Развитие одностороннем порядке, пораженном 6-OHDA мышиной модели болезни Паркинсона

Резюме

Протокол для проведения односторонних 6-OHDA поражения медиальных пучка переднего мозга у мышей описано. Этот метод имеет низкий уровень смертности (13,3%) с 89% выживших животных показывает> 95% потерь полосатой дофамина и 90,63 ± -4,02% ipsiversive вращательное смещение в сторону поражения.

Аннотация

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients^1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise^3,5.

In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)⁸, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice^9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer¹¹. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate >80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia^11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse¹⁵. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents¹⁶, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion^{17, 18}.

Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes >95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

протокол

1. Жилищного строительства и подготовки мышей

1. Поддерживать колонии бактериальных искусственную хромосому (BAC) приводится трансгенных мышей, ⁸ ​​(мутантных мышей региональный ресурсный центр (MMRRC) FVB в 12:12 час свет-темнота цикла со свободным доступом к пище и воде. Эти мыши чисты мышей FVB и не стоит переходить этих мышей с любой другой штамм, ни для селекционных целей, или для обеспечения успешного проведения 6-OHDA поражение процедуры.
2. Для создания модели паркинсонизма, взрослых мышей в возрасте 31-42 день послеродового (P31-42), необходимых для 6-OHDA-поражения и мнимой операции.
3. Чтобы уменьшить риск заражения, администрирование Baytril (антибиотик) в питьевой воде в течение 24 часов до операции.

2. Подготовка препаратов для хирургии

Премедикация дезипрамина и pargyline обычно вводится для грызунов до введения 6-hydroxydopamine (6-OHDA), чтобы увеличить селективность и эфicacy 6-OHDA вызванных повреждениями. Норадреналина / 5HT поглощение ингибитор, дезипрамин уменьшается 6-OHDA вызванной норадреналином и истощение 5HT ^22, в то время как ингибиторы моноаминоксидазы, pargyline повышает чувствительность дофаминергических терминалов до 6-OHDA, за счет снижения внесинаптического распада 6-hydroxydopamine ^31.

1. Премедикация (дезипрамин гидрохлорид (HCl) и pargyline HCl) могут быть сделаны в больших объемах и хранили при -80 ° C до использования. Взвесить соответствующее количество дезипрамин HCl снабдить каждую мышь с 25 мг / кг по количеству животных, которые получат операции в этот день. Малый вес мыши делает ее сложной для доставки небольших объемах точно, поэтому приготовьтесь дезипрамин гидрохлорида в концентрации 2,5 мг / мл и вводили животным в 10 мл / кг. Вес компонента соли соединения необходимо учитывать, что правильная концентрация достигается. Коррекция весаHCl соль в дезипрамин гидрохлорид: Молекулярный вес (МВт) дезипрамин HCl: 302,84 МВт HCl: 36,46 МВт свободного основания: 266,38 поправочный коэффициент: 302,84 / 266,38 = 1,137 для 10 мл раствора: = 2.5mg/ml дезипрамин х 10.0ml х поправочный коэффициент = 2.5mg/ml х 10.0ml х 1,137 = 28.43mg дезипрамина гидрохлорид
2. Взвесить соответствующее количество pargyline HCl снабдить каждую мышь с 5мг/кг по количеству животных, получавших операции в этот день. Исправьте на соль компонент соединения, как описано выше. Малый вес мыши делает ее сложной для доставки небольших объемах точно, поэтому приготовьтесь pargyline гидрохлорида в концентрации 0,5 мг / мл и применять для животных в 10 мл / кг.
   Исправьте на вес соли соляной кислоты гидрохлорид в pargyline:
   МВт pargyline HCl: 195,69 МВт HCl: 36,46
   МВ свободного основания: 159,23 поправочный коэффициент: 195,69 / 159,23 = 1,229
   За 10 мл раствора отвешивать: <бр /> = 0,5 мг / мл pargyline х 10,0 мл х поправочный коэффициент
   = 0,5 мг / мл х 10,0 мл х 1,229
   = 6.15mg гидрохлорида pargyline
3. Комбинат 28.43mg дезипрамин HCl и 6.15mg pargyline HCl в 10 мл стеклянный мерный цилиндр, и добавить 8 мл стерильного физиологического раствора (0,9%). Vortex и тепла до 45 ° С, пока смесь не растворится. РН раствора теперь будет около 3, которые, если вводили мышам вызывает дискомфорт и послеоперационных осложнений, связанных мочи и функции желудочно-кишечного тракта. Добавить капель NaOH (1M) до рН 7,4. Пополните объем 10 мл стерильным физиологическим раствором (0,9%), и вихрь. Этикетка, дата и замораживание при температуре ~ 80 ° C. Учитывая, что pargyline HCl не растворяется в солевом растворе при комнатной температуре, в течение хирургических период хранения премедикации смесь на водяной бане нагревают до 37 ° C в операционной комнате.
4. Решение 6-OHDA должны быть подготовлены непосредственно до операции. Транспортные средства, используемые для растворения 6-OHDA гидробромид (6-OHDA.Br) решение стерильного физиологического раствора (0,9%) раствор, содержащий аскорбиновую кислоту (0,2%). Аскорбиновая кислота необходима для стабилизации 6-OHDA.Br, так как он предотвращает окисление 6-OHDA.Br в неактивной форме. Взвесить 0,2 г аскорбиновой кислоты, а затем добавить в пустой 1 л мерный цилиндр, долить до 1 л стерильным физиологическим раствором (0,9%) и перемешать. Этикетка, дата и хранят при -80 ° C до требуется.
5. Взвесить соответствующее количество 6-OHDA.HBr сделать 15,0 мг / мл раствора на поставку каждой мыши с 3,0 мкг. С 6-OHDA.Br есть свет и тепло чувствительные избегать воздействия света, и место на льду до взвешивания.
   Исправьте на вес соли HBr в 6-OHDA.HBr:
   МВт, 6-OHDA.HBr: 250,09 МВт HBr: 79,9 МВт свободного основания: 170,19
   Поправочный коэффициент: 250,09 / 170,19 = 1,47
   По 0,5 мл раствора отвешивать:
   = 15,0 мг / мл 6-OHDA х 0,5 мл х поправочный коэффициент
   = 15,0 мг / мл 6-OHDA х 0,5 х 1,47 мл
   = 11,03 мг 6-OHDA.HBr
6. Взвесьте 6-OHDA.HBr в стерильную мл 1,0 трубки покрыта алюминиевой фольгой, и добавляют 0,5 мл транспортного средства (стерильный физиологический раствор (0,9%), аскорбиновая кислота 0,02% рН 7,4). Vortex, пока смесь не растворяется, этикетки, и сразу же на льду до использования. Отметим, что 6-OHDA решение должно быть использовано в течение примерно 6 часов после приготовления. Если раствор получается темно-коричневая или непосредственно после приготовления, или во время операции, то это означает, что 6-OHDA.HBr стал окисляется, и больше не эффективны нейротоксин, поэтому должны быть уничтожены и готовы еще раз.
7. Для мнимой-оперированных животных, составляющих эквивалент объема транспортного средства (стерильный физиологический раствор (0,9%), аскорбиновая кислота 0,02% рН 7,4), к тому, что 6-OHDA-пораженном животные получают, и место в 1,0 мл стерильной пробирке завернутый в фольгу, этикетку и сразу же на льду до использования.

3. Настройка хирургический аппарат

Хирургические инструменты должны стерилизоваться в автоклаве до то хирургии. С каждой операции, хирургические инструменты должны стерилизоваться в 95% этаноле с последующим нагреванием до 250 ° С в течение 2 минут. Все эксперименты должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами соответствующей Animal Care комитетов аффилированные учреждения и страны.

1. Очистите все поверхности и оборудования с изопропилового спирта до настройки оборудования. Носите стерильные перчатки при работе с чистыми хирургическое оборудование.
2. Настройка клетки мыши восстановления с бумажными полотенцами на базе. Место под нагрева лампой или на верхней площадке с подогревом.
3. Установить тележку анестезией, что обеспечивает приток кислорода связана и открытым, и ИФ водохранилище полностью. Установите поток кислорода на 1 л / мин, а изофлуран до 2-4%. В идеале будет два порта отток из машины анестетик для доставки кислорода ИФ смеси индукции камеры, а также для содержания животных в стереотаксической раме.
4. Соrrect сборки вливания аппарат имеет решающее значение для обеспечения успешного поражения, а пузырьки воздуха или заблокирован игл уменьшается объем 6-OHDA настоянный на поражение сайта. Соберите вливания аппарат, как показано на рисунке 1. Тема одна RN металла гайку на одной стороне PEEK трубки (RN сжатия комплект (фитинги ^1/16-го дюйма)), а затем PEEK чашку наконечника, то каноническое PFA наконечником. Восток наконечники, чтобы конус на канонической PFA наконечник будет скользить в ответную часть из PEEK чашка наконечником. Место в двойной малый центр RN соединитель (№ 1), обеспечивающий соединение туго. На другом конце двойной малый центр RN соединитель вставить 33-калибровочного инъекционной иглой. Пропустите иглу через одну из металла RN гайки и затяните их. Убедитесь, 33 иглы находится на 180 ° углом к ​​двойной малый центр RN соединитель (№ 1). На другом конце трубки PEEK, нить к одному из металлических RN орехи следует PEEK наконечник, то PFA наконечником. Вставьте металлический орехм наконечником сборки во второй двойной малый центр RN соединитель и затяните соединение. На другом конце второй маленький двойной RN центром навесного оборудования (№ 2) вставить Luer малого центр RN адаптера (адаптер Луер) и затяните соединение.
5. Затем настой аппарат должен быть заполнен (см. Рисунок 1). Заполните 250 мкл и 1,0 мкл шприцы Hamilton стерильной водой, обеспечивая нет пузырьков воздуха. Прикрепить 250 мкл шприца Luer адаптер и нажмите на поршень шприца 250 мкл, что вода выходит через 33 калибровочных инъекционной иглой на другом конце трубки. Продолжить нажатием воды через систему при натяжении 250 мкл из шприца Luer адаптер, оставив небольшой шарик воды на конце Luer адаптер. Нажмите на поршень шприца 1,0 мкл до небольшого шарика воды выбрасывается. Осторожно вставьте 1.0 мкл шприца в Luer адаптер, убедитесь, что вода шарик на 1,0 мкл шприц соединяется с водой шарик настоящий оп Luer адаптер и полностью вставьте 1.0 мкл шприца в Luer адаптер. Убедитесь в отсутствии пузырьков в небольшой двойной муфты RN центром.
6. Теперь, когда система подтянута, перфузии аппарат может быть прикреплен к стереотаксической рамы и инфузионного насоса. Зажим маленький двойной RN центра муфты с 33 калибровочных инъекционной иглой прикреплены к манипулятора в стереотаксической рамы, затем зажать 1.0 мкл шприц перфузии насос, такой, что при перфузии насос начинает шприц прижимают зажимом и не может двигаться. Программа инфузионный насос, чтобы скорость инфузии 0,1 мкл / мин.

4. Односторонние 6-OHDA поражение хирургии

1. Тридцать минут до операции, вес каждого животного и зафиксировать вес. Системно управлять дезипрамин гидрохлорид (2,5 мг / мл, Sigma Aldrich) и pargyline гидрохлорид (0,5 мг / мл, Sigma Aldrich) (0,9% стерильного физиологического раствора, рН 7,4) в 10 мл / кг внутри-перитонеального инъекции (ф) на одну мышьпомощью иглы 27G прикреплен к 1 мл шприц. Например, 30,0 г мыши получали 300 мкл премедикации. Разминка отопления диск и поставить это под ухом и резца бар. Нагревательный диск поможет поддерживать температуру животного во время операции и держать животное на идеальной высоте, чтобы соответствовать уха и резца баров стереотаксической рамы.
2. Через пятнадцать минут после введения дезипрамин HCl и pargyline HCl решение, поместите курсор в закрытой камере анестезии и anesthetise животных с использованием ИФ ингаляции (2-3% O _2). Животное достаточно anesthetised, когда она не показывает ответ на задние ноги и щепотку не мигают рефлекс.
3. Бритье верхней части головы мыши и применять актуальные обезболивающее лидокаин прямо на кожу с помощью ваты. Через пять минут после применения лидокаина, стерилизовать головы животного с бетадин решение.
4. Поместите животное в кадре стереотаксической адаптированы для мышей. Во-первых поместить животное в резца бар (бар резца настройки: от -3,0 до 2,0 мм) с маской анестезии размещены на лице животного. Отрегулируйте поток кислорода на 1 л / мин, а изофлуран до 1,5-2%. В баре резца должна быть на уровне, по отношению к амбушюры, что в верхней части черепа уровне. Вставьте амбушюры (диаметр 5,0 мм). Амбушюры были вставлены правильно, когда голова полностью разряжена, и не может быть перемещена в любую сторону.
5. Разрежьте вдоль средней линии кожи на верхней части головы от мыши, используя лезвие скальпеля, и убрать кожу. Сухая поверхность черепа использовании марли.
6. Опустите поршень шприца 1,0 мкл, а также разместить 33 иглой калибровочного в 1 мл трубки покрыта фольгой, содержащей 6-OHDA раствора (15 мг / мл). Отступать медленно на поршень шприца 1,0 мкл, сохраняя при этом 33 калибровочных инъекционной иглой погружается в 6-OHDA раствора (15 мг / мл).
7. Создать 1 см разрез по серединелинии черепа. Предварительный кончиком инъекционной иглой на темя, обходиться небольшим количеством 6-OHDA решение от 33 иглой калибровочных сформировать небольшой шарик. Медленно опустите кончик инъекционной иглой брегмы, когда шарик касается брегмы остановить продвижение кончика иглы и записать эти координаты. Уберите инъекционной иглой 2 мм в спинном направлении и движется вдоль стреловидного шва в ростральной хвостовой направлении лямбда. Предварительный небольшое количество 6-OHDA решение от 33 иглой калибровочных сформировать небольшой шарик. Медленно опустите кончик иглы для инъекций Lambda, когда шарик контакты Lambda остановить продвижение кончика иглы и записать эти координаты. Медиальной боковой (ML), и спинной вентральной (DV) координаты должны быть одинаковыми для брегмы и Lambda, если они не являются, настроить панели резца соответственно для AP координаты, и ухо баров для ML координат. Перемещение иглы координирует AP: 1,2 мм, ML: -1,1 мм по сравнению с Брегма в соответствии с Атлас мозга мыши в стереотаксической Координаты ^25. Уберите иглу, и заусенцев отверстие в черепе использование 25 иглы.
8. Верните иглу к вышеуказанным координатам, и вставить иглу в DV:-5мм. Настаивать 0,2 мкл 6-OHDA или транспортного средства, в одностороннем порядке в среднем пучка переднего мозга в размере 0,1 мкл / мин (3 мкг общего числа). После завершения администрация 6-OHDA или транспортного средства, оставлять иглу на месте в течение последующих пяти минут, чтобы диффузия от укола.
9. Медленно отведите иглы.
10. Закройте разрез кожи головы с использованием трех швов, и поставить 1 мл раствора лактата Рингера подкожно (п).
11. Удалить животное от стереотаксической рамы, и место в клетке до восстановления сознания восстанавливается.

5. Послеоперационный уход 6-OHDA-пораженном животных

1. Место животных в клетках (3 мышей / клетку), а также обеспечить свободный доступ к продовольствию и sugareг воды (10 мм). Обеспечить Nutra-гель и KMR (котенок молоко замены) в контейнеры для пищевых продуктов на полу клетки для стимуляции аппетита и желудочно-кишечного.
2. Проверьте мышь ежедневно после операции в течение 2 недель ^24. В каждой инспекции, особое внимание должно быть уделено бдительность животных путем оценки способности животных перемещаться по клетке. Продукты питания и забор воды из последнего периода наблюдения, а также наличие и консистенция фекалий должны быть соблюдены. Общий послеоперационных осложнений является обезвоживание это видно медленное втягивание кожи следующий щепотку кожи. Если это наблюдается доставки 1 мл лактата раствор Рингера подкожно в течение 1 недели или до исчезновения симптомов улучшения. В случае самцов, половых органов следует тщательно наблюдать за пенис выпадение определенных покраснения полового члена. В этом случае применяются mucol гель для пениса пострадавшего животного, и доставить в 1 мл лактата раствор Рингера подкожно в течение 1 неделиили до исчезновения симптомов улучшения.
3. Взвешивание животных ежедневно отслеживать изменения в массе тела.
4. В случае, когда IP-инъекция вызвала небольшой разрыв в желудочно-кишечном тракте, брюшной инфекции может привести. Таким образом, для оценки prsence инфекции органов брюшной полости, очевидным опухшие вздутие живота. Лечение путем введения Baytril в drining воде в течение 3-4 дней или до исчезновения симптомов улучшения.

6. Паркинсона оценки

Для оценки степени поражения, поведенческие оценки было выполнено 14-21 дней после 6-OHDA-поражение операции, когда количество допамина истощения максимальный и стабильный ^26.

1. После инъекции ф 0,01 мл / г 0.9% стерильного физиологического раствора, место мышей в стеклянные цилиндры (11 см х 9,5 см) и записывать их деятельности с использованием видеокамеры (CG9, Sanyo).
2. Просмотр видео, подсчитать количество поворотов на 360 ° в обеих ipsiversive и contraversive направлении по отношению к поражению.
3. Чем больше уклон в сторону ipsiversive вращения, тем больше паркинсонизмом животных, таким образом, вычислить долю ipsiversive вращения в процентах от чистой (contraversive и ipsiversive) вращательное поведение.

7. Определение содержания допамина полосатой ВЭЖХ

1. По крайней мере 21 дней после 6-OHDA поражение операции, и после завершения поведенческих исследований, пожертвовать мышей более чем на дозу анестезии, и осторожно удалите мозга. Сохраните один кусочек полосатого тела (230 мкм) от каждого полушария в каждой мыши, и хватать сразу после замораживания срезов и хранить при температуре -80 ° C до подготовки полосатой образцов.
2. Буфер проб для ВЭЖХ (0,1 М СПС с 2 мМ глутатион) предотвращает дофамина извлеченные из полосатой образцы от разрушения.
   За 100 мл образца буфера:
   = 100 мл ВЭЖХ H ₂ O
   = 0,862 мл СПС (70%) (Сигма)
   = 61,5 мг глутатиона (уменьшение)
   Отмерьте ВЭЖХ H ₂ O, добавить СПС, распустить глутатиона в растворе, хорошо перемешать и процедить. Образец буфера можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
3. Таяние полосатой кусочки на льду, а затем получения однородной массы в 200 мкл буфера образца с помощью ультразвукового разрушителя клетки (Fisher Sonic, США). Храните образцы на льду во все времена и получения однородной массы каждого образца в три раза по 10 секунд каждый обеспечении того, чтобы образцы дают остыть между гомогенизации периоды.
4. Отложите 20 мкл каждого усредненного образца (хранить при -80 ° C) для белка, анализа.
5. Центрифуга образцов (20 800 мкг, 20 мин (4 ° С, Эппендорф 58 - 04R, США)), затем удалите супернатант и процеживают через 0,2 мкм PVDF мембрану (Pall, Cat #: 1935-28143-310) и заморозить -80 ° C до анализа ВЭЖХ. Сохраните белка гранул в качестве резервного для белка анализа.
6. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ для запуска Четух колонки ВЭЖХ.
   Для 1 л подвижной фазы:
   60 мМ NaH ₂ PO _4. H ₂ O (одноосновная) = 8,27 г
   30 мМ лимонной кислоты = 5,7 г
   0,13 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) динатриевая соль обезвоживает = 48 мг
   0,16 мМ додецилсульфата натрия (SDS) = 45 мг
   850 мл воды для ВЭЖХ (Каледон, Cat # 8801-7)
   15% об / ацетонитрил-190 (рН 3.35) = 150 мл ВЭЖХ (Каледон, Cat # 1401-7)
   ~ 2 мкл 10 М NaOH (в ВЭЖХ H2O)
   Все реагенты должны быть ≥ 99,0% чистый и ВЭЖХ где это возможно. Воды и ацетонитрила должны быть ВЭЖХ. Подвижная фаза должна быть использована в течение одной недели подготовки. Посвятили, чистую стеклянную посуду и перемешать баров исключительно для приготовления подвижных фаз (1 л стекло мерный цилиндр и по крайней мере 2 1 колбы L стекла). Перед приготовлением подвижной фазы были два чистых колбы 1 л готовым к этому, чтобы решение и один для передачи его в процессе фильтрации и degassiнг. Позвольте подвижной фазы циркулировать по высокоэффективной жидкостной хроматографии в ночное время и убедиться, что базовые плоская перед использованием.
7. Отмерьте 700 мл ВЭЖХ воду в стакан, мерный цилиндр и распустить NaH ₂ PO _4. H ₂ O, лимонная кислота, ЭДТА и SDS в нем. Долить водой до 850 мл.
8. Скорректировать значение рН до 3,35 с помощью 10 М NaOH, а затем добавить ацетонитрила и смешать решения с использованием тефлоновым покрытием мешалкой.
9. Положите мешалкой во второй чистый, пустой 1 флакон L и вакуумной фильтрации подвижной фазы в нее через 0,22 мкм фильтр Millipore HVLP (Cat #: SLGP033RS). Влажный фильтр в 85:15 H ₂ O / АКС перед фильтрацией. После того, мобильные полностью фильтруется, дегазации подвижной фазы при перемешивании его в вакууме в течение по крайней мере 10 мин.
10. Подготовить стандарты, по которым дофамина в полосатом образцы будут измерены. Стандарты проходят через высокоэффективной жидкостной хроматографии в начале и конце каждой серии полосатой образцов. А 1мг / мл маточного раствора дофамина может быть сделан заранее и хранить в 20 мкл аликвоты при -80 ° C. Для приготовления маточного раствора растворяют 5 мг дофамина в 5 мл буфера образца (см. выше) и смешать его полностью. Начало подготовки стандартов с 5 мкл 1 мг / мл маточного раствора, добавив, что в 2,5 мл буфера образца и смешивая его полностью, чтобы получить 2 мкг / мл раствора дофамина.
11. Четыре стандарты проходят через высокоэффективной жидкостной хроматографии для получения кривой концентрации. Для дофамина концентрация 100 нг / мл, 50 нг / мл, 25 нг / мл и 12,5 нг / мл. Для создания этих четырех концентрации дофамина взять 10 мкл 2 мкг / мл допамин раствор, приготовленный в 7.10). и добавить его в 190 мкл буфера образца, чтобы дать вам 100 нг / мл раствора дофамина. После этого выполняют 1:1 серийные разведения 100 нг / мл раствора дофамина с образцами буфера. Просто возьмите 100 мкл 100 нг / мл допамина и добавить 100 мкл буфера образца и смеси для производства 50 нг / мл допамина, то потребуется 100мкл 50 нг / мл допамина и добавить 100 мкл буфера образца и смеси для производства 25 нг / мл допамина и так далее.
12. Для подготовки системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (воды 1525μ двоичной насос, 717plus автосамплером, симметрия C-18 с обратной фазой колонки (15 см х 4,6 мм идентификатор, 5 мкм, размер частиц) (30 ° C), электрохимический детектор (ЕКА Coulochem III), оборудованный с двойной электрод аналитической ячейки (ЕКА 5011A) и контролируется программное обеспечение Breeze (Waters)) первой чистки системы с подвижной фазы, выбрав чистка протокол в компьютер программное обеспечение или, следуя инструкциям производителя. Этот обмен все предыдущие решения в системе ВЭЖХ со свежими подвижной фазы.
13. Установить электрохимических потенциалов на 400 мВ и 300 мВ для первого и второго электродов соответственно. После этого равновесия системы, запустив его в течение 2 часов, а в идеале ночь с подвижной фазы при скорости потока 1 мл / мин. В равновесия клетки должны быть включены и базовые повторноADING контроль, когда чтение становится устойчивой система готова к использованию. В течение первого часа из равновесия пусть подвижной фазе, что выходит из системы идут в брак контейнера, после этого вы можете позволить подвижной фазы для рециркуляции через систему ВЭЖХ, поставив выходе шланга в мобильной колбе фазы.
14. Таяние полосатой образцы на льду, а затем вводят 20 мкл каждой стандартной допамин затем 2 х 20 мкл каждого образца, а еще 20 мкл каждого стандартного допамина в уравновешенной системе ВЭЖХ с подвижной расход фазы на 1 мл / мин.
15. Используйте программное обеспечение системы ВЭЖХ для анализа области дофамина пиков производится по стандартам и образцам. Сравнивая область допамина пики присутствует в полосатой образцы стандартной кривой концентрация допамина будет определять количество допамина присутствует в 20 мкл каждого образца полосатого. Масштаб этой цифры, чтобы найти общий настоящее допамина в целом полосатой срез.
16. Perform стандартный анализ белка на 20 мкл гомогената полосатой, что Вы откладываете в 7.4). Это будет измерять количество белков, присутствующих в образцах полосатого мг / мл. Из этого расчета количества дофамина в полосатом образцах значения в нг / мг позволяет сравнить концентрацию дофамина между полушариями и между мышами.

8. Представитель Результаты

Пятнадцать-двадцать один день после 6-OHDA-поражение операции, когда количество клеточной смерти от нейротоксина достигла completion26, измерения спонтанного вращения на 360 ° после введения физиологического раствора (ф) ²⁸ может быть использован для оценки успешности 6 -OHDA-пораженном (рис. 2). Этот метод поведенческой оценки является простым и быстрым, а также избежать возможных последствий грунтовки вызвано дофаминергические препараты, такие как амфетамин или апоморфина проблем. Кроме того, спонтанные оценки вращения лучше предикатовCTOR животных с <95% дофамина, истощение по сравнению с передними конечностями лап тест ^27. Сопоставляя полосатой уровни дофамина из полосатой образцы (подготовлен по завершении поведенческих исследований с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии) и процент спонтанных ipsiversive вращения в каждом животном, мы обнаружили, что животные, которые обладают 70% или более ipsiversive вращения по отношению к 6-OHDA поражения потеряли> 95% полосатого допамина (рис. 3) ^27. После частичной 6-OHDA вызванного повреждения (59,44 ± 17,20) (рис. 3) медиального пучка переднего мозга, не было вращательное смещение между ipsiversive против contraversive сторон при измерении спонтанного вращения (40,91 ± 8,01) (рис. 2). Таким образом, был найден после 6-OHDA администрации MFB на крысах, можно вызвать глубокий потеря дофаминергических Нигро-полосатой нейронов, и соленые администрации (ф) является точным методом проверки степени 6-OHDA поражения у этих животных.

Рисунок 1. Принципиальная схема для демонстрации сборки аппарата иглой для 6-OHDA-поражение операций.

Рисунок 2. Оценка вращательное поведение в фиктивный управлением и 6-OHDA пораженном мышей. Спонтанное вращения в фиктивный управлением и 6-OHDA-пораженном мышей. Данные представлены в виде среднего процента вращения ipsiversive ± SEM, где чистый contraversive и ipsiversive вращения на 100%. Открытые бары: шам-оперированных животных, серый бары: 6-OHDA-пораженном животных с> 95% дофамина, потери, черные полосы: животные, которые прошли 6-OHDA-поражение операции, которые были частично пораженный. *** Р <0,001 по сравнению с мнимой-оперированных животных. Одностороннее ANOVA следует несколько тестов сравнения Данна (ы ветчина управлением: п = 17; 6-OHDA-пораженном (> 95%): п = 23; частичное 6-OHDA-поражение: п = 3).

Рисунок 3. Оценка полосатой уровень допамина в фиктивный управлением и 6-OHDA пораженном мышей с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Содержание дофамина в стриатуме была определена в оперированных и неоперированных полушарии притворство и 6-OHDA-пораженном животных. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего процента полосатого тела уровни дофамина в стриатуме неоперированных. Открытые бары: шам-оперированных животных, серый бары: 6-OHDA-пораженном животных с> 95% дофамина, потери, черные полосы: животные, которые прошли 6-OHDA-поражение операции, которые были частично пораженный. *** Р <0,001, ** p <0,01 по сравнению с мнимой-оперированных животных. Одностороннее ANOVA следует несколько тестов сравнения Данна (обман управлением: п = 17, 6-OHDA-пораженном (> 95%): п = 23, частично 6-OHDA-поражение: п = 3).

ЕАК ">

Рисунок 4. Оценка тирозин гидроксилазы иммунореактивности в SNC в фиктивный управлением и 6-OHDA пораженном мышей. В качестве маркера допамина потери ячейки в черной субстанции Парс компактов (SNC), потеря тирозингидроксилазы (TH) положительный immunohistochemisty в оперированных и неоперированных полушарии притворство и 6-OHDA-пораженном животных определяли, как описано в Тиле соавт. В Press. Данные представлены как среднее ± SEM процент ТН-положительных клеток в неоперированных полосатом теле. Открытые бары: шам-оперированных животных, серый бары: 6-OHDA-пораженном животных с> 95% дофамина, потери, черные полосы: животные, которые прошли 6-OHDA-поражение операции, которые были частично пораженный. *** Р <0,001, ** p <0,01 по сравнению с мнимой-оперированных животных. Одностороннее ANOVA следует несколько компаниям Даннагарнизон тест (обман управлением: п = 17, 6-OHDA-пораженном (> 95%): п = 23, частично 6-OHDA-поражение: п = 3).

Обсуждение

Этот протокол описывает метод для генерации стабильного одностороннем 6-OHDA-пораженном мышиной модели болезни Паркинсона, которая является очень воспроизводимые, с высоким уровнем успеха поражением, и низкий уровень смертности. Успех 6-OHDA поражение операция может быть легко оценить пу...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Дезипрамин HCl	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Канада	D125	25mg/kg
Pargyline HCl	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Канада	P8013	5мг/кг
6-OHDA HBr	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Канада	H116	3 мг / мышь
Стереотаксической Frame	Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	Модель 900
Мышь амбушюры	Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	Модель 921 Кубков скуловой кости уха
Мышь резца бар	Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	Модель 923B
Мышь анестезии маски	Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	Модель 923B
Грунтовка набор (содержащий 250 мл шприц)	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	PRMKIT 81120
RN резьбовое комплект (1 мм)	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	55750-01
PEEK трубки из RN резьбовое комплект< (1/16 Й Дюйм)	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	55751-01
Двойной малый центр RN Coupler	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	55752-01
Luer малого центр RN адаптер	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	55753-01
1 мл шприц модель 25S 7001KH	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	80 100
* 33 г. съемной иглой (RN) 6 шт. . Custom 1 дюйм с 45 <° скос	Компания Hamilton, Рино, штат Невада, США	7803-05
Ножницы	Изобразительных средств наук, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада.	14084-08
Скальпеля	Изобразительных средств наук, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада	10003-12
Лезвий скальпеля	Изобразительных средств наук, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада	10035-20
Forcep	Изобразительных средств наук, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада	11608-15
Hemostats	Изобразительных средств наук, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада.	13004-14
Изофлюран	Аббат	02241315	2-3%
Suters (Викрил 4.0)	Syneture	SS-683
Стерилизатор	Изобразительных средств наук, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада	18000-45
Инфузионных насосов	Гарвардского аппарата	PhD 22/2000
Иглы (27G)	Becton Dickinson	305109
Иглы (25G)	Becton Dickinson	305127
Шприцы (1 мл)	BD Шприц	309692
Анестезия тележки	LEI медицинских	M2000
Baytril	CDMV, Санкт-Гиацинт, QC	102207
Лидокаин	CDMV, Санкт-Гиацинт, QC	3914
Бетадин раствор	CDMV, Санкт-Гиацинт, QC	19 955