A β-glucuronidase (GUS) Ensaio Baseado Morte celular

Resumo

Ensaios de morte celular programada comumente usado em sistemas de mamíferos, tais como DNA laddering ou ensaios de TUNEL, muitas vezes são difíceis de reproduzir em plantas. Em combinação com um sistema de repórter GUS, propomos uma rápida, planta ensaio baseado transitória para analisar as propriedades morte potencial de genes específicos.

Resumo

Nós desenvolvemos um sistema de expressão transiente romance planta que ao mesmo tempo expressa o gene repórter, β-glucuronidase (GUS), com supostos reguladores positivos ou negativos de morte celular. Neste sistema, N. deixa benthamiana são co-infiltradas com uma cassete de expressão 35S impulsionado contendo o gene a ser analisado, eo GUS vector pCAMBIA 2301 usando Agrobacterium LBA4404 tensão como um veículo. Porque as células vivas são necessários para a expressão GUS a ocorrer, a perda da atividade GUS é esperada quando este gene marcador é co-expressa com os reguladores positivos da morte celular. Igualmente, o aumento da atividade GUS é observada quando anti-apoptóticos genes são usados ​​em comparação com o controle de vetores. Como mostrado abaixo, temos utilizado com sucesso este sistema em nosso laboratório para analisar os dois jogadores pró e anti-morte. Estes incluem a planta anti-apoptótico Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) da família, bem como, conhecidos indutores de morte celular de mamíferos, como BAX. Além disso, temos utilizado este sistema para analisar a função da morte de truncamentos específicos dentro de proteínas, o que poderia fornecer pistas sobre a modificação pós-translacional possível / ativação destas proteínas. Aqui, apresentamos um método rápido e sensível de plantas com base, como um passo inicial na investigação da morte de função de genes específicos.

Protocolo

Nicotiana benthamiana plantas são cultivadas em câmara de crescimento com temperatura controlada a 25 ° C. Totalmente expandido folhas saudáveis ​​de 3-6 semanas de idade as plantas são utilizadas.

Dica: Melhores resultados são obtidos usando as folhas emergentes

1. Agrobacterium protocolo de infiltração transitória:

1 dia

1. LB raia / rifampicina (25 mg / ml) / canamicina (100 mg / ml) placas de agar com ações de glicerol de Agrobacterium tumefaciens (estirpe LBA4404) contendo os vetores apropriados com o gene (s) a ser testada para a morte celular eo vetor contendo a cassete GUS sob um promotor constitutivo. Sempre incluir um controle do vetor vazio como controle negativo.
2. Incubar a 28 ° C por 2 dias.

Dia 3

1. Inocular 2 ml de LB contendo rifampicina (25 mg / ml) e canamicina (100 mg / ml), com uma única colônia de cada LB / rifampicina / canamicina placa previamente riscado.
2. Incubar cada cultura por agitação a 28 ° C durante 24 horas a 200 rpm até a densidade máxima de crescimento é atingida.

Dica: A aglomeração é por vezes observada, caso em que as culturas precisam ser cuidadosamente ressuspendido (ou seja, pipetando para cima e para baixo) antes de prosseguir.

Dia 4

1. Após a incubação, aumentar o volume total de 10 mL com LB fresco (contendo os antibióticos apropriados) e acetosyringone (final de concentração 25 mM).
2. Incubar cada cultura por agitação a 28 ° C por mais 16 hrs.

Dia 5

1. No dia seguinte, lave duas vezes cada cultura pela adição de 10 ml (não adicionar acetosyringone) médio de infiltração (10 mM MgSO ₄ .7 H ₂ O, 9 mM MES, pH 5,6) e centrifugar a 4000 xg por 10 min em temperatura ambiente.
2. Após a etapa de centrifugação final, ressuspender cada cultura em 5 ml contendo meio de infiltração acetosyringone (100 mM).
3. Medir a _600nm OD, medidas entre 0,1 e 0,9 são aceitáveis.
   Dica: OD _600nm de tão baixo quanto 0,1 têm sido usados ​​sem problema, no entanto, maior ODs pode produzir resultados mais consistentes.
4. Incubar as culturas de mais 3 horas para preparar as culturas Agrobacterium para a infecção.
5. Mix culturas contendo o gene (s) para ser analisado e do controle negativo (Agrobacterium contendo o vetor vazio) na proporção de 1:1 com a cultura contendo o cassete de GUS.
6. Infiltrar-se na lateral (sob) abaxial de folhas emergentes recém usando uma agulha de 1 ml menos seringa (Fig. 1).
   Dica: Infiltrate tanto a mistura de controle negativo (vetor vazio + cassete GUS) ea mistura contendo o gene a ser testada (gene x + cassete GUS) em folhas opostas da mesma planta. Use plantas em triplicado para cada tratamento.
7. Três dias pós-consumo infiltração infiltrado folhas e ensaio para a expressão da proteína GUS.

2. Ensaio histoquímico GUS

Dia 8

1. Vácuo se infiltrar no meio do substrato X-glic nas folhas excisadas.
2. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante a noite ou até coloração azul aparece distintas.

Dia 9

1. Enxágüe em água destilada.
2. Incubar em etanol 70% até a clorofila é removido, então a transferência para água destilada novamente. Visualmente avaliar os níveis de expressão GUS.

3. MUG ensaio fluorimétrico:

Dia 8

1. Isolar proteína total por trituração discos de folhas infiltradas em um almofariz com nitrogênio líquido. Adicione 100 uL de tampão de extração GUS (50 mM pH 7,0 NAPI, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine sal de sódio, β-mercaptoetanol (0,7 mL / ml), mantendo a amostra em gelo.
2. Centrifugar a 14.000 g de suspensão por 5 min a 4 ° C e tomar sobrenadante como proteína solúvel total.
3. Medir a concentração usando um nanodrop de acordo com instruções do fabricante.
4. Ajustar a concentração de proteína e 100 mg de proteína solúvel total para cada amostra usando GUS tampão de extração.
5. Adicionar substrato MUG (4-metil-β-D-glicuronídeo hidratado) preparado em GUS tampão de extração para uma concentração final de 2 mM. Um volume total de 100 mL por amostra (proteína + substrato MUG) deve ser suficiente.
6. Incubar as reações de 1 hora a 37 ° C.
7. Parar reações adicionando 800 mL de GUS batente do amortecedor (0,2 M Na ₂ CO _3).
8. Medida de fluorescência usando um leitor de placas em um comprimento de onda de excitação de 365 nm e comprimento de onda de emissão de 455 nm e comparar os valores de uma curva padrão de MU. Níveis relatório de actividades do GUS como nmol total de MU / mg proteína solúvel / min.

4. Ações e Soluções:

1. Acetosyringone (1 M) de estoque _{(FW = 196,2 g)} - 0,981 g em 5 mL de DMSO
2. Canamicina (100 mg / ml) de ações - preparar em dH ₂ 0 - filtro de esterilizar
3. Rifampicina (25 mg / ml) de ações - preparar em DMSO
4. Luria-Bertani (LB) líquido meios de cultura: (1L)
   1% (w / v) Bacto-triptona, 10 g
   0,5% (w / v) extrato de levedura-Bacto, 5 g
   170 mM cloreto de sódio 10 g
   pH - 7
5. Acetosyringone (25 mM) = 25 mL de um estoque M 1 em um volume final de 1 ml
6. Médias de infiltração: (1L)
   10 mM MgSO ₄ 0,7 dH ₂ 0 _{(FW = 246,48 g),} 2,4648 g
   9 mM MES _{(PF = 213,25 g),} 1,91925 g
   pH - 5.6
7. Acetosyringone (100 M) = 100 mL de um estoque 1M em um volume final de 1 ml
8. GUS Extração de buffer
   50 mM NAPI pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine sal de sódio, β-mercaptoetanol (0,7 mL / ml)
9. 2x tampão fosfato
   0.2M NaH ₂ PO ₄ e 0,2 M Na ₂ HPO ₄ pH 7
10. X-Glic solução de substrato
    Dissolver 1 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil bD-glicuronídeo (X-Glic) em 0,1 ml de metanol. Adicionar 1 ml de tampão fosfato 2x, 20 de potássio 0,1 M mL de ferricianeto, 10μl Triton X-100 10% e 850 mL de água destilada.

5. Resultados representativos:

Na sequência deste protocolo, perda de expressão GUS é esperada quando ocorre a morte celular. Temos, simultaneamente, expressa o gene repórter, β-glucuronidase (GUS) com um membro da Arabidopsis cito-protetora Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) da família. Nós co-infiltradas N. benthamiana folhas com um cassete de expressão impulsionado BAG 35S eo GUS vector pCAMBIA 2301 usando Agrobacterium LBA4404 tensão. Como mostrado na figura 2, um aumento visível de coloração GUS foi observada após essa infiltração. Inversamente, quando o conhecido membro pró-apoptótico da família Bcl-2 BAX foi usado, uma redução acentuada de coloração GUS foi observada (Fig. 2). Em ambos os casos, a expressão de GUS foi visivelmente diferente se comparado ao controle. No entanto, quando a diferença de expressão é menos evidente, ensaios MUG fluorimétricos pode ser realizada para quanitate expressão GUS.

Figura 1. Exemplo de Agrobacterium infiltração mistura do lado abaxial de N. benthamiana folhas usando uma seringa de 1 ml com agulha menor.

Figura 2. Um vetor GUS foi co-expresso em N. benthamiana folhas com o gene anti-morte, e um conhecido indutor de morte celular. Níveis de GUS foram comparados com um controle do vetor vazio (GUS controle).

Discussão

Muitas vezes, é difícil de usar técnicas de detecção de células morte em plantas que são comuns em sistemas de mamíferos. Em combinação com um sistema de repórter GUS, apresentamos uma planta de método, com base sensível para a detecção e análise de jogadores morte celular. Este método aproveita o simples fato de que as células vivas são necessários para o GUS expressão a ocorrer. Para garantir resultados significativos e repetibilidade, é fundamental que as culturas abrigar a cassete GUS eo gen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Rifampicina	VWR	IC19549001	25mg/ml estoque em DMSO
4'-hidroxi-3 ', 5'-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone)	VWR	TCD2666	0,981 g / mL em DMSO (1M estoque)
Monohidrato do ácido (4-morfolino) ethanesulfonic (MES) - 2	VWR	EM-6110	1,92 g / L na água para fazer um L de mídia infiltração
Bacto-triptona	Pescador	BP1421-2	10g / L na água para fazer 1 L de meio LB
Bacto levedura-extrato de	VWR	EM1.03753.0500	5g / L na água para fazer 1 L de meio LB
Cloreto de sódio	VWR	EM-7710	10g / L na água para fazer 1 L de meio LB
Fosfato de sódio monobásico	VWR	MK-7868-12	2,5 g / L em água para fazer 50mM de tampão NAPI
Fosfato de sódio dibásico hepta	VWR	EMD-SX0715-1	5g / L na água para fazer 50mM de tampão NAPI
Sulfato de magnésio hepta-hidratado	VWR	EM-MX0070-1	2,5 g / L na água para fazer um L de mídia infiltração
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	0,1% v / v em tampão GUS
5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glicuronídeo sal cyclohexylammonium (X-glic)	Biotecnologia ouro	G1281C	1mg/100uL em metanol 100%
4-metil-D-μ-glicuronídeo hidratado (MUG)	Sigma	M5664	2 mM em 100 uL de tampão de extração GUS
Trihidrato de ferrocianeto de potássio	VWR	EM-PX1460-1	Ações 100mM para X-glic solução de substrato
β-Methylumbelliferone (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	Para a curva MU tampão uso padrão de extração GUS
Carbonato de sódio	VWR	EM-SX0395-11	0,2 M em água para fazer GUS tampão parar