Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

Özet

Bir protokol unilateral 6-OHDA lezyonlar, farelerde medyal önbeyin demet gerçekleştirmek için tarif edilmektedir. Bu yöntem, striatal dopamin ve 90,63>% 95 kaybı gösteren hayatta kalan hayvanların% 89 ile düşük mortalite oranı (% 13.3) ±% -4,02, lezyonun tarafa doğru ipsiversive dönme önyargı vardır.

Özet

Bu özetlediği bazal ganglionlar devresi değişiklikleri ve farmakoloji olarak gözlenen bu yana tek taraflı olarak lezyonlanmıştır 6 hyroxydopamine (6-OHDA)-lezyonlanan Parkinson hastalığı sıçan modeli (PD), parkinson belirtileri altında yatan mekanizmaları anlayışımıza ilerlemede paha biçilmez olmak için ispat etti Parkinsonlu hastalarda ^1-4. Bununla birlikte,, çıkış yollarının, başlıca, bazal ganglia bir giriş bölgesi olan striatum, dahilinde kortiko-striatal sinapsların oluşan hassas hücresel ve moleküler değişiklik zor kalır, ve bu patolojik anormallikleri parkinson arazlarının yatan ³ ortaya çıkan sitenin olduğuna inanılmaktadır ^5.

PD, bazal ganglion devresi-striatal Nigro yolunun aşağıdaki dejenerasyon değişikliklerin altında yatan mekanizmaları anlamak, büyük ölçüde teşvik tarafından yönlendirilen aşırı eksprese yeşil floresan proteinleri gelişimi bakteriyel yapay kromozom (BAC) fareler tarafından ileri olmuşturrs özel izolasyon çalışılması gerekir izin vererek ^8:; iki striatal çıkış yolları (EGFP-D2 ve EGFP-A2a dolaylı yolun EGFP-D1 doğrudan yolak). Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda, parkinson fareler ^9,10 sinaptik plastisite patolojik değişiklikler olduğunu ileri sürmüşlerdir. Ancak, bu çalışmalar yavru fareler ve parkinsonizm akut modelleri kullandı. 6-OHDA stabil lezyonlar ile erişkin sıçanlarda açıklanan değişimler de bu modellerde oluşup oluşmadığına belirsizdir. Diğer gruplar medial ön beyin demeti (MFB) lezyon PD tek taraflı lezyonlanan istikrarlı bir 6-OHDA yetişkin fare modeli oluşturmak için çalıştılar, ne yazık ki, bu çalışmada mortalite oranı sadece 14% 21 cerrahi kalan, son derece yüksek oldu gün veya daha uzun ^11. Daha yeni çalışmalarda, düşük bir mortalite oranı ile intra-nigral lezyonlar dopaminerjik nöronlar>% 80 kaybı, L-DOPA bağlı diskinezi ^11,12,13,14 Ancak ifade değişkenBu çalışmalar. , PD iyi kurulmuş bir başka fare modeli, MPTP-lezyonlanan fare ^15. Iken, bu model potansiyel nöroprotektif ajanların ¹⁶ değerlendirme yararlı olan bu modeli genellikle motor açıklarının neden başarısız, PD belirtileri altında yatan mekanizmaları anlamak için daha uygun ve geniş bir lezyon ^{17, 18} ölçüde değişkenlik gösterir .

Burada içine doğrudan 6-OHDA, uygulama tarafından, tutarlı>% 95 striatal dopamin kaybı (gibi HPLC ile ölçülen) yanı sıra, davranışsal üreten neden MFB, stabil bir PD unilateral 6-OHDA-lezyonlu fare modelinde geliştirilmiştir. dengesizliklerin PD iyi karakterize tek taraflı 6-OHDA-lezyonlanan sıçan modelinde gözlendi. PD Bu yeni geliştirilen bir fare modelinde, parkinson arazlarının nesil altında yatan mekanizmaları anlamak için değerli bir araç ispat edecektir.

Protokol

1. Konut ve fareler hazırlanması

1. Transgenik fareler tahrik ⁸ (gıda ve suya ücretsiz erişim ile 12:12 saat aydınlık-karanlık döngüsü Mutant Fare Bölgesel Kaynak Merkezi (MMRRC) FVB bakteriyel yapay kromozom (BAC) bir koloni koruyun. Bu fareler, saf FVB fare ve amaçlı ıslah için, ya başka herhangi bir zorlanma ile bu farelerin geçmek için gerekli değildir, ya da 6-OHDA lezyon prosedürün başarı sağlamak için.
2. Parkinson bir model oluşturmak için, doğum sonrası gün 31-42 yaş arası erişkin farelerde (P31-42) 6-OHDA lezyon ve sahte ameliyatları için gereklidir.
3. Enfeksiyon riskini azaltmak için, ameliyat öncesi 24 saat boyunca içme suyu Baytril (antibiyotik) yönetmek.

2. , Cerrahi için ilaçların hazırlanması

Bir premedication, desipramin ve iLM parglin (6-OHDA)-6-hidroksidopamin enjeksiyon, genellikle seçicilik ve eff arttırmak için fareleri önce uygulandığında6-OHDA-endüklenen lezyonları icacy. Noradrenalin, 5HT / kavrama inhibitörü, desipramin azalır, 6-OHDA-endüklenen noradrenalin ve, 5HT tükenmesi ²² iLM parglin monoamin oksidaz inhibitörünün, halbuki, 6-hidroksidopamin ³¹ extrasynaptic dağılımı azaltarak,, dopaminerjik terminallerinin 6-OHDA duyarlılığı artırır.

1. (, Desipramin hidroklorür (HCI), ve iLM parglin HCl) premedication büyük miktarlar yapılmış ve ° C -80 azından kullanılıncaya kadar muhafaza edilebilir. , Desipramin HCl uygun miktarda fare her biri 25 mg / kg hayvan sayısı O gün cerrahisi alacak tedarik tartılır. , Düşük ağırlık, fare doğru küçük hacimli sağlamak için zorlaştırır;, desipramin hidroklorür hazırlamak ve dolayısıyla, 2.5 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda 10 ml / kg hayvan uygulanmıştır. , Doğru konsantrasyon elde edilmektedir ki, örneğin bileşik, tuz bileşeni ağırlığı dikkate alınması gerekir. Ağırlığı için düzeltmeHCl tuzu hidroklorür desipramin:, desipramin HCl Molekül ağırlığı (MW): 302,84 MW HCl: 36,46 MW, serbest baz: 266,38 düzeltme faktörü: 302,84 / 266,38 = 1,137 10 ml çözelti için: = 2.5mg/ml desipramin x 10.0ml x Düzeltme faktörü = 2.5mg/ml x 10.0ml x 1,137 desipramin hidroklorür = 28.43mg
2. O gün cerrahi alan hayvanların sayısı için 5mg/kg her fare tedarik için iLM parglin HCl uygun miktarda tartılır. Düzeltiniz tuzu bileşeni için yukarıda açıklandığı gibi bileşik. Fare, düşük ağırlık, doğru küçük hacimli sağlamak için zorlaştırır; Bu nedenle, 0.5 mg / ml arasında bir konsantrasyonda iLM parglin hidroklorür ve 10 ml / kg hayvan yönetmek hazırlamak.
   Düzeltmek, iLM parglin hidroklorür HCl tuzu ağırlık:
   ILM parglin HCl MW: 195,69 MW HCl: 36,46
   Serbest baz MW: 159,23 düzeltme faktörü: 195,69 / 159,23 = 1.229
   10 ml çözelti tartmak için:
   = 0.5 mg / ml iLM parglin x 10,0 ml x düzeltme faktörü
   = 0.5 mg / ml x 10,0 ml x 1,229
   = ILM parglin hidroklorür 6.15mg
3. Kombine 28.43mg desipramin HCl ve 6.15mg iLM parglin HCI 10 ml cam içine dereceli silindir ve 8 ml steril serum fizyolojik (% 0.9) ekleyin. Vorteks karışım, 45 ° C ye kadar eritildi ve ısı. , Çözeltinin pH farelere uygulandığında, üriner ve gastrointestinal sistem fonksiyonu ile ilgili rahatsızlık ve post-operatif komplikasyonlar neden olacak, 3 civarında olması. NaOH (1 M) damla pH 7.4 olana kadar. Steril serum fizyolojik (% 0.9), ve vorteks ile 10ml hacmi kontör. ~ 80 ° C Etiket, tarih ve donma ILM parglin HCl oda sıcaklığında tuzlu su içinde çözünür olmadığı göz önüne alındığında, cerrahi süresince, ameliyathanede 37 ° C ısıtılmış su banyosunda premedikasyon karışımı saklamak.
4. 6-OHDA Çözümleri ameliyatlara hemen önce hazırlanması gerekir. 6-OHDA hidrobromid (6 eritmek için kullanılan araç-OHDA.Br) çözeltisi steril salin solüsyonu içeren askorbik asit (% 0.2) (% 0.9). Askorbik asit, inaktif biçimin bir oksidasyon 6-OHDA.Br, önler olarak stabilize etmek için 6-OHDA.Br, ihtiyaç duyulmaktadır. Sonra boş bir 1 L, 0.2 g askorbik asit tartılır mezun silindir, 1 L (% 0.9) kadar steril serum fizyolojik ile üst ve karıştırın. ~ 80 Etiket, gerekli ° C ye kadar tarih, ve mağaza.
5. 3.0 mikrogram ile her fare sağlamak için 15.0 mg / ml solüsyon yapmak için 6-OHDA.HBr, uygun miktarda tartılır. 6-OHDA.Br ısı ve ışık olduğundan hassas tartım önce buz üzerinde ışık, yer ve maruz kalmaktan kaçınmalıdırlar.
   6-OHDA.HBr düzeltmek, HBr tuzu ağırlığı:
   MW: 6-OHDA.HBr, 250,09 MW HBr: serbest baz 79.9 MW: 170,19
   Düzeltme faktörü: 250,09 / 170,19 = 1,47
   0.5 ml çözelti tartmak için:
   6-OHDA = 15.0 mg / ml x 0.5 ml x düzeltme faktörü
   = 15.0 mg / ml, 6-OHDA x 0.5 ml x 1,47
   = 11,03 mg 6-OHDA.HBr,
6. 6-OHDA.HBr alüminyum folyo ile kaplı steril bir 1.0 ml tüp içine tartılır ve 0.5 ml araç (steril serum fizyolojik (% 0.9), askorbik asit,% 0.02, pH 7.4) ekleyin. Vorteks karışım eriyene kadar, etiket ve kullanılıncaya kadar buz üzerinde hemen yer. 6-OHDA çözüm hazırlandıktan sonra yaklaşık 6 saat içinde kullanılması gerektiğini unutmayın. Çözüm hazırlanmasından sonra doğrudan doğruya, ya da cerrahi esnasında ya koyu kahverengi dönerse, 6-OHDA.HBr yükseltgenir haline gelmiştir gösterir, ve artık etkili bir nörotoksinlerden, böylece atılır ve tekrar hazırlanabilir.
7. Sham opere edilen hayvanlar için, eşdeğer bir araç hacmi (steril serum fizyolojik (% 0.9), askorbik asit,% 0.02, pH 7.4) 6-OHDA-lezyonlanan hayvanları alacak olan makyaj ve sarılmış bir 1.0 ml steril tüp içinde yer kullanılıncaya kadar buz üzerinde hemen kalay folyo, etiket ve yerinde.

3. Cerrahi cihazı kurma

Cerrahi aletler otoklav önce t kullanılarak sterilize edilmelidiro ameliyat. ° C'de 2 dakika süreyle her operasyon arasında, cerrahi araçları, 250 ila ısıtma izledi% 95 etanol içinde sterilize gerekir. Tüm deneyler bağlı kurum ve ülkenin uygun Hayvan Bakım Komiteleri kurallarına uygun olarak yapılmalıdır.

1. Önce donatım ayarlama izopropil alkol ile tüm yüzeyler ve araçları temizleyiniz. Temiz cerrahi teçhizat işlerken steril eldiven giyin.
2. Set-up kaide üzerine kağıt havlu ile bir fare kurtarma kafesi. Bir ısıtma lambası altında veya ısıtılmış bir yastık üstüne yerleştirin.
3. Bağlı oksijen girişi ve açık, ve izofluran rezervuar tamamen dolu olduğunu sağlayarak, anestezi arabası ayarlayın. 1 L / dk ve% 2-4 izofluran için oksijen akışını ayarlayın. İdeal olarak, endüksiyonlu bir odacık, oksijen isoflurane karışım, teslim süre hayvan stereotaksik çerçeve içinde olduğu gibi, bakım için iki çıkışının portlar anestezik makine olacaktır.
4. Correct infüzyon cihazları montaj, başarılı lezyonlar sağlanması için kritik sıkışmış hava veya bloke iğne olarak lezyon yerinde infüze 6-OHDA alçaltır. Şekil 1'de gösterildiği gibi infüzyon cihazı takılacak. Konu bir RN somun, PEEK boru bir yüzüne (RN sıkıştırma kiti (uydurma, 1/16 ^th inç)), sonra:, PEEK fincan Ferrül, kanonik PFA halka izledi. Orient yüksükler, kanonik PFA Ferrül üzerinde koni,, PEEK fincan ferrülün çiftleşme parçası haline kayacak. Bağlantı sağlayan çift küçük hub RN coupler (# 1) yerleştirin sıkı. Çift küçük hub RN coupler Diğer taraftan 33 gauge enjeksiyon iğnesi takın. İğneyi RN metal fındık ve sıkın biri aracılığıyla. 33 iğne bir çift küçük hub RN coupler (# 1) 180 ° 'lik açıyla olduğundan emin olun. , PEEK boru, iplik, bir PEEK Ferrül tarafından takip RN metal fındık bir diğer ucunda, sonra PFA yüksük. Metal bir somun takınnd ikinci bir çift küçük hub RN coupler içine montaj yüksük ve bağlantı sıkın. Ikinci bir küçük çift RN hub coupler (# 2) Diğer taraftan küçük bir hub RN adaptörü (Luer adaptörü) luer yerleştirin ve bağlantı sıkın.
5. Sonraki infüzyon cihazları (bkz. Şekil 1) astarlanmalıdır. Hava kabarcıkları vardır sağlanması, 250 ul ve 1.0 ml Hamilton şırınga steril su ile doldurun. 250 ul şırınga luer adaptörü takın ve Hortumun diğer ucunu 33 gauge enjeksiyon iğnesi ile su serbest olduğu gibi 250 ml şırınga pistonu bastırın. , Luer adaptörü ucunda küçük bir su boncuk bırakarak,, luer adaptör 250 ml şırınga çekerken sistemi aracılığıyla su itici devam edin. Küçük bir su boncuk çıkarılıncaya kadar 1.0 ml şırınga pistonu basınız. Luer adaptörü dikkatlice içine 1.0 ml şırınga eklemek, 1.0 ml şırınga boncuk su su boncuk mevcut o bağlandığından emin olun.n döner adaptör ve tamamen, luer adaptör içine 1.0 ml şırınga takın. Küçük çift RN hub coupler hiçbir kabarcıklar olun.
6. Şimdi sistemi dolana olduğunu, perfüzyon cihazları, stereotaksik çerçeve ve infüzyon pompası güvence altına alınabilir. Stereotaksik çerçeve manipülatör kolunun bağlı 33 ölçer enjeksiyon iğnesi ile küçük çift RN hub coupler Kelepçe, perfüzyon pompası perfüzyon pompası başladığında şırınga kelepçe karşı bastırdı. Olduğu gibi 1.0 ml şırınga kelepçe ve olamaz hareket ettirin. Programı bir infüzyon hızı 0.1 ul / dk infüzyon pompası izin.

4. Tek taraflı 6-OHDA lezyon cerrahisi

1. Otuz dakika önce işlemleri, her hayvan tartmak ve ağırlığı kaydetmek. Sistemik bir fare, 10 ml / kg (ip), periton-içi enjeksiyon, desipramin hidroklorür (2.5 mg / ml, Sigma Aldrich) ve iLM parglin hidroklorür (0.5 mg / ml, Sigma Aldrich) (% 0.9, steril salin, pH 7.4) yönetmek1 ml bir şınngaya bağlanmış bir 27g iğne kullanılarak. Örneğin, bir 30.0 g fare 300 ul premedikasyonunun alacaktır. Isıtma disk Isınma ve kulak ve kesici bar altında yerleştirin. Isıtma disk cerrahisi sırasında hayvanın ısısını korumak ve, stereotaksik çerçeve kulak ve kesici barlar sığdırmak için ideal yükseklikte hayvan tutmaya yardımcı olacaktır.
2. Onbeş dakika uygulamayı takiben, desipramin HCI ve iLM parglin HCl çözeltisi ile, kapalı bir anestezi odacık içinde fare yerleştirmek, ve inhalasyon (, Ç ₂ içinde% 2-3) kullanılarak hayvan anesthetise. Arka bacak tutam ve herhangi bir göz kırpma refleksi hiçbir tepki gösterdiğinde hayvan yeterince Narkoz.
3. , Farenin kafasını üst Tıraş ve pamuk kullanarak cilde doğrudan lidokain topikal analjezik uygulamak. Lidokain uygulamasını takip eden beş dakika,, betadin çözüm hayvan başı sterilize edin.
4. Steryotaksik bir çerçeve, farelerde için uyarlanmış bir hayvan yerleştirin.. Hayvanın yüzünde yerleştirilmiş anestezi maskesi ile kesici bar (-3.0 +2.0 mm kesici çubuk ayarını): Öncelikle hayvan yerleştirin. 1 L / dk ve% 1.5-2 izofluran için oksijen akışını ayarlayın. Kesici bar kafatasının üst düzey olduğu gibi kulak kepçesi göreli bir seviyede olmalıdır. Kulaklıklar takın (çapı 5.0 mm). Kulak kepçesi, kafası tamamen düz olduğu zaman doğru takıldığından edilmiştir ve her iki yönde de hareket edilemez.
5. Bir neşter bıçak kullanarak fare başının üstündeki derinin orta hat boyunca kesin ve deri geri çekmek. Gazlı bez kullanarak kafatası yüzeyi kurulayın.
6. 1.0 ml şırınga pistonu aşağı doğru itin ve 6-OHDA solüsyonu (15 mg / ml) içeren kalay folyo kaplı 1 ml tüp içine 33 gauge enjeksiyon iğnesi yerleştirin. 6-OHDA solüsyonu (15 mg / ml) batırılır 33 gauge enjeksiyon iğnesi tutarak 1.0 ml şırınga pistonu yavaşça geri çekin.
7. Orta boyunca 1 cm'lik kesi oluşturmakafatasının hattı. Advance bregma yönelik bir iğne ucu, 6-OHDA çözeltisi oluşturmak için küçük bir boncuk ölçer 33 enjeksiyon iğne küçük bir miktarını dağıtın. Yavaşça bregma, boncuk dokunuşlar bregma iğne ucu ilerleyen durdurmak ve bu koordinatları kaydederken. Enjeksiyon iğne ucu indirin Bir iğne 2 dorsal yönde mm rostral kaudal yönde lambda doğru sagital dikiş boyunca hareket ve geri çekin. 6-OHDA çözeltisi oluşturmak için küçük bir boncuk ölçer 33 enjeksiyon iğne küçük bir miktarını Advance. Lambda, boncuk kişileri Lambda iğne ucu ilerleyen bu koordinatları durdurmak ve kaydetmek için enjeksiyon iğne ucu yavaş yavaş azaltın. Değilse (ML) lateral medial ve dorsal ventral (DV) koordinatları, bregma ile lambda için aynı olmalı, AP koordinatları, ve ML koordinatları için kulak çubukları için uygun kesici çubuğu ayarlamak. -1.2 Mm, ML: -1.1 mm breg için göreli iğne taşıma AP co-koordine²⁵ Koordinatlar Stereotaksik Fare Beyin Atlas göre ma. Iğne geri çekin ve çapak 25 gauge iğne kullanılarak kafatası içine bir delik.
8. Yukarıda koordinatları enjeksiyon iğnesi dönün ve DV iğneyi:-5mm. 6-OHDA veya araç ul 0.2 0.1 ul / dk (3 mikrogram toplam) oranında tek taraflı olarak median ön beyin demeti içine süzülür. 6-OHDA veya aracın idare tamamlanmasından sonra, iğne, difüzyon enjeksiyon bölgesinden uzağa izin vermek üzere beş dakika için daha fazla yer bırakır.
9. Iğne yavaşça geri çekin.
10. Üç sütürler kullanılarak saç derisine insizyon kapatın ve subkutan (sc) 1 ml Ringer çözüm sunmak.
11. Stereotaksik çerçeve ve yerine kurtarma kafesi bilinç sağlanıncaya kadar hayvan çıkarın.

5.. 6-OHDA-lezyonlanan hayvanların post-operatif bakım

1. Place kafeslerde hayvanlar (3 fare / kafes) ve gıda ve sugare için ücretsiz erişime izind, su (10 mM). Nutra-jel ve KMR (yavru süt değiştirme), iştah kaybı ve gastrointestinal motilite teşvik etmek için kafesin katta gıda kapları sağlayın.
2. Ameliyat sonrası 2 hafta ²⁴ günlük fareler kontrol edin. Her muayene kafes çevresinde hareket hayvan yeteneğini değerlendirmek özel ilgi hayvan uyanıklığı dikkat edilmelidir. Yiyecek ve su emme son gözlem süresi gibi varlığında ve dışkı tutarlılık, ayrıca dikkate alınmalıdır. Ortak bir post-operatif komplikasyon cilt cilt tutam yavaş retraksiyonu açıktır dehidratasyon. Bu gözlenmesi durumunda 1 hafta için 1 ml Ringer solüsyonu sc teslim ya da semptomlar düzelene kadar. , Erkek hayvanlar durumunda, genital, dikkatlice, penis kırmızılık tarafından tanımlanan penis prolapsusu için uyulması olmalıdır. Bu etkilenen hayvan penis için mucol jeli uygulayın ve 1 hafta boyunca 1 ml Ringer solüsyonu sc teslim oluşuyorsaveya belirtilerin kadar geliştirmek.
3. Vücut ağırlığı değişiklikleri izlemek için günlük hayvanlar tartılır.
4. Ip enjeksiyon sebep olduğu durumda, küçük bir yırtma, gastrointestinal sistem, karın bir enfeksiyon neden olabilir. Bu nedenle,, şiş karında şişlik tarafından belirgin karın enfeksiyon prsence değerlendirmek. 3-4 gün drining su Baytril yönetmek ödüllendirin veya semptomlar düzelene kadar.

6. Parkinson değerlendirmesi

Lezyon ölçüde tahmin etmek için, davranışsal değerlendirme miktarda dopamin eksikliği ²⁶ maksimal ve istikrarlı olduğunda, 6-OHDA lezyon cerrahisi sonrası 14-21 gün yapıldı.

1. 0.01 ml / g% 0.9 'luk steril serum fizyolojik ip enjeksiyonunu takiben, yer farelerin cam silindir (11 cm x 9,5 cm) ve bir video kamera (CG9, Sanyo) kullanarak kendi etkinliğini kaydedebilirsiniz.
2. Video izlemek, yapılan hem ipsiversive ve contrav tam 360 ° döndürme sayısınıersive yönde lezyonun göreceli.
3. Ipsiversive rotasyonlar karşı büyük bir önyargı, Daha parkinsonyen hayvan, böylece net bir yüzdesi (contraversive ve ipsiversive) dönme davranışı olarak ipsiversive döndürme oranı hesaplamak.

7. Striatal dopamin içeriğinin HPLC ile Belirlenmesi

1. 6-OHDA lezyon cerrahisi sonrası en az 21 gün ve davranışsal çalışmaların tamamlanmasından sonra, fareler anestezi aşırı doz kurban ve beyin dikkatle çıkarın. Her fare her yarım küreden bir dilim striatum (230 mikron) korumak ve -80 kesit alma ve mağaza ° C, striatal örneklerinin hazırlanması kadar hemen sonra dondurma oturtun.
2. , HPLC örnek tamponu (2 mM glutatyon ile 0.1 M PCA), yıkılmak striatal örnekleri çıkarılan dopamin engeller.
   100 ml için numune tamponu:
   = 100 ml HPLC dereceli H ₂ O
   = 0,862 ml PCA (% 70) (Sigma)
   = 61.5 mg glutatyon (azaltılmış)
   HPLC saflıkta H ₂ O dışarı ölçmek, PCA, çözüm glutatyon erimesi, iyi ve filtre karıştırın. Numune tamponu 4 ° C de 1 aya kadar saklanabilir.
3. Striatal dilim buz üzerinde çözülme, daha sonra 200 mikrolitre numune tampon bir ultrasonik hücre bölücü (Fisher Sonic, ABD) kullanılarak homojenleştirme. Numuneleri, her zaman buz üzerinde tutmak ve her numunenin üç kez olduğu, numuneler homojenizasyon dönemleri arasında soğumaya sağlanması, her 10 saniye için homojenleştirme.
4. Her homojenize örnek bir protein tayini için 20 ul (-80 az mağaza ° C) bir kenara koyun.
5. 0.2 um PVDF zarı (Pall, Cat no: 1935-28143-310) aracılığıyla filtre ve supernatant ve dondurularak azından numuneleri (20.800 xg, 20 dak (4 ° C, 58 Eppendorf - 04R, USA)) santrifüjleyin, ardından kaldırmak HPLC analizine kadar -80 ° C. Back-up protein tayini için protein pelet saklayın.
6. Mobil faz HPLC thr çalıştırmak hazırlanışıHPLC sütun ough.
   L 1 mobil faz:
   60 mM NaH ₂ PO ₄ H ₂ O (monobazik) = 8.27 g
   30 mM = 5.7 g sitrik asit
   0,13 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), disodyum tuzu = 48 mg kurutmak
   0.16 mM Sodyum dodesil sülfat (SDS) = 45 mg
   850 ml HPLC saflıkta su (Caledon, Kedi #: 8801-7)
   % 15 v / v Asetonitril-190 (pH 3.35) = 150 ml HPLC dereceli (Caledon, Cat no: 1401-7).
   10 M NaOH ~ 2 ul (HPLC sınıf H2O)
   Tüm reaktifler mümkün ≥% 99.0 saf ve HPLC dereceli olmalıdır. HPLC dereceli su ve asetonitril olmalıdır. Mobil faz, bir hafta içinde preparasyon kullanılması gerekmektedir. Adanmış, temiz züccaciye ve barlar, sadece mobil faz (1 L cam bir ölçüm silindir (2), en azından 1 L cam flaskler) hazırlanması için karıştırın. Mobil faz hazırlama önce iki temiz 1 L şişeler hazırladık, tek ve bir çözüm yapmak için filtrasyon ve degassi sırasında içine aktarmak içinng. Mobil faz HPLC ile gece dolaşır ve taban kullanmak için önce düz olduğunu kontrol etmek için izin verin.
7. HPLC dereceli su, 700 ml cam mezür içine ölçün ve çözülür NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, sitrik asit, EDTA ve SDS. 850 ml su doldurun.
8. PH 3.35 10 M NaOH kullanarak ayarlayın, ardından asetonitril ekleyin ve karıştırın Teflon kaplı karıştırma çubuğu kullanarak çözüm.
9. Ikinci temiz, boş 1 L şişesi ve vakum içine mobil faz 0.22 um bir HVLP Millipore filtre ile filtre bir karıştırma çubuğu koyun: (Cat #: SLGP033RS). 85:15 H ₂ filtrasyon öncesi O / ACN filtre Wet. Sonra mobil tam vakum altında, en azından 10 dakika süreyle karıştırarak tarafından gazdan arındırmak, mobil faz süzülür.
10. Striatal örneklerinin depamin konsantrasyonu ölçülür edilecektir karşı standartlar hazırlayın. Standartları, striatal örnekleri her parti başında ve sonunda HPLC ile çalıştırılır. A 1dopamin mg / ml stok çözeltisi, önceden yapılan ve -80, 20 ul alikots içinde depolanmış edilebilir ° C. Hazırlamak için stok çözelti 5 mg 5 ml numune tamponu dopamin erimesi (yukarıya bakınız) ve iyice karıştırın. 1 mg / ml stok çözeltisi, 5 ul, 2.5 ml numune tampon ekleyerek ve iyice karıştırılarak, 2 ug / ml dopamin çözeltisi elde etmek için standart hazırlama başlayın.
11. Dört standartlar bir konsantrasyon eğrisi üretmek için HPLC ile çalıştırılır. Dopamin konsantrasyonları şunlardır: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, 12.5 ng / ml. Üretmek amacıyla,, dopamin bu dört konsantrasyonu 7.10 'da hazırlanmış olan 2 ug / ml dopamin çözeltisi) 10 ul alır. ve bir 100 ng / ml dopamin çözüm vermek örnek tampon 190 ul eklemek. Bu Ardından, 100 ng / ml dopamin çözeltisi numune tamponu ile 1:1 'lik bir seri seyreltme gerçekleştirmek. Sadece 100 ng / ml dopamin 100 ul ve 100 ul örnek tampon ve 50 ng / ml dopamin üretmeye karışımı ekleyin, daha sonra 100 almak50 ng / ml dopamin ul ve 100 ul örnek tampon ve 25 ng / ml 'dopamin ve üretmek için karışımı eklenir.
12. HPLC sistemi (Waters 1525μ İkili pompa, 717plus autosampler, Symmetry C-18 ters-faz kolon (15 cm x 4.6 mm id, 5 mikron partikül boyutu) (30 ° C), donatılmış elektrokimyasal detektör (ESA Coulochem III) hazırlamak için bir çift elektrot analitik hücreli (ESA 5011A) ve Breeze yazılım (Waters)) ilk tasfiye bilgisayar yazılımı tasfiye protokolü seçerek veya üreticinin yönergelerini takip ederek mobil faz ile sistem tarafından kontrol edilir. , Taze mobil faz HPLC sistemine Bu alışverişini daha önceki tüm çözüm
13. 400 mV -300 mV ve sırasıyla birinci ve ikinci elektrot potansiyelleri elektrokimyasal ayarlayın. Bundan sonra, sistem, en azından 2 saat için ideal bir mobil faz: 1 ml / dak akış hızında çalışan ve overnight dengelenmeye. Dengeleme sırasında hücreler açık ve temel tekrar edilmelidirokuma sistemi kullanılmaya hazır stabil hale geldiğinde ading, izlenmeli. Ilk bir saat için dengeleme çıkar sistem bu mobil faz çıkış hortumu mobil faz bir şişeye koyarak HPLC sistemi üzerinden sirküle izin verebilirsiniz ardından, bir atık kabı içine gitmek mobil faz sağlar.
14. Çözülme buz üzerinde striatal numuneleri, daha sonra her numune,, dengelenmiş HPLC sistemi içine, 1 ml / dak mobil faz akış hızı, 2 x 20 ul ve 20 ul her dopamin standart bir başka dopamin her bir standart 20 ul enjekte edilir.
15. Standartları ve örnekleri tarafından üretilen dopamin zirveleri alan analizi için HPLC sistemi yazılımı kullanın. Karşılaştırma, dopamin zirveleri striatal numuneler, standart depamin konsantrasyonu eğrisi için mevcut alanında striatal her numune 20 ul içinde,, dopamin mevcut olan bir miktarını tespit edecek. Toplam dopamin mevcut bütün striatal dilim bulmak için bu rakam kadar ölçeklendirilebilir.
16. Pstandart bir protein) 7.4 bir kenara, striatal homojenatında 20 ul tahlil erform. Bu protein mevcut striatal örneklerinde mg / ml bir miktarını ölçmek olacaktır. Bundan, dopamin ng / mg, dopamin hemisferlerin arasında ve fareler arasındaki konsantrasyonları karşılaştırmak için izin veren bir değeri olarak striatal örnekleri miktarını hesaplar.

8. Temsilcisi Sonuçlar

6 arasında bir başarı verilmesini takiben tuzlu su (ip) ²⁸ nörotoksin tarafından neden olduğu hücre ölümü miktarını (completion26) ulaşmıştır 6-OHDA-lezyon cerrahi Onbeş ila yirmi bir gün,, spontan 360 ölçüm ° rotasyonlar, değerlendirmek için kullanılabilir. (Şekil 2)-OHDA lezyonlanmıştır olan. Davranışsal değerlendirme Bu yöntem basit ve hızlı, ve böyle amfetamin veya Apomorfinin zorluklarını gibi dopaminerjik ajanlar tarafından neden potansiyel öncelik etkilerinin ortadan kaldırır. Ayrıca, spontan dönme değerlendirme daha iyi bir predi<% 95 dopamin eksikliği ile hayvanların ctor, ön ayakları pençe yerleştirme sınavına ²⁷ karşılaştırıldı. Her hayvan spontan ipsiversive rotasyonlar yüzdesi ile striatal örnekleri (HPLC kullanılarak davranışsal çalışmalar tamamlandıktan sonra hazırlanan) striatal dopamin seviyeleri ilişkilendirerek, biz% 70 veya 6-OHDA lezyon karşı daha ipsiversive rotasyonlar gösteren hayvanlar kayıp olduğu bulunmuştur> % 95 striatal dopamin (Şekil 3) ^27. Spontan rotasyonlar (40.91 ± 8.01) (Şekil 2) ölçerken medial ön beyin demeti kısmi 6-OHDA kaynaklı lezyonlar (59,44 ± 17.20) (Şekil 3) ardından dönme, hiçbir önyargı ipsiversive karşı contraversive taraf arasında vardı. Böylece, 6-OHDA, sıçanlarda MFB için uygulamayı takiben tespit edilmiştir, bunu bir, dopaminerjik Nigro-striatal nöronlar, derin kaybı, salin neden mümkün (ip) taranması için olan 6-OH ölçüde doğru bir yöntemdirBu hayvanlarda DA lezyon.

Şekil 1'de şematik 6-OHDA lezyon ameliyatları için enjeksiyon iğnesi aparatı montajı göstermek için.

Şekil 2. Sahte çalışan ve 6-OHDA lezyonlanan fareler dönme davranışlarının değerlendirilmesi. Spontan, plasebo çalışan ve 6-OHDA-lezyonlanan farelerde dönmeler. Veriler ortalama yüzdesi ipsiversive rotasyonlar ± SEM, net contraversive ve ipsiversive rotasyonlar% 100 olarak sunulmaktadır. >% 95 dopamin kaybı ile açık çubuklar: sham-operasyonlu hayvanlar; Gri çubuklar: 6-OHDA-lezyonlanan hayvanlar; Siyah barlar:, kısmen lezyonlanmıştır 6-OHDA lezyon cerrahisi uygulanan hayvanlar. *** P <0.001 sham-operated hayvanlara kıyasla. Dunn çoklu karşılaştırma testi (tek yönlü ANOVA takip jambon çalışan: n = 17; 6-OHDA-lezyon (>% 95): n = 23; kısmi 6-OHDA lezyon: n = 3).

Şekil 3. HPLC kullanılarak sahte çalışan striatal dopamin seviyeleri ve 6-OHDA lezyonlanan fareler Değerlendirilmesi. Sham ve 6-OHDA lezyonlanan hayvanlar çalışan ve Opere edilmemifl yarımkürede striatal dopamin içeriği tespit edildi. Veriler ortalama yüzdesi ± SEM Opere edilmemifl striatum striatal dopamin seviyeleri olarak sunulmaktadır. >% 95 dopamin kaybı ile açık çubuklar: sham-operasyonlu hayvanlar; Gri çubuklar: 6-OHDA-lezyonlanan hayvanlar; Siyah barlar:, kısmen lezyonlanmıştır 6-OHDA lezyon cerrahisi uygulanan hayvanlar. *** P <0.001, ** p <0.01 sham-operasyonlu hayvanlara kıyasla. Tek yönlü ANOVA Dunn çoklu karşılaştırma testi ile takip (sham-operated: n = 17, 6-OHDA-lezyon (>% 95): n = 23, kısmi 6-OHDA lezyon: n = 3).

"EAK>

Şekil 4. Plasebo çalışan ve 6-OHDA lezyonlanan fareler SNC tirozin hidroksilaz immünoreaktivitesinde Değerlendirme. , Thiele et al içinde tarif edildiği gibi, dopamin hücre kaybı, substantia nigra pars compactadaki (SNC),, tirozin hidroksilaz, plasebo ve 6-OHDA-lezyonlanan bir hayvanların, işletilen ile Opere edilmemifl hemisphere kaybı (TH) pozitif immunohistochemisty bir işaretleyici olarak tespit edildi. Basında. Veriler ortalama yüzdesi TH olumlu Opere edilmemifl striatumdaki içinde hücrelerin ± SEM olarak sunulmaktadır. >% 95 dopamin kaybı ile açık çubuklar: sham-operasyonlu hayvanlar; Gri çubuklar: 6-OHDA-lezyonlanan hayvanlar; Siyah barlar:, kısmen lezyonlanmıştır 6-OHDA lezyon cerrahisi uygulanan hayvanlar. *** P <0.001, ** p <0.01 sham-operasyonlu hayvanlara kıyasla. Tek yönlü ANOVA Dunn çoklu iştigal tarafından takiprison testi (sham-operated: n = 17, 6-OHDA-lezyon (>% 95): n = 23, kısmi 6-OHDA lezyon: n = 3).

Tartışmalar

Bu protokol bir lezyon başarı oranı yüksek ve düşük mortalite oranı, son derece tekrarlanabilir Parkinson hastalığı, istikrarlı bir tek taraflı 6-OHDA-lezyonlanan fare modelinin üretimi için bir yöntem açıklanır. , 6-OHDA lezyon cerrahisi başarı kolayca lezyonlu striatum ^27>% 95 dopamin eksikliği göstergesidir>% 70 ipsiversive rotasyonlar ile ölçümü ile spontan dönme davranışı tahmin edilebilir. Striatal dopamin düzeylerini ²⁸ doğrudan ölçüm sağlar striata...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desipramin HCl	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	D125	25mg/kg
ILM parglin HCl	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	P8013	5mg/kg
6-OHDA HBr	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	H116	3mg / fare
Stereotaksik Çerçeve	Kopf Instruments Tujunga ile, CA, USA	Model 900
Fare kulak kepçesi	Kopf Instruments Tujunga ile, CA, USA	Model 921 elmacık kemiği Kulak Bardaklar
Fare kesici bar	Kopf Instruments Tujunga ile, CA, USA	Model 923B
Fare anestezi maskesi	Kopf Instruments Tujunga ile, CA, USA	Model 923B
Priming kiti (250ml şırınga içeren)	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	PRMKIT 81.120
RN sıkıştırma montaj kiti (1 mm)	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	55.750-01
RN sıkıştırma montaj kiti PEEK boru< (1/16 Th Inç)	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	55.751-01
Çift küçük hub RN çoğaltıcı	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	55.752-01
Luer küçük hub RN adaptörü	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	55.753-01
1ml 25S şırınga modeli 7001KH	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	80100
* 6 33G çıkarılabilir iğne (RN) paket. . 45 <° eğim ile Özel 1 inç	Hamilton Şirket, Reno, NV, ABD	7803-05
Makas	Güzel Bilim Araçlar, Vancouver, BC, Kanada.	14.084-08
Neşter	Güzel Bilim Araçlar, Vancouver, BC, Kanada	10.003-12
Neşter bıçakları	Güzel Bilim Araçlar, Vancouver, BC, Kanada	10.035-20
Forsepsle	Güzel Bilim Araçlar, Vancouver, BC, Kanada	11.608-15
Hemostat	Güzel Bilim Araçlar, Vancouver, BC, Kanada.	13.004-14
İsofluranın	Abbot	02241315	% 2-3
Suters (Vicryl 4.0)	Syneture	SS-683
Sterilizatör	Güzel Bilim Araçlar, Vancouver, BC, Kanada	18.000-45
İnfüzyon Pompası	Harvard Apparatus	Doktora 22/2000.
İğneler (27G)	Becton Dickinson	305.109
İğneler (25G)	Becton Dickinson	305.127
Enjektörler (1 ml)	BD şırınga	309.692
Anestezi arabası	LEI tıbbi	M2000
Baytril	CDMV, St. Hyacinthe'dan, QC	102.207
Lidokain	CDMV, St. Hyacinthe'dan, QC	3914
Betadine çözüm	CDMV, St. Hyacinthe'dan, QC	19.955