Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Özet

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Özet

Geçen yıllar boyunca, akciğer immün regülasyon çeşitli yönleriyle alveolar tip II epitel hücreleri (AECII) katkısı giderek kabul edilmiştir. AECII iltihaplı hava yollarında sitokin üretimini katılmak ve enfeksiyon ve T-hücre aracılı otoimmünite ^1-8 hem de hücreler antijen sunan bile hareket etmek gösterilmiştir. Bu nedenle, bu tür hava yolu hiper reaktivitesi gibi klinik bağlamlarda da özellikle ilginç yabancı ve hem de self-antijenlere doğrudan veya dolaylı AECII hedef enfeksiyonlar. Bununla birlikte, sağlıklı akciğer yanı sıra enflamasyon alveolar tip II epitel hücreleri tarafından sunulan ayrıntılı immünolojik işlevlerini anlaşılmasında düzensizdir. AECII fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma ^9-12 fare, veya insan alveoler epitel hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Hücre hatları ile çalışmak kesinlikle böyle büyük sayılar durumu o gibi, faydaları sunarkapsamlı analizler için f hücreler. Bununla birlikte, birincil murin AECII kullanımı ile enfeksiyon ya da otoimmün iltihabı gibi karmaşık işlemler olarak bu hücre tipinin rolü daha iyi anlaşılmasını sağlar inanıyoruz. Primer mürin AECII bunlar analiz ortamında bir rol oynayan ek dış faktörler işlemine tabi tutulmuştur, yani bu gibi solunum durumları olan hayvanlardan doğrudan izole edilebilir. Bir örnek olarak, uygun intranazal AECII öncelikle çoğaltma ¹³ için bu hücreler hedef grip A virüsü ile enfekte olan fareler izole edilebilir. Önemlisi, sağlıklı farelerin izole AECII ex vivo enfeksiyon yoluyla, enfeksiyon üzerine monte hücresel cevaplarının çalışmalar daha uzun olabilir.

Birincil mürin AECII ve izolasyon için protokol, CD11c, CD11b, F4/80 için spesifik antikorlar ile elde edilen hücre süspansiyonu etiketleme ardından fare akciğer enzimatik sindirim dayanmaktadırCD19, CD45 ve CD16/CD32. Granül AECII sonra yüksek etiketsiz ve yan dağılım (SSC ^yüksek) hücre popülasyonu olarak belirlenmiş ve ³ sıralama floresan aktive hücre ile ayrılır.

Fare akciğerlerinden primer epitelyal hücreler izole alternatif yöntemler karşılaştırıldığında, negatif seçimin AECII akım sitometri izolasyonu için bizim protokol nispeten kısa bir süre içinde dokunulmaz, son derece canlı ve saf AECII verir. Buna ek olarak, ve kaydırma ve lenfosit azalması ile izolasyon geleneksel yöntemlerin aksine, antikor-coupled manyetik boncuklar ^{14, 15} bağlayıcı aracılığı ile, akış sitometrik hücre-hücre boyut ayırma ve ayrıntı ile ayırt etme izin verir. Akım sitometrik hücre sıralama için enstrümantasyon kullanılabilir olduğunu göz önüne alındığında, açıklanan prosedür nispeten düşük maliyetle uygulanabilir. Standart antikor ve akciğer dağılma için enzimler, manyetik olarak herhangi bir reaktif madde yanındaboncuklar gereklidir. İzole hücrelerinin in vitro kültürü ve T-hücre uyarma deneylerinde de transcriptome, proteom veya secretome analizi ^{3, 4,} olarak dahil işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Protokol

Gerekli reaktifleri ve materyalleri ilişkin ayrıntıları aşağıda protokolünün sonunda tabloda listelenmiştir. Çalışmaya başlamadan önce, 4 dispase ml ve ° C su banyosunda 37 öncesi ılık bunları içeren 15 ml tüpler (fare başına bir) hazırlamak. Bir ısıtma bloğu, kısaca 95-1% düşük erime agaroz (su) küçük alikotları ısıtmak ° C sıvılaştırılmış kadar ve kullanıma kadar 45 ° C ye sonradan serin.

1. Fare Akciğer hazırlanması

1. CO ₂ boğulma tarafından fare Kurban. Not: başarıyla yapılamaz, böyle bir sıvı ile akciğer kurulum gibi, protokol adımları izleyerek, böylece bu trakea yaralama gibi servikal dislokasyon yapmayın. Nosiseptif reflekslerinin kaybı olun.
2. Etanol ile fare Sprey ve vücut ventral orta hat boyunca uzun bir kesim yapmak. Ventral kürk ve deri çekin ve daha sonra da dikkatlice kesilmiş ve periton çıkarın.
3. ExsanguinateSağ ve sol juguler ven (laktasyonun) yanı sıra renal arter (Arteria renalis) keserek fare. Doku ile akan kan çıkarın.
4. Dikkatlice sonra delinme ve kaburga keserek kalp ve akciğer maruz sökmek. Akciğer kesmemeye özel dikkat gösterin.
5. Soğuk fosfat dolu bir 26G kanül ve 10 ml şırınga ile salin (PBS), ponksiyon kalbin sağ ventrikül tamponlu ve kan serbest kadar PBS ile akciğer serpmek.
6. Trakea maruz tükürük bezlerinin kesin ve çıkarın. Ayrıca dikkatle trakea çevreleyen kas kesti.
7. Trakea içine 22G kanüllerin yerleştirin, iğneyi çıkarın ve akciğer doğru plastik kateter itin. Trakea ve kateter etrafında iplik küçük bir parça bağlayarak kateter Fix.

2. Akciğer Doku Enzimatik Sindirim

İsterseniz, bronkoalveoler lavaj sıvısı örneği olabiliradımdan önce PBS veya orta trakea takılı kateter yoluyla akciğerlere kızarma tarafından hazırlanmıştır.

1. 2 ml'lik şırınga yardımıyla, her lobun tam olarak genişletilmiş, böylece kateter yoluyla akciğer içine dispase 2 ml (4 ml bir örnek gelen) bir maksimum hacim aşılamak. Sıvılaştırılmış agaroz 0.5 ml içeren 1 ml şırınga ile şırınga değişim ve aynı zamanda akciğer içine aşılamak.
2. Agaroz geri akışını önlemek ve hemen laboratuar kağıt mendil ve buz ile akciğer karşılamak için kateter üzerinde şırınga bırak. Birkaç dakika için agaroz jel olsun.
3. , Kağıt mendil, buz, şırınga ve kateter çıkarın trakea ve tüketim akciğer, kalp ve göğüs timus kesti. Sonra PBS ile bir tabak içinde akciğer durulayın ve kalp, timus ve kalan trakea çıkarın.
4. Dispase geri kalan kısmı 2 ml akciğer içine yerleştirin ve 45 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.

3. Akciğer hazırlanmasıHücre Süspansiyon

1. Dispase gelen akciğer çıkarın ve DMEM ortamı ve 100 ul içinde DNase anti-CD16/32 antikor 7 ml (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir çanak içine aktarın.
2. Forseps kullanarak, tamamen ayrı çekerek akciğer doku parçalanır ve yavaşça 200 rpm ayarlanmış bir rocker üzerinde sallanan ise oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Arzu edildiği takdirde, hücre süspansiyonu daha sonra bir sonraki adıma kadar 4 ° C de muhafaza edilebilir.
3. 100 mikron ve daha sonra 70 mikron, 48 mikron ve 30 mikron gözenek ile ilk naylon kafesleri yoluyla hücre süspansiyonu filtre. Hücre kaybını en aza indirmek ve verimi en üst düzeye çıkarmak için de DMEM ile tüpler ve iyice yemekleri gibi her örgü durulama özen gösterin. Eğer örnek birleştirilmesi, bu daha sonra aynı filtre ile bir grup farelerden alınan hücreler süspansiyonlar geçerek burada elde edilebilir. Tıkanma durumunda filtre yenileyin.
4. Hacmine bağlı olarak, bir tane ya da daha fazla 50 mL tüpler ve süzüntü aktarmak160 x g 'de 15 dakika, 4 ° C'de santrifüj Süpernatantı.
5. 2 ml eritrosit lizis tamponu (0.15 M _NH4CI, 0.01 M KHCO _3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2) içinde yeniden süspanse edin ve hücre peleti hızla DMEM ortamı 13 ml ilavesiyle lizis sona erer. 160 x g'da 12 dk, 4 ° C'de bir 15 ml tüp ve santrifüj çözelti aktarın

4. Akış Sitometrik Hücre-sıralama için Antikor Boyama

1. Akış sitometrisi için uygun dilüsyonlarda DMEM ortamı içinde hazırlanmış, 3 ml birincil antikor kokteyli, hücrelerin yeniden süspanse edin. (Antikorlar, önceden 100 ul bir hacim içinde 1 x 10 ⁶ splenositlerin lekeleme ile optimum çalışma dilüsyonları için titre edilmiştir. Kullanımlar beş fare kadar birikintilerini hücreler için kullanılan antikorların her biri için optimum konsantrasyonu ihtiva eden birincil antikor kokteyli 3 ml. Daha fazla fareler bir örneğe toplanmış ise,) seviyesini ayarlamak.
2. Boyanması için, karanlıkta 10 dakika için hücreler inkübe4 ° C'de
3. 12 160 x g'de ve 4 dakika için santrifüjleme ile DMEM ortam ile 15 ml tüp doldurma ile yıkayın hücrelerini ° C.
4. Halinde ya da bağlanmamış biotinlenmiş antikorları 4.1 kullanılmıştır: süpernatantı ve 2 hücreleri tekrar süspansiyon - 3 ml ikincil antikor kokteyli. Karanlıkta 4, 10 dakika ° C'de Leke.
5. 160 x g'da 12 dk, 4 ° C ve DMEM ve santrifüjleme ile tüp doldurma yoluyla yıkayın hücrelerini
6. Hücre-sıralama için bir tüp içine bir 50 um filtre aracılığıyla DMEM ve ön-filtre, 1 ml hücre yeniden süspanse edin. İsteğe bağlı: akciğer hücre süspansiyonu toplam hücre sayısını elde etmek için hücreleri saymak.

5. Hücre-sıralama

1. Sıralama önce vorteks hücreleri karıştırın. AECII hücre-sıralama için 100 mikron nozul kullanın. Kılıf sıvı basıncı hem de lazer emisyon ve saptama dalga boyları akış sitometrik hücre-sıralama gibi antib kullanılan florokromlar için kullanılan cihaza bağlıdırody boyama işlemi.
2. DMEM içeren bir tüpe boyama ve sıralama için kullanılan florokromlar için negatif SSC ^Yüksek hücreleri üzerinde Kapısı. (SSC-A) pencereler (içinde yolluk stratejisinin ayrıntılarını gördüğünüz herhangi çiftler veya hücre agrega dışlamak için dağılım yüksekliği (FSC-H) vs alanı (FSC-A) ve yan dağılım yüksekliği (SSC-H) vs alanında ileri kullanın 1) Şekil.
3. 20 280 xg'de dk ve 4 kriteri hücreler santrifüj toplamak amacıyla ° C.
4. Daha sonraki analiz için gerekli olan kültür ortamı ya da tampon olarak hücreler yeniden süspanse edin.

Sonuçlar

Sağlıklı farelerden izole akciğer hücre süspansiyonları sıralama yapılırken AECII kapısı genellikle yaklaşık 42 hesap verecek ± tüm olayların 10%. Bu yüzde, başlangıçtaki hücre süspansiyonu solunum yolları için işe lenfositler ve diğer bağışıklık hücrelerinin oldukça yüksek oranda içerecek şekilde, örneğin bir viral enfeksiyon gibi solunum koşullar ile farelerin kullanılması durumunda belirgin ölçüde daha düşük olabilir. Günde 3 Aşağıdaki enfeksiyonu IAV enfekte akciğ...

Tartışmalar

Flow sitometri ile murin AECII ve izolasyonu için bizim protokol fonksiyonel ve moleküler çalışmalar bir dizi için fare akciğer primer hücrelerin erişmenin hızlı bir yol sunar. Açıklanan prosedür böyle bir RNA izolasyonu (şekil 2b bakın) ve transcriptome çalışmaları gibi doğrudan sonraki analizler için sayıca yeterli AECII son derece canlı ve saf popülasyonlarının verir. Fonksiyonel uygulamalar için, AECII şartlandırılmış ortam ya da ko-kültür deneylerinden elde edile...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
kanüllerin Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml (5000 caseinolytic birimleri)	BD Biosciences	354235	15 ml tüp içinde 4 ml kısım, -20 ° C de saklamak
Biozym Plak Agaroz	Biozym	840101	H2O içinde% 1 w / v
Sığır pankreas, 2000 Kunitz birimleri / şişeden deoksiribonükleaz Ben	Sigma-Aldrich	D4263	taze 300 ul DMEM 1 flakon içeriği çözülür
DMEM	Gibco	22320-022	kullanılan üreticisi (Low G tarafından sağlananlucose, Piruvat, HEPES)
hücre süzgeçler (100 mikron, 75 mikron)	BD Falcon	352.360, 352.350
naylon elekten (48 um, 30 um)	Buckmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 um bir filtreden	Partec	04-0042-2317
anti-fare CD16/CD32	BioLegend	101302	klon 93; arıtılmış
anti-fare F4/80	BioLegend	123116	klon BM8; APC kuplajlı
anti-fare CD11b	BioLegend	101208	klon M1/70; PE kuplajlı
Anti-CD11c fare	BioLegend	117310	klon N418; APC kuplajlı
anti-fareCD45	BioLegend	103102	klon 30-F11; saflaştırılmış
anti-fare CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE kuplajlı
poliklonal keçi anti-fare IgG	BD Pharmingen	550767	poliklonal, PE kuplajlı
			Alternatif florokromlar ile birleştirilen antikorlar mevcut akış sitometresi ve lazer bağlı olarak kullanılabilir.