 μm encima de un nuevo tubo cónico de 15 mL, cebe el filtro con 1 mL de medio y transfiera el contenido del tubo que contiene la muestra disociada a través del filtro.
   NOTA: Este paso eliminará los residuos grandes que podrían obstruirse o causar una falla de humectación al ejecutar la muestra con los chips microfluídicos 10x Genomics.

4. Lisis de glóbulos rojos

1. Centrifugar la muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspire el medio, teniendo cuidado de no alterar el pellet.
2. Vuelva a suspender en el tampón ACK Lysis para eliminar los glóbulos rojos (RBC) y registrar el volumen utilizado. El volumen dependerá del tamaño del gránulo y de la extensión de glóbulos rojos en el gránulo.
   NOTA: La solución de muestra de ACK resuspendida debe ser incolora cuando se haya agregado suficiente tampón ACK Lysis, ya que esto eliminará los glóbulos rojos de la muestra.
3. Centrifugar el tubo de muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
4. Repita los pasos 4.2-4.3 según sea necesario hasta que el gránulo de muestra no tenga un color rojo visible después de la centrifugación (Figura 2). Registre los volúmenes adicionales de tampón ACK Lysis utilizados en este paso.
5. Vuelva a suspender el gránulo de muestra en medios nuevos en preparación para el recuento.

5. Recuento de células

1. Coloque 10 μL de azul de tripán en un tubo de 1,5 mL. Mezclar suavemente las células disociadas, tomar 10 μL de muestra y mezclar (1:1) con el azul de tripán. Cargue 10 μL a cada lado de un hemocitómetro y cuente las células.
2. Registre la concentración de células, el recuento total de células vivas, el porcentaje de viabilidad y el volumen final de los medios después del recuento.
3. Asegúrese de que el recuento de células esté entre 700 y 1.200 células/μL (7 × 10⁵- 1,2 × 10⁶/mL) para una ejecución óptima de 10x Genomics.
   1. Si la muestra está demasiado concentrada, dilúyala con medios y vuelva a contarla.
   2. Si la muestra está demasiado diluida, centrifugar la muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min, y volver a suspenderla en un volumen menor de medio.
   3. Si la viabilidad celular está por debajo del 80%, realice un procedimiento de vivo-muerto para eliminar las células muertas.
   4. Si hay menos de un millón de células, consulte la sección 6.
   5. Si hay más de un millón de células y la viabilidad > del 10%, ver sección 6.
   6. Si hay más de un millón de células y la viabilidad < del 10%, ver sección 7.
   7. Si la viabilidad de la célula es superior al 80%, mantenga las células procesadas en hielo y proceda inmediatamente a la generación de GEM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6. Eliminación de células muertas - Kit 1

NOTA: Trabaje dentro de una campana de bioseguridad cuando utilice los reactivos de eliminación de células muertas, ya que estos pueden contaminarse fácilmente.

1. Centrifugar la muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.
2. Prepare el medio de aislamiento en un tubo cónico de 15 mL y manténgalo a temperatura ambiente: 9,8 mL de PBS, 10 μL de CaCl₂ y 200 μL de FCS inactivado por calor (añadido en una campana de bioseguridad).
3. Después de la centrifugación, aspire el medio del pellet y vuelva a suspender en 1 mL del medio de aislamiento.
4. Vuelva a centrifugar el tubo a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μL de medio de aislamiento.
5. Transfiera 100 μL de muestra en un medio de aislamiento a un pocillo de un tubo de tira de PCR de 0,2 mL.
6. En una campana de bioseguridad, agregue 10 μL de Cóctel de Anexina V y 10 μL de Cóctel de Selección de Biotina al pocillo que contiene 100 μL de la muestra en medios de aislamiento. Pipetea, mezcla la solución y déjala reposar a temperatura ambiente durante 4 min.
7. Después de 4 min, vórtice las partículas magnéticas recubiertas de dextrano durante 30 s. Añada 20 μL de las perlas y 60 μL de medio aislante a la muestra (un volumen total de 200 μL). Si la viabilidad es inferior al 40%, aumente la cantidad de perlas hasta 40 μL mientras ajusta el volumen de los medios de aislamiento (hasta 40 μL), manteniendo un volumen total de 200 μL. Mezcle la pipeta y deje reposar la solución a temperatura ambiente durante 3 min.
8. Coloque el tubo de tira en un separador magnético Genomics 10x (en la configuración alta) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
9. Transfiera el líquido del tubo de tira sin alterar las perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de unión baja. No retire el tubo de tira del imán.
10. Centrifugar el tubo de 1,5 ml que contiene la muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de medios RPMI en función del tamaño del pellet y de las células de recuento, como se describe en la sección 5. Repita el procedimiento de eliminación de células muertas si la viabilidad permanece por debajo del 80% (Figura 3 y Figura 4).
    NOTA: No vuelva a suspender las células en medios de aislamiento para la generación posterior de GEM, ya que el cloruro de calcio interferirá con el proceso de encapsulación y el paso de transcripción inversa (RT).
11. Mantenga las células procesadas en hielo si la viabilidad celular es superior al 80% y proceda inmediatamente a la generación de GEM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Eliminación de células muertas - Kit 2

NOTA: Trabaje dentro de una campana de bioseguridad cuando utilice los reactivos del kit.

1. Coloque las microperlas y la solución madre tampón aglutinante 20x dentro de una campana de bioseguridad.
2. Centrifugar la suspensión de la muestra a 450 × g, 4 °C durante 5 min.
3. Prepare 1 solución tampón en condiciones estériles utilizando 1 mL de la solución tampón de unión 20x pipeteada en 19 mL de agua destilada sin ADNasa, ARNasa.
4. Una vez finalizada la centrifugación, aspire el sobrenadante, añada las microperlas, mezcle suavemente la muestra e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
   1. Cuando el recuento de células sea de 10⁷ o menos, agregue 100 μL de las microperlas.
   2. Para recuentos superiores a 10⁷ células totales, ajuste las microperlas para una concentración final de 100 μL por 10⁷ células vivas.
5. Durante la incubación, obtenga una columna de selección positiva MACS, MACS multistand y el separador magnético correspondiente. Asegúrese de que el separador esté nivelado en el soporte múltiple y que no haya ningún otro objeto metálico o magnético cerca del soporte, ya que la fuerza magnética es poderosa y podría afectar la eficiencia de eliminación de células muertas. Coloque la columna cómodamente en un soporte separador con las alas hacia afuera.
6. Después de la incubación de la muestra, si el volumen total de resuspensión es inferior a 500 μL, añada 1x tampón de unión hasta que el volumen total sea de 500 μL.
7. Coloque un tubo cónico de 15 mL debajo de la columna y cebe la columna con 3 mL de tampón de unión 1x.
8. Reemplace el tubo cónico por un nuevo tubo cónico de 15 mL para la recolección de muestras celulares y agregue la muestra a la columna, permitiendo que fluya completamente a través de la columna.
9. Lave la columna 4 x 3 mL de 1x tampón de encuadernación, solo agregue un lavado a la vez después de que el lavado anterior haya fluido completamente a través de la columna.
10. Después del cuarto lavado, centrifugar el tubo cónico que contiene las células aisladas durante 5 min a 450 × g, 4 °C. Descarte la columna y el búfer de enlace 1x restante.
11. Vuelva a suspender la solución de muestra en la cantidad adecuada de medios RPMI en función del tamaño del gránulo y cuente las células aisladas utilizando el método descrito en la sección 5 (Figura 3 y Figura 5).
    1. Si la viabilidad sigue siendo inferior al 80% y el número total de células es de 10⁶ o menos, repita la sección 6.
    2. Si la viabilidad celular es superior al 80%, mantenga las células procesadas en hielo y proceda inmediatamente a la generación de GEM de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Se obtuvo una biopsia de melanoma suspendida en RPMI e inmediatamente se colocó en hielo. La muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenía 420 μL de RPMI y enzimas de digestión, se picó en trozos pequeños con tijeras y se sometió a una digestión enzimática posterior durante 15 min en un mezclador térmico colocado verticalmente a 37 °C (Figura 1). Después de la digestión, la muestra se filtró a través de un filtro desechable estéril de 50 μm y el...

Discusión

Este protocolo describe la disociación de muestras de tumores humanos o murinos en una suspensión unicelular para la secuenciación de ARNc utilizando el sistema microfluídico 10x Genomics. En el procesamiento de tejidos que a menudo provienen de cánceres raros o que forman parte de ensayos clínicos en curso o experimentos largos para tumores murinos, la muestra debe conservarse de manera óptima y cuidadosa entre todos los pasos. Todos los pasos deben llevarse a cabo rápidamente en hielo o a 4 °C para mantener lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C