A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi

Özet

Programlanmış hücre ölümü testleri gibi DNA laddering veya TUNEL deneyleri, memeli sistemlerinde yaygın olarak kullanılan bitkiler üretmek için zor. GUS muhabiri sistemi ile birlikte, biz, belirli genlerin potansiyel ölüm özelliklerini analiz etmek için hızlı bir şekilde, bitki bazlı geçici tahlil öneriyoruz.

Özet

Biz, aynı anda, hücre ölümünün olası pozitif ya da negatif düzenleyiciler ile muhabir gen, β-glucuronidase (GUS) ifade bir roman geçici bitki ekspresyon sistemi geliştirdik. Bu sistemde, N. benthamiana yaprakları içeren bir analiz edilecek gen 35S tahrik ifade kaset ile birlikte sızmış olan ve GUS vektör pCAMBIA 2301 Agrobacterium gerginlik LBA4404 bir araç olarak kullanarak. GUS ifade canlı hücrelerin oluşması için gerekli olduğundan bu işaretleyici gen, hücre ölümü pozitif düzenleyiciler ile birlikte ifade edilir, GUS aktivite kaybı bekleniyor. Aynı şekilde, anti-apoptotik genlerin vektör kontrol ile karşılaştırıldığında kullanıldığı zaman görülmektedir GUS faaliyet arttı. Aşağıda gösterildiği gibi, başarılı hem de pro-ve anti-ölüm oyuncuları analiz laboratuarımızda bu sistem var. Bunlar gibi BAX hücre ölümü memeli indükleyicileri bilinen anti-apoptotik bitki Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) ailesinin yanı sıra, içerir. Ayrıca, bu proteinlerin muhtemel post-translasyonel değişiklik / etkinleştirme konusunda ipuçları sağlayabilir proteinler içinde belirli kestiği ölüm işlevi, analiz etmek için bu sistemi kullandık. Burada, belirli genlerin ölüm işlevini araştıran bir ilk adım olarak, hızlı ve hassas bir bitki temelli yöntem mevcut.

Protokol

Nicotiana benthamiana tesisleri 25 ° C sıcaklık kontrollü bir büyüme odasında yetiştirilmektedir. 3-6 hafta eski bitkilerin tam genişletilmiş sağlıklı yaprakları kullanılır.

İpucu: yeni gelişmekte olan yaprakları kullanarak daha iyi sonuçlar elde edilir

1. Agrobacterium geçici infiltrasyon protokolü:

1. Gün

1. Agrobacterium tumefaciens (zorlanma LBA4404), hücre ölümü için çalışılmalıdır gen (ler) ve vektör içeren uygun vektörler içeren gliserol stokları ile Streak LB / Rifampisin (25 mg / ml) / Kanamisin (100 mg / ml) agar plaklarına kurucu organizatörü altında GUS kaseti. Daima negatif kontrol olarak boş bir vektör kontrolü içerir.
2. 28 ° C'de 2 gün süreyle inkübe edin.

3. Gün

1. Rifampisin (25 mg / ml) ve Kanamisin (100 mg / ml) içeren LB / Rifampisin / Kanamisin plakası önceden çizgili her LB tek bir koloni ile 2 ml inoküle edin.
2. 28 sallayarak ° C 24 saat boyunca 200 rpm'de maksimum büyüme yoğunluğu ulaşana kadar her kültür inkübe edin.

İpucu: Topaklanma bazen durumda kültürleri iyice ilerlemeden önce (yani, yukarı ve aşağı pipetleme) yeniden süspanse olması gereken görülmektedir.

4. Gün

1. Inkübasyon sonrasında, toplam hacmi 10 ml taze LB (uygun antibiyotik içeren) ve acetosyringone (son konsantrasyon 25 mcM) artırır.
2. 28 ° C'de 16 saat sallayarak her kültür inkübe edin.

5. Gün

1. Ertesi gün oda sıcaklığında 10 dakika için 4000 xg'de 10 ml (acetosyringone katmayan) infiltrasyonu, orta (10 mM _MgSO 4 .7 _H 2 O, 9 mM (MES), pH 5.6) ve santrifüj ekleyerek her kültürün iki kez yıkayın.
2. Son santrifüj adım sonra, 5 ml infiltrasyon orta acetosyringone (100 mcM) içeren her kültürün tekrar süspansiyon haline getirin.
3. OD _600Nm ölçün, 0.1 ve 0.9 arasında ölçüm kabul edilebilir.
   İpucu: OD _600Nm 0,1 gibi düşük bir sorun olmadan kullanılan, ancak daha yüksek ODS daha tutarlı sonuçlar doğurabilir.
4. Enfeksiyon için Agrobacterium kültürleri hazırlamak için 3 saat daha kültürleri inkübe edin.
5. Analiz edilmesi için gen (ler) ve negatif kontrol (Agrobacterium boş vektör içeren) GUS kaset içeren kültürü ile 1:1 oranında karıştırın kültürleri içeren.
6. 1 ml iğne şırınga (Şekil 1) kullanarak yeni ortaya çıkan yapraklar eksen dışı (altında) yan sızmak.
   İpucu: negatif kontrol karışımı (boş vektör + GUS kaset) ve tersi aynı bitki yaprakları üzerinde test edilecek gen (gen x + GUS kaset) içeren karışım Infiltrate. Her tedavi için üç nüsha bitkiler kullanın.
7. Post-infiltrasyon tüketim 3 gün GUS protein ekspresyonu için yaprak test sızmış.

2. Histokimyasal GUS tahlil

8. Gün

1. X-gluc substrat orta eksize yaprakları içine sızmak Vakum.
2. Gece boyunca oda sıcaklığında veya belirgin mavi boyama görünene kadar karanlıkta inkübe edin.

Gün 9

1. Distile su ile durulayın.
2. Klorofil çıkarılana kadar sonra tekrar distile su aktarmak,% 70 etanol içinde inkübe edin. Görme GUS ifade düzeylerini değerlendirmek.

3. Florimetrik MUG tahlil:

8. Gün

1. Sıvı azot kullanarak bir harç sızmış yaprak diskler taşlama ile total protein kesin. GUS ekstraksiyon tamponu 100 uL (50 mM NAPI pH 7.0, 10 mM EDTA,% 0.1 Triton X-100,% 0.1 N-lauroylsarcosine sodyum tuzu, β-mercaptoethanol (0.7 ul / ml) örnek buz tutarken.
2. 4 ° C'de 5 dakika 14.000 gr süspansiyon Santrifüj ve toplam çözünebilir protein olarak supernatant almak.
3. Üreticinin talimatlarına göre bir nanodrop kullanarak konsantrasyon ölçün.
4. GUS ekstraksiyon tamponu kullanılarak her örnek için toplam çözünebilir protein 100 mg protein konsantrasyonu ayarlayın.
5. 2 mM nihai konsantrasyonu GUS ekstraksiyon tamponu hazırlanan MUG substrat (4 methylumbelliferyl-β-D-glukuronid trihidrat) ekleyin. Numune başına 100 mcL (protein + MUG substrat) toplam hacmi yeterli olmalıdır.
6. 37 1 saat için reaksiyonlar inkübe ° C
7. GUS durdurma tamponu (0.2 M Na ₂ CO ₃₎ 800 ul ekleyerek reaksiyonlar durdurun.
8. Dalgaboyu 365 nm ve 455 nm dalga boyu ve emisyon değerleri karşılaştırmak MU bir standart eğri bir floresan bir plaka okuyucu kullanarak ölçün. Nmol MU / mg protein / dak toplam çözünen GUS faaliyet raporu seviyeleri.

4. Hisse senedi ve Çözümleri:

1. Acetosyringone (1 M) stok _{(FW = 196.2 g)} - 0,981 g (5 ml DMSO)
2. Kanamisin (100 mg / ml) stok dH ₂ 0 hazırlamak - sterilize
3. Rifampisin (25 mg / ml) stok hazırlama DMSO
4. Luria-Bertani (LB) sıvı büyüme ortamı: (1L)
   % 1 (w / v) bacto-Tripton, 10 g
   % 0.5 'lik (w / v) bacto-maya özü, 5 g
   170 mM sodyum klorür 10 g
   pH 7
5. Acetosyringone (25 mcM) = 25 ul son hacmi 1 ml 1 M stokunun
6. Sızma Orta: (1L)
   10 mM MgSO ₄ 0,7 dH ₂ 0 _{(FW = 246,48 g),} 2,4648 g
   9 mM MES _{(FW = 213,25 g),} 1,91925 g
   pH - 5.6
7. Acetosyringone (100 mcM) = 100 ul son hacmi 1 ml 1M stokunun
8. Gus Ekstraksiyon Tampon
   50 mM NAPI pH 7.0, 10 mM EDTA,% 0.1 Triton X-100,% 0.1 N-lauroylsarcosine sodyum tuzu, β-mercaptoethanol (0.7 ul / ml)
9. 2x Fosfat tampon
   0,2 M NaH ₂ PO ₄ ve 0.2 M Na ₂ HPO ₄ pH 7
10. X-Gluc substrat çözeltisi
    1 mg çözülür 5-bromo-4-kloro-3-indolyl 0.1 ml metanol BD-glukuronid (X-Gluc). 1 ml 2x fosfat tamponu, ferrisiyanür 20 ul 0.1M potasyum, 10μl Triton X-100% 10 ve 850 ul distile su ekleyin.

5. Temsilcisi sonuçları:

Hücre ölümü oluştuğunda, bu protokol sonrasında GUS ifade kaybı bekleniyor. Biz aynı anda sito koruyucu Arabidopsis Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) ailesinin bir üyesi ile β-glucuronidase muhabiri gen (GUS) ifade etmişlerdir . Biz co-sızmış N. benthamiana Agrobacterium suşu LBA4404 kullanarak 35S tahrik BAG ifade kaset ve GUS vektör pCAMBIA 2301 ile bırakır. Şekil 2'de görüldüğü gibi bu infiltrasyon, GUS boyama gözle görülür bir artış gözlenmiştir. Tersine, Bcl-2 ailesinin bilinen pro-apoptotik üyesi BAX iken, (Şekil 2) GUS boyama belirgin bir azalma gözlendi. Hem de bu gibi durumlarda, GUS ifade kontrol ile karşılaştırıldığında gözle görülür şekilde farklı oldu. Ancak, ifade arasındaki fark daha az belirgindir, florometrik MUG deneyleri GUS ifade quanitate gerçekleştirilen olabilir.

Şekil 1. Örnek N. eksen dışı tarafında Agrobacterium karışımı infiltrasyon benthamiana 1 ml iğne şırınga kullanarak bırakır.

Şekil 2. GUS vektör N. birlikte ifade edilmiştir. benthamiana anti-ölüm gen ve hücre ölümüne bilinen bir indükleyicisi ile bırakır. GUS düzeyleri, boş bir vektör kontrolü (GUS kontrol) karşılaştırıldı.

Tartışmalar

Memeli sistemlerinde yaygın bitki hücre ölümü algılama teknikleri kullanmak genellikle zordur. GUS muhabiri sistemi ile birlikte, hücre ölümü oyuncuların tespiti ve analizi için bir bitki esaslı, duyarlı bir yöntem mevcut. Bu yöntem, canlı hücreler oluşmaya GUS ifade için gerekli olan basit gerçeği yararlanır. Anlamlı sonuçlar ve tekrarlanabilirliği sağlamak için, GUS kaset ve test edilmelidir geni barındıran kültürlerin eşit oranlarda sızmış olması büyük önem taşır. Bu oranl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Rifampisin	VWR	IC19549001	DMSO içinde 25mg/mL stok
4'-hidroksi-3 ', 5'-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone)	VWR	TCD2666	DMSO 0,981 g / ml (1M stok)
2 - (4-morfolino) ethanesulfonic asit monohidrat (MES)	VWR	EM-6110	1.92 g / L 1 L infiltrasyon medya yapmak için su
Bacto-Tripton	Balıkçı	BP1421-2	10g / L 1 L LB orta yapmak için su
Bacto-maya özü	VWR	EM1.03753.0500	5g / L su 1 L LB orta yapmak için
Sodyum klorür	VWR	EM-7710	10g / L 1 L LB orta yapmak için su
Sodyum fosfat tekbazlı monohidrat	VWR	MK-7868-12	2.5g / L 50mm tampon NAPI yapmak için su
Sodyum fosfat dibazik heptahidrat	VWR	EMD-SX0715-1	5g / L su 50mm tampon NAPI yapmak için
Magnezyum sülfat heptahidrat	VWR	EM-MX0070-1	2.5 g / L 1 L infiltrasyon medya yapmak için su
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	% 0.1 GUS tampon v / v
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glukuronid cyclohexylammonium tuz (X-gluc)	Altın Biyoteknoloji	G1281C	1mg/100uL içinde metanol% 100
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glukuronid hidrat (MUG)	Sigma	M5664	GUS ekstraksiyon tampon 100 uL 2 mM
Potasyum ferrosiyanat trihidrat	VWR	EM-PX1460-1	X-gluc substrat çözümü için 100 mM stok
β-Methylumbelliferone (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	MU standart eğri kullanımı GUS ekstraksiyon tamponu için
Çamaşır sodası	VWR	EM-SX0395-11	GUS durdurmak tampon için su 0.2 M