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Sintetizamos y caracterizamos un sustrato a base de gelatina sintonizable para el cultivo de células endoteliales vasculares (CE) en condiciones de flujo vascular relevantes. Esta superficie biomimética reproduce condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite el estudio de las fuerzas mecánicas sobre el comportamiento de la CE y avanza en nuestra comprensión de la salud vascular y los mecanismos de la enfermedad.
Presentamos un innovador modelo in vitro destinado a investigar los efectos combinados de la rigidez tisular y el estrés de cizallamiento en la función de las células endoteliales (CE), que son cruciales para comprender la salud vascular y la aparición de enfermedades como la aterosclerosis. Tradicionalmente, los estudios han explorado los impactos del esfuerzo cortante y la rigidez del sustrato en las CE, de forma independiente. Sin embargo, este sistema integrado combina estos factores para proporcionar una simulación más precisa del entorno mecánico de la vasculatura. El objetivo es examinar la mecanotransducción de la CE a través de varios niveles de rigidez tisular y condiciones de flujo utilizando CE humanas. Detallamos el protocolo para sintetizar hidrogeles de metacrilato de gelatina (GelMA) con rigidez sintonizable y sembrarlos con ECs para conseguir confluencia. Además, describimos el diseño y montaje de una cámara de flujo rentable, complementada con simulaciones de dinámica de fluidos computacional, para generar condiciones de flujo fisiológico caracterizadas por flujo laminar y niveles adecuados de esfuerzo cortante. El protocolo también incorpora el marcaje de fluorescencia para la microscopía confocal, lo que permite evaluar las respuestas de la CE tanto a la distensibilidad tisular como a las condiciones de flujo. Al someter las CE cultivadas a múltiples estímulos mecánicos integrados, este modelo permite realizar investigaciones exhaustivas sobre cómo factores como la hipertensión y el envejecimiento pueden afectar a la función de la CE y a las enfermedades vasculares mediadas por la CE. Los conocimientos obtenidos de estas investigaciones serán fundamentales para dilucidar los mecanismos subyacentes a las enfermedades vasculares y para desarrollar estrategias de tratamiento eficaces.
El endotelio, que recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la salud vascular. Las células endoteliales (CE) son fundamentales para regular diversas funciones cardiovasculares, incluyendo el control del tono de los vasos, la permeabilidad selectiva, la hemostasia y la mecanotransducción 1,2. La investigación ha relacionado firmemente la disfunción de la CE con un papel principal en el desarrollo de la aterosclerosis. En particular, las CE encuentran diversas fuerzas mecánicas en las interfaces donde interactúan con el flujo sanguíneo y los tejidos vasculares subyacentes 3,4. Varios estudios han asociado la disfunción de la CE con cambios anormales en los factores mecánicos dentro del entorno vascular, como el esfuerzo por cizallamiento del líquido del flujo sanguíneo y la rigidez de los tejidos 5,6,7.
Sin embargo, la investigación previa ha recibido una atención limitada en la comprensión de los efectos combinados de la rigidez del tejido y el esfuerzo cortante en la función de la CE. Para mejorar la capacidad de traducir los resultados de la investigación en tratamientos efectivos para la aterosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, es esencial mejorar los modelos celulares utilizados en el campo. Se han logrado avances significativos en la humanización de modelos celulares mediante el empleo de EC humanas y su sometimiento a esfuerzos cortantes o sustratos con diferentes niveles de rigidez 8,9,10. Sin embargo, la adopción y el refinamiento de modelos celulares que integran entornos de flujo dinámico con sustratos EC que poseen propiedades de rigidez ajustables ha progresado lentamente. El reto consiste en idear sustratos de EC que no se hinchen para evitar alteraciones en los parámetros de caudal dentro del canal de flujo y, al mismo tiempo, facilitar el cultivo de monocapas de EC intactas y bien adheridas. Un modelo in vitro capaz de superar estos obstáculos podría facilitar investigaciones más efectivas sobre cómo la hipertensión, el envejecimiento y las condiciones de flujo influyen en colaboración en la mecanotransducción de la CE, la salud vascular y, en última instancia, el desarrollo de la aterosclerosis. Se han desarrollado varios métodos para aplicar tensión de cizallamiento en las células mientras se controla la rigidez del sustrato, incluidas placas giratorias y dispositivos microfluídicos. En el método de placa giratoria, las celdas se colocan entre dos placas y se aplica un esfuerzo cortante a través del movimiento de rotación de las placas. Este método es menos complicado y proporciona un modelo rápido; sin embargo, sufre de variación del esfuerzo cortante espacial, con un esfuerzo cortante cero en el centro y un esfuerzo cortante máximo en la periferia11.
Por otro lado, los dispositivos microfluídicos representan la nueva generación de herramientas con la capacidad de controlar la rigidez del sustrato y las condiciones de flujo. Estos sistemas son adecuados para imitar microvasculaturas en condiciones de flujo laminar. Sin embargo, el estudio de la aterosclerosis con estos dispositivos es poco práctico, ya que la aterosclerosis ocurre en grandes vasos con flujo alterado11. Este artículo tiene como objetivo contribuir al dominio crítico de investigación de los estudios de CE mediante la presentación de un sistema rentable capaz de examinar los efectos de los diferentes niveles de rigidez en sustratos de CE bajo diferentes condiciones de flujo. El sistema integra sustratos con diferentes rigideces para emular vasos sanguíneos patológicos y fisiológicos. Este protocolo describe el método para crear hidrogeles a base de gelatina sin hinchazón y con niveles de rigidez de 5 kPa y 10 kPa, que representan la rigidez fisiológica y patológica, respectivamente. Adicionalmente, se detalla la construcción de una cámara de flujo de placas paralelas capaz de integrar estos sustratos. Se empleó la dinámica de fluidos computacional (CFD) para evaluar el esfuerzo cortante y las condiciones de flujo. Se describe la preparación de hidrogeles para el cultivo de CE y la ejecución de un experimento de flujo de 6 h, seguido de una discusión sobre la inmunotinción posterior al experimento.
1. Síntesis de GelMA
2. Salinización del vidrio
NOTA: La fijación de hidrogeles a los portaobjetos de vidrio proporciona una superficie plana y uniforme, lo que facilita el manejo y garantiza la estabilidad bajo el esfuerzo cortante derivado del flujo. La funcionalización del vidrio con metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo es necesaria para mejorar las propiedades de la superficie y permitir la unión covalente de hidrogeles durante el proceso de polimerización.
3. Preparación del hidrogel
4. Hidrogeles de recubrimiento
5. Células de siembra en los sustratos
6. Fabricación de la cámara de flujo
NOTA: El enfoque para diseñar la cámara de flujo es rentable y requiere una experiencia mínima para la fabricación y utilización.
7. Ejecute un flujo laminar uniforme
8. Configuración de inmunotinción para microscopía confocal con gran aumento
NOTA: Para aumentar la eficiencia del estudio, se desarrolló un método para inmunotinción de pequeñas porciones de hidrogeles, lo que permite el examen de múltiples objetivos biológicos en una sola muestra.
La Figura 1 muestra la configuración experimental, describiendo el proceso de síntesis de GelMA a través de una reacción de metacrilación. El producto resultante se utilizó para fabricar el sustrato de hidrogel, sobre el que se sembraron las EC. Posteriormente, las células se introdujeron en la cámara de flujo para un experimento de flujo de 6 h a 12 dinas/cm2.
1Se utilizó espectroscopia de RMN H para evaluar el éxito de la reacció...
El sistema vascular es un entorno dinámico en el que diversas fuerzas influyen significativamente en el comportamiento celular. Estudiar los eventos biológicos en las enfermedades cardiovasculares sin tener en cuenta estas fuerzas sería inexacto. Por lo tanto, los modelos celulares capaces de emular el entorno mecánico vascular son cruciales. Los investigadores ya han hecho progresos significativos en destacar el efecto de estas fuerzas en el comportamiento celular11. Sin embargo, para compren...
Los autores declaran que se ha presentado una solicitud de patente provisional (Nº 63/634.853) con el título Cámara de flujo con un sustrato mecánicamente sintonizable, y que no existen otros intereses contrapuestos.
Los autores extienden su gratitud a Robert Egan por su ayuda en la fabricación de la cámara de flujo. Los autores agradecen a Lucas McCauley por su ayuda durante los experimentos. Además, les gustaría agradecer a las instalaciones centrales del Instituto de Imágenes Químicas de Sistemas Vivos (CILS) de la Universidad Northeastern por permitir el acceso a los microscopios confocal. Los autores agradecen el apoyo financiero proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH 1R01EB027705 otorgado a SB) y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 a SB y CMMI 1846962 a EE).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Hydrogel Fabrication |
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159 | Glass Salinization |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | Immunostaining |
Acetone | Thermo Fisher Scientifics | A18-4 | GelMA Synthesis |
Alexa Fluor 555 Phalloidin | Cell Signaling Technology | 8953S | Immunostaining |
Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | Hydrogel Fabrication |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet (45/64'') | McMaster-CARR | 8560K165 | Flow Chamber Fabrication |
Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 800 | Immunostaining |
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Syringes without Needles | Fisher | 22-031-375 | Flow Experiment |
EC growth kit | American Type Culture Collection (ATCC) | PCS-100-041 | Cell Culture |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2701 | Glass Salinization |
Gelatin Type A (300 bloom) from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | GelMA Synthesis |
Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientifics | 9526-33 | Glass Salinization |
High-Purity High-Temperature Silicone Rubber Sheet | McMaster-Carr | 87315K74 | Flow Chamber Fabrication |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | American Type Culture Collection (ATCC) | PSC-100-010 | Cell Culture |
M3x30mm Machine Screws Hex Socket Round Head Screw 304 Stainless Steel Fasteners Bolts 20pcs | Uxcell | B07Q5RM2TP | Flow Chamber Fabrication |
Masterflex L/S Digital Drive with Easy-Load® 3 Pump Head for Precision Tubing; 115/230 VAC | VWR | #MFLX77921-65 | Flow Experiment |
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft | VWR | #MFLX96419-25 | Flow Experiment |
Methacrylic Anhydride (MAH) | Sigma-Aldrich | 276685 | GelMA Synthesis |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientifics | 043368.9M | Cell Culture |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14080-055 | General |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | GelMA Synthesis |
Sodium Carbonate | Fisher Chemical | S263-500 | GelMA Synthesis |
SOLIDWORKS educational version | |||
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023 | SolidWorks | N/A | Flow Chamber Design |
Vascular Basal Medium | American Type Culture Collection (ATCC) | PCS-100-030 | Cell Culture |
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