Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Özet

Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Özet

Programlanmış hücre ölümü (PCD) normal doku homeostazı muhafaza etmek ve embriyolojik gelişimi sırasında doku ve organların ^1,2,6,7 şekillendirmeye yetişkinlerde görülür. Gelişimi sırasında, toksik kimyasallar ve genetik değişiklikler PCD bir artışa neden olabilir veya gelişimsel anomalileri ve doğum kusurlarına ^3-5 sonuçlanan PCD kalıplarını değiştirebilirsiniz. Bu defektlerin etyolojisi anlamak için, embriyo çalışmada embriyonik kök (ES) hücreler ayırt kullanabilirsiniz in vitro tayinlerde ile tamamlanabilir.

Apoptoz kaspaz enzim kaskad etkinleştirmek için sinyal içsel ve dışsal hem de içerir PCD iyi çalışılmış şeklidir. Karakteristik hücre değişiklikleri zarı blebbing, nükleer daralma ve DNA fragmantasyonu içerir. PCD diğer formları kaspaz aktivasyonunun içermeyen ve uzun otofaji ve nihai sonucu olabilir. Ne olursa olsun PCD yolunun, ölen hücrelerin çıkarılması gerekir. Erişkinlerde, bağışıklık hücrelerinin perfembriyolarda, bağışıklık sistemi henüz oluşmamış, nerede kaldırma alternatif bir mekanizma ile oluşur ise, bu fonksiyonu yapýnýz. Bu mekanizma alarak komşu hücreleri ("non-profesyonel fagositler" denir) içeren bir fagositik rol onlar ölüyor hücre ve yutmak ^8-10 yüzeyinde sinyal 'ye beni' tanır. Yutulma sonra, kalıntı bozulması için lizozom getirilir. Böylece bağımsız PCD mekanizması, lizozomal aktivite artışı artan hücre ölümü ile ilişkili olabilir.

PCD, kalın dokular ve çok katmanlı ayırt kültürlerde lizozomlar görselleştirmek için basit bir tahlil incelemek yararlı olabilir. LysoTracker bu tür boya lizozom ^11-13 gibi asidik hücre içi bölmeler içinde tutulan bir yüksek derecede çözünür küçük bir moleküldür. Boya difüzyon ile ve dolaşım yoluyla alınır. Penetrasyon kalın dokular ve çok katmanlı kültürlerinde PCD bir engel, görselleştirme olmadığı ^12,13 mümkündür 14, küçük örnekler, histolojik bölümler ve tek tabakalı kültürler ile sınırlıdır.

Yayılır ve çözücüler tarafından çözülür Anilin mavisi, aksine, LysoTracker Kırmızı DND-99 düzeltilebilir, parlak, ve kararlı. Boyama bütün montaj veya sulu veya çözücü bazlı montaj medya ^12,13 kullanarak bölümünde standart floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntülenebilmektedir. Burada normal ve sonik kirpi boş fare embriyolarının PCD bakmak için bu boya kullanılarak protokolleri tanımlar. Buna ek olarak, ES hücre kültürlerinde ayırt PSD analizi gösteren basit bir miktar yöntem sunuyoruz. Özet olarak, LysoTracker boyama PCD saptanmasında diğer yöntemler için büyük bir tamamlayıcı olabilir.

Protokol

1. Fare Embryolarının LysoTracker Boyama

1. Erkek damızlık kafesi içine genç (5-6 haftalık) kadın koyarak fare embriyoları oluşturun. Bu çiftleşme gösteren bir vajinal fiş görünümü için aşağıdaki sabahları Monitör oluştu. Kadın hamile ise, o gün öğlen 0.5 DPC (gün sonrası çiftleşme) denir. Burada sunulan prosedür embriyolar 7-13 DPC için idealdir.
2. Ilgi embriyonik gününde, onaylı protokollere göre kadın ötenazi ve rahim kaldırmak. Hanks BSS (fenol kırmızısı olmadan) ile 10 santimetrelik bir petri tabağına desidua dan embriyolar çıkarın. Ekstra embriyonik membranlar çıkarın ve en az bir gereksiz doku ve kan kaldırmak Hanks BSS ile yıkayın yok.
3. LysoTracker Embriyo Boyama Çözüm (Hanks BSS 5 mM LysoTracker) hazırlayın. 1-2 litre için uygun bir hacmi 5 ml 'dir. Yavaşça eşit boya dağıtacak karıştırın.
4. LysoTracker Embriyo Boyama Solut embriyo ekle45 dakika için bir mikrofüj tüpü ya da 37 ° C 'de ve flakon inkübe iyon.
5. Hanks BSS çok yavaşça dört kez, 5 dakika, her yıkama yıkayın.
6. Gecede 4% Paraformaldehyde düzelt.
7. Düzeltmesini kaldırmak için, Hanks BSS, 10 dakika içinde bir kez yıkayın.
8. Arka plan boyama ortadan kaldırmak için bir metanol serisi (% 50,% 75,% 80,% 100, 5 dk her adımda) aracılığıyla kurutmak. Bu görüntüleme sırasında iyi sinyal-gürültü elde etmek için önemlidir.
9. Bu noktada ışıktan koruyarak, -20 ° C'de metanol içinde süresiz embriyo örnekleri saklayabilirsiniz.

Not: Bir doku örneği DNA genotipleme için herhangi bir aşamasında alınabilir, ancak, o kadar bu adımı tüm numunelerin toplu işlenmiş olabilir bu yüzden sadece depolama önce bir örnek almak için en uygun olabilir. Her embriyodan kuyruk, bacak veya kafa doku örneği toplayın ve ayrı tüpler içine tüm koymak. Doku örneği rehidrate ve genoty hazırlamakping.

2. ES Kültürleri Farklılaşan arasında LysoTracker Boyama

1. 20 ul damla başına 500 hücre, bir başlangıç ​​yoğunluğunda Asılı damla yönteminde, ¹⁵ aracılığı ile embriyoid organları hazırlayın.
2. 3 gün sonra, 10 cm yapışmaz Petri kapları (bakteriyolojik çalışma için kullanılan bu yani) üzerine süspansiyon kültürü embriyoid organları aktarın. Medya her 2 günde değişen 5 gün, Kültür.
3. Günde 7 günü, jelatinize 8-iyi kamara slaytlara embriyoid organları aktarmak (odalarına Jelatin% 0.1 ekleyin, 5 dakika beklemek kaldırmak ve medya ekleyin). Kamara başına 1-2 embriyoid organları aktarın.
4. Her geçen gün medyanın değişen 10 gün, Kültür. Embriyoid vücut cam yüzeyine takılarak karıştırmayı vermeyecek şekilde odasına slayt köşesinde pipet yerleştirmek için dikkatli olun. Ayrıca taze medya da odanın köşesinde pipet yerleştirin ve ortamı yavaşça serbest eklerken.
5. Kült 10 gün sonraure, bir pozitif kontrol olarak apoptozu indüklemek için, 0.1 mM, 1.0 mM ve _{H2O 2} ile kuyu bazı tedavi etmek için 60 dakika (taze ortam karışımı _{H2O 2} ekleyin, daha sonra hücrelere ilave ediniz). D-PBS ve düzenli medya gecede kültürü ile iki kez durulayın.
6. Yavaşça mevcut medya aspire ve LysoTracker Hücre boyama çözeltisi (ortam içinde 500 nM LysoTracker (nihai konsantrasyon), bölme başına 300 ul) ilave edilir.
7. 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. D-PBS 2 kere, 5 dakika her biri ile iki kere yıkayın.
9. RT 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehid Fix.
10. D-PBS, 5 dakika ile iki kere yıkayın.

3. LysoTracker Vitray Embriyolar veya ES Kültürleri görüntüleniyor

1. D-PBS aspire tarafından mikroskopi için hücre örnekleri hazırlayın; slaydın dışına odasına kaldırarak; hava yaklaşık 5 dakika kurutma; sonra sulu bir montaj orta (DAPI veya benzeri Vectashield) ekleyerek. Kurutma dola sırasında folyo bariyer yerleştiring fluorofor ağartma azaltmak için. Vectashield veya benzer bir derin depresyon cam tabak veya küçük Petri kabındaki embriyolar monte edin.
2. Bir rodamin veya Texas Red filtresi ile donatılmış bir diseksiyon veya bileşik mikroskop ile Visualize (LysoTracker KIRMIZI DND-99, Uyarma / Emisyon: 577/590 nm). Boyanma genellikle oldukça parlak yani uzun pozlama genellikle gerekli değildir.

4. Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Sonuçlar kantifikasyonu

1. Manuel modda aynı pozlama koşulları altında örneklerin dijital fotoğraflar çekin.
2. Adobe Photoshop veya benzeri görüntüleme programı görüntüleri açın. LysoTracker boyanma miktarını belirlemek için, kırmızı kanal ve eşik kırmızı leke şimdi beyaz pikseller ile temsil olduğu gibi görüntü (siyah-beyaz görüntü dönüştürür) seçin. Beyaz pikseller seçin ve toplam sayıyı elde etmek için histogramı işlevini kullanın.
3. Saymak mavi kanal kullanınalanına çekirdeklerin sayısı. Bu görüntü açıklamalar ekleyerek sayısı kaydını tutmak için yararlı olabilir.
4. Değerleri kaydedin ve sonra hücre başına ortalama boyanma düzeyini hesaplamak. Eğer örnek isteyen tüm görüntüler için aynı eşik ayarı ile bu analizi tekrarlayın.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Bu tür Sonic hedgehog (Shh) gibi bir büyüme faktörü geni, ^16,17 çıkartıldığı zaman değişebilir embriyonik gelişimi sırasında PCD normal bir model vardır. LysoTracker derece difüze olan küçük bir moleküldür boya olduğundan, bütün embriyo mezenşimi ^12,13 içinde bile derin PCD alanları değerlendirmek için görüntülenebilmektedir Şekil 1 normal ve Şşş için LysoTracker boyanma paterni gösterir ^-. Azından mutant fare embriyolarına ^{- /} 10.5dpc. Özellikle bacak ve somite regio olarak, mutasyona uğramış embriyoların ^{- / -} Bu aşamada, PCD Shh büyük ölçüde artmıştırns. Embriyo kısımları genel dağılımını değerlendirmek için yüksek büyütme (1B) de tüm montaj içinde görüntülenebilir. Dissected bölümleri de titreşimli mikrotom (1C) veya daha ayrıntılı PCD bölgeleri ortaya çıkarmak için bir kriyostat (DF) ile kesitli olabilir.

Transferaz terminali penetrasyonu daha az sorunlu olduğu TUNEL analizi en iyi ince kesitler üzerinde yapılır. LysoTracker boyama ve bir TUNEL yöntemi ile aynı doku (Şekil 1B-G) de yapılabilir. Bu sonuçlar gösteriyor ki LysoTracker ve TUNEL boyama, oldukça PCD örtüşme genel bölgeler arasında sıkı bir korelasyon 01:01 olmamasına rağmen. Daha yüksek bir büyütmede, bu punktumlarda görmek mümkün olduğunu TUNEL yöntemi ile pozitif leke ancak LysoTracker LysoTracker boya ile sadece leke boya ki, punktumlarda, ve punktumlarda boyama ile üst üste gelmiş.

Bir EB bir jelatin kaplı yüzey üzerine ekildi olduğunda, ayırt edici hücreler migrat olacaktıre dışarıya. Kültür 10 gün sonra, hücreler nöronlar, kas hücreleri, ve kardiyomiyositlerde de dahil olmak üzere hücre tiplerinde ayrışmıştır olacaktır. Şekil 2'de gösterildiği gibi kültürler bu hücre tiplerinin karışık popülasyonları içerir, ancak bir ilgi çekici bir belirli hücre tipi PCD incelemek için protokol adapte olabilir. Örneğin, EB nöronların ¹⁹ farklılaşmasını arttırmak için retinoik asit ile tedavi edilebilir, ve daha sonra LysoTracker tahlil farklı koşullar altında nöronal hücre ölümünü değerlendirmek için kullanılabilir. ES farklılaşmış hücrelerin normal kültür olarak, LysoTracker ve / veya TUNEL analizi (Şekil 2A) ile PCD tabi tutulurlar ve bu tespit edilebilir bir kaç hücre vardır. PCD oksidatif hasara neden olur ve apoptotik yolu ^20,21 başlatır örneğin hidrojen peroksit gibi farklı sitotoksik ajanların bir dizi _{(H2O 2)} ile indüklenebilir. H ₂ O ₂ A düşük doz hem artırırLysoTracker ve TUNEL boyama, hiçbir tedavi ile karşılaştırıldığında hücre büzüşmesi ve yaygın LysoTracker ve TUNEL pozitifliği yüksek doz sonuç ederken. Embriyo sonuçlarına benzer şekilde, punktumlarda görmek mümkün olduğunu TUNEL yöntemi ile pozitif leke değil LysoTracker LysoTracker boya ile sadece leke o boya, punktumlarda ve punktumlarda boyama örtüşen bununla. Apopotosis neden olan sitotoksik bir ajan uygulanması sonucu otofaji (Şekil 2B) indüklemek açlık serum koşullar ile karşılaştırılır. Serum açlık (1 saat) bir süre geçirmiş Hücreler LysoTracker ve TUNEL boyama yüksek korelasyon farklı bir model sergiler. LysoTracker boyama çok işlenmemiş kültürler karşılaştırıldığında artmış, ancak TUNEL pozitifliği normal seviyelerde olduğunu.

Adobe Photoshop mevcut standart araçları kullanma, LysoTracker boyama basit bir eşikleme yöntemi ile ölçülebilirbu bir hücre popülasyonunun için ortalama leke seviyesini hesaplamak için izin verir. Şekil 3A-B, bir numune görüntü ölçümü sırasında görünümünü göstermektedir. Mavi kanal (panel 3A) kırmızı kanal ve DAPI lekeli çekirdeklerinde LysoTracker boyama ile temel görüntü ile başlayarak, bu görüntünün kırmızı kanal siyah-beyaz görüntü dönüştürmek ve beyaz pikseller vardı için eşiklenir edildi sonra seçilen ve (Şekil 3A ') sayıldı. Bir eşik seviyesi LysoTracker boyanması temsil ettiği seçilmiştir. Görüntüleri kullanan herhangi bir nicel yöntem olduğu gibi, potansiyel olarak aşırı vurgu farklılıkları neden olabilir bu gibi resimleri ışığa maruz kalmaması için önemlidir. Alanında çekirdeklerin sayısı sonra sadece mavi kanal (Şekil 3B) bakarak ve (Şekil 3B ') sayma yaparken böyle bir fırça gibi bir çizim aracını kullanarak çekirdeklerin işaretleyerek sayılabilir. Bir sonra inci ifade edebilirhücre başına boyama ortalama seviyesi hesaplayarak boyanma e seviye (piksel / çekirdeklerin sayısı sayısı). Bir dilek yüksek yoluyla-put taraması için bu algoritmayı kullanmak için, en tarama paketleri belirli bir kanalın parlaklık ölçmek ve aynı zamanda en tipik uygulamalar için manuel yöntem hızlıdır ancak, bir alandaki çekirdekleri sayabilir ve olacağı bir nesne tanımlayıcı işlevi olabilir basit. Bir örnek vermek gerekirse, Şekil 2A-C örnek bir bölge ölçülmesi ve sonuçların teyit ettiği LysoTracker boyanma düzeyi yüksek (Şekil 3C) H ₂ O ₂ sonuç konsantrasyonu artmaktadır. Edildi

Şekil 1. ^{/ - -} Embriyo normal ve Şşş yılında LysoTracker boyama. A, A 'Normal ve Sus ^{-. / -} LysoTracker Kırmızı ile boyanan 10.5 DPC, az fare embriyolarına Vectashield monte ve altında fotoğraflandıBir epiflourescence mikroskop diseksiyon. Konsollar ayakları yerini gösterecektir B, B 'normal ve Şşş ve yüzgeç ^{-.. / -} Embriyoların yüksek büyütmede görüntülenmiş. 'Arka Nekrotik Dilimi' (yıldız ile işaretli) ve ekstremite tomurcuğu (bir ok ile işaretli) proksimal mezenşimi bir bölge de dahil olmak üzere hücre ölümü normal bir etki unutmayın. Şşş boş bacaklarda medial ve distal bölümünde kuvvetli boyanma gösteren Normal ve null hem ekstremite tomurcukları ön ayakları tomurcuk aracılığıyla. C, C '. Medial bölümleri. Boş ekstremite tomurcuğu içinde normal ekstremite tomurcuğu ve dorsal ve ventral ve distal mezenşimi içinde güçlü boyama proksimal mezenşimi (ok) ve AER (ok başı) olarak boyanma varlığı unutmayın. DF. Aynı bölümde (12 mikron, dondurulmuş bölümü) LysoTracker ve TUNEL boyama (Roche 1684795) için görüntülendi. Bölüm Shh boş mesenc distal kısmına geçerhyme. AER ok ucu noktaları. Genel görünüm, her iki yöntem kullanılarak çok benzer ne kadar Bununla birlikte boyama tam olarak üst üste gelmez. G, G '. AER ve mezenşim daha yüksek bir büyütmede, bir ya da LysoTracker TUNEL-pozitif olan punktumlarda varlığı hem de görebilir Sadece yanı punktumlarda sıra boyama örtüşen olduğunu.

Şekil 2. Farklılaşmış ES hücreleri içinde LysoTracker boyama. Hücre ayırımı yapmak LIF yokluğunda oda 8-slaytlar üzerine ekildi. Otofaji yolun serum açlık 1 saat ile oluşturuldu ise LysoTracker ve TUNEL boyama karşılaştırmak nasıl göstermek için, apoptoz yolu, H ₂ O ₂ 2 farklı dozda oluşturuldu. Bu görüntüler bir Zeiss YTM 5 Konfokal Mikroskop ile alınmıştır A-A'':. LysoT tarafından belirtildiği gibi İşlenmemiş kültürlerin bazı normal apoptozisi göstermekRacker ve TUNEL boyama. Çoğunlukla iki teknikler örtüşmektedir (beyaz oklar) kullanarak desen, ancak, bir LysoTracker sadece pozitif (kırmızı oklar) bir kaç punktumlarda görebilirsiniz B-B'', CC ":. H ₂ artan miktarlarda tedavisi O ₂ apoptozisi uyarır . düşük dozda daha LysoTracker ve Nokodazol göre TUNEL pozitif punktumlarda gösterir. yüksek dozda daha LysoTracker ve TUNEL pozitif punktumlarda yol açmaktadır. Beyaz oklar çakışan boyama, sadece LysoTracker için olumlu olduğunu punktumlarda kırmızı oklar ise. Bu TUNEL boyama (yeşil oklar) için pozitif olan punktumlarda görmek mümkündür DD ":. açlık serum lizozomlar ve autophagolysosomes malzemenin bir birikiminin teşvik edebilir ki, otofaji neden olabilir. Işlenmemiş kültürler karşılaştırıldığında görülebilir daha kaç LysoTracker punktumlarda unutmayın. TUNEL pozitif punktumlarda mevcut (çoğu LysoTracker leke örtüşening, beyaz oklar), ancak, sayı işlenmemiş şartlara göre büyük ölçüde artmış değildir. Buna ek olarak, açlık serum koşullar altında, LysoTracker yalnızca pozitif punktumlarda oldukça yaygındır (kırmızı oklar).

Şekil 3,. Adobe Photoshop kullanarak hücre popülasyonunda boyama düzeyini değerlendirmek için Sayısallaştırma yöntemi. A: Şekil 2A bir kısmı seçildi ve LysoTracker (kırmızı kanal) ve DAPI boyama (çekirdekler, mavi kanal) Bu panelde gösterilir A ':. Şekil 3A kırmızı kanal siyah-ve dönüştürmek için eşiklenir edildi image-beyaz. Beyaz pikseller seçilir ve histogram fonksiyonu kullanılarak sayabiliriz B-B ':. Kanal mavi çekirdekler gösterir ve onları sayma yaparken, görüntü gibi bir fırça gibi bir çizim işlevi ile açıklamalı olabilir C:. Bu expaneller 2A-C örnek bol miktar. Veri çekirdeği başına piksel olarak temsil edilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Apoptoz Önemli diğerlerinden ayıran kaspaz aktivitesinin tespiti ile birlikte TUNEL yöntemi ile DNA hasar tespiti, (mAb veya ZVAD-FMK olarak bağlayıcı bir molekül ile algılanır), hücresel değişikliklerin gözlenmesi ve fosfatidilserin sunumu (PS dahil membran yüzeyinde) (Annexin V bağlama tarafından algılanır). Bu testlerin her biri ile bazı dezavantajları vardır. Örneğin, TUNEL yöntemi içinde kullanılan terminal transferaz birkaç hücre tabakası ötesine nüfuz etmez. Ayrıca Annexin V gibi ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket		Katalog numarası
LysoTracker Kırmızı DND-99	Invitrogen	# L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VEKTÖR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-esansiyel amino asitler	Cellgro	25-025-CI
Sodyum piruvat	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Kalem-Strep	Invitrogen	15140-122
b-merkaptoetanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LABTEK-II Odası slaytlar (8-de)	Nalge Nunc Uluslararası	154534
% 0.1 jelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Çözüm Tarifler 4% Paraformaldehyde 100 ml için: 4 g paraformaldehit, 90 ml H2O, ve NaOH (2N NaOH, bir damla) karıştırılır. Eğer pH artırmak için bazı NaOH kadar paraformaldehid çözüm girmeyeceğim. 60 karıştırın ve ısı ° C Tüm toz çözüm (~ 10-20 dakika) kadar. Isıtmayın. 100 ml'lik bir nihai hacim elde etmek için ~ 10 ml PBS 10x ekleyin. Uygun (~ 10 mi veya ~ 40 mi) alikots içinde -20 ° C'de saklayın. Uyarı: 'fırfır' şeklinde (ufak topaklar sıkıştırılmış) içinde paraformaldehit daha az toz halinde olan ve bu nedenle de bir başlık dışında ölçülebilir. Ancak yine de bir koruyucu toz maskesi (N95 giymeliEn az) kullanım sırasında. EB Kültür Medya 500 ml EB Medya için: DMEM: 404.5 ml'lik FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 mL Penisilin / Streptomisin: 5.0 mL Non-esansiyel amino asitler: 5.0 mL Sodyum piruvat: 5.0 mL β-mercaptoethanol: 500ul