Modelo in vitro que integra la rigidez y el flujo del sustrato para estudiar las respuestas de las células endoteliales

Resumen

Sintetizamos y caracterizamos un sustrato a base de gelatina sintonizable para el cultivo de células endoteliales vasculares (CE) en condiciones de flujo vascular relevantes. Esta superficie biomimética reproduce condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite el estudio de las fuerzas mecánicas sobre el comportamiento de la CE y avanza en nuestra comprensión de la salud vascular y los mecanismos de la enfermedad.

Resumen

Presentamos un innovador modelo in vitro destinado a investigar los efectos combinados de la rigidez tisular y el estrés de cizallamiento en la función de las células endoteliales (CE), que son cruciales para comprender la salud vascular y la aparición de enfermedades como la aterosclerosis. Tradicionalmente, los estudios han explorado los impactos del esfuerzo cortante y la rigidez del sustrato en las CE, de forma independiente. Sin embargo, este sistema integrado combina estos factores para proporcionar una simulación más precisa del entorno mecánico de la vasculatura. El objetivo es examinar la mecanotransducción de la CE a través de varios niveles de rigidez tisular y condiciones de flujo utilizando CE humanas. Detallamos el protocolo para sintetizar hidrogeles de metacrilato de gelatina (GelMA) con rigidez sintonizable y sembrarlos con ECs para conseguir confluencia. Además, describimos el diseño y montaje de una cámara de flujo rentable, complementada con simulaciones de dinámica de fluidos computacional, para generar condiciones de flujo fisiológico caracterizadas por flujo laminar y niveles adecuados de esfuerzo cortante. El protocolo también incorpora el marcaje de fluorescencia para la microscopía confocal, lo que permite evaluar las respuestas de la CE tanto a la distensibilidad tisular como a las condiciones de flujo. Al someter las CE cultivadas a múltiples estímulos mecánicos integrados, este modelo permite realizar investigaciones exhaustivas sobre cómo factores como la hipertensión y el envejecimiento pueden afectar a la función de la CE y a las enfermedades vasculares mediadas por la CE. Los conocimientos obtenidos de estas investigaciones serán fundamentales para dilucidar los mecanismos subyacentes a las enfermedades vasculares y para desarrollar estrategias de tratamiento eficaces.

Introducción

El endotelio, que recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la salud vascular. Las células endoteliales (CE) son fundamentales para regular diversas funciones cardiovasculares, incluyendo el control del tono de los vasos, la permeabilidad selectiva, la hemostasia y la mecanotransducción ^1,2. La investigación ha relacionado firmemente la disfunción de la CE con un papel principal en el desarrollo de la aterosclerosis. En particular, las CE encuentran diversas fuerzas mecánicas en las interfaces donde interactúan con el flujo sanguíneo y los teji....

Protocolo

1. Síntesis de GelMA

1. Prepare una solución 0,2 M de carbonato de sodio anhidro y una solución 0,2 M de bicarbonato de sodio.
2. Mezcle 46 mL de solución de bicarbonato de sodio con 15 mL de solución de carbonato de sodio y agregue 139 mL de agua desionizada (DI). Ajuste el pH a 9,5 utilizando 0,1 M de NaOH y HCl si es necesario.
3. Añadir 10 g de gelatina tipo A de 300 floraciones de piel de cerdo a 100 mL de tampón de carbonato-bicarbonato a una concentración del 10% p/v.
4. Disuelva la gelatina en un baño de agua a 55 °C mientras agita la solución a 700 rpm con un agitador magnético. Una vez que esté completamente disue....

Resultados

La Figura 1 muestra la configuración experimental, describiendo el proceso de síntesis de GelMA a través de una reacción de metacrilación. El producto resultante se utilizó para fabricar el sustrato de hidrogel, sobre el que se sembraron las EC. Posteriormente, las células se introdujeron en la cámara de flujo para un experimento de flujo de 6 h a 12 dinas/^cm2.

¹Se utilizó espectroscopia de RMN H para evaluar el éxito de la reacció.......

Discusión

El sistema vascular es un entorno dinámico en el que diversas fuerzas influyen significativamente en el comportamiento celular. Estudiar los eventos biológicos en las enfermedades cardiovasculares sin tener en cuenta estas fuerzas sería inexacto. Por lo tanto, los modelos celulares capaces de emular el entorno mecánico vascular son cruciales. Los investigadores ya han hecho progresos significativos en destacar el efecto de estas fuerzas en el comportamiento celular¹¹. Sin embargo, para compren.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabrication
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunostaining
Acetone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthesis
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunostaining
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabrication
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabrication
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC growth kit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Cell Culture
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabrication
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Cell Culture
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabrication
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylic Anhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Cell Culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	14080-055	General
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Sodium Carbonate	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS educational version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vascular Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Cell Culture