Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

Özet

Ayrıca yeni bir tanımlamak In vivo Görüntüleme tekniği bu kafa içi pencereler ve yüksek çözünürlüklü 2-foton mikroskopi ile çiftler floresan kimerik fareler. Bu görüntüleme platformu yardımcıları patolojik hakaret sonrasında bir tek hücre düzeyinde beyin dokusunda ve mikrovasküler dinamik değişiklikler, çalışmaları ve intrakranial ilaç dağıtım ve dağıtım değerlendirmek için uyarlanabilir.

Özet

Biz başarıyla entegre önce intrakranial doku yapısı değişiklikleri doğrudan uzun vadeli görselleştirme sağlayan yeni bir platform geliştirmek için intravital ile 2-foton konfokal mikroskopi Kafa içi pencere (ICW) teknolojisi ^1-4 kurduk. Gerçek zamanlı şekilde tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme doku 'anlık görüntü' kesitlerde sadece bakar standart son nokta histolojik analiz, tarafından sağlanan ötesinde ek dinamik bilgi sağlar.

Floresan kimerik farelerde bu intravital görüntüleme tekniği kurulması, biz aynı anda görüntü dört floresan kanal edebiliyoruz. Bu GFP gibi + kemik iliği içeren floresan etiketli hücreleri tarafından, bu doku içinde uzun vadeli göç, entegrasyon ve farklılaşma okuyan bu hücrelerin kaderini izlemek mümkündür. Böyle bir MCherry glioma tümörünün hattı gibi bir ikincil raportör hücre, daha fazla entegrasyon karakterize sağlarhücre etkileşimleri: hücre dirilen. Doku mikro yapısal değişiklikler örneğin CD31 etiketli antikorlar ve Dekstran moleküller için, içi hayati boyalar ve antikor eklenmesi ile vurgulanmış olabilir.

Ayrıca, iyonize radyasyon uygulamasından sonra meydana gelen dinamik doku değişiklikleri değerlendirilebilir, üzerinden bir platform oluşturmak, stereotaktik radyoterapi sağlayan küçük bir hayvan mikro-ışınlama ile ICW görüntüleme modeli kombinasyonu tarif.

Bizim modeli Mevcut sınırlamaları beyin dorsal eksenine görüntüleme sınırlayan alt kortikal yüzeyinden 900 mm kadar bir derinliğe kadar sınırlıdır, mikroskop penetrans içerir. Kafatası kemik varlığı şu anda meme dokusu ve yağ yastıkları ^5-7 incelemek için kullanılan daha kurulmuş ve kullanılan odasına modellere göre, ICW daha zorlu bir teknik işlemi yapar. Buna ek olarak, plaka ile ataides pek çok sorun görüntüleme optimize.

Giriş

Çeşitli patolojilerin tepki olarak beyinde ortaya çıkan yapısal değişiklikler ve biyolojik ve terapötik müdahalelerin daha iyi anlaşılması, tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir. Ancak, özellikle kafa içi patolojiler ile ilgili, bu yapısal ve biyolojik değişiklikler eğitim mevcut zorluklardan biri, doku erişilememesi ve zamansal evrimi ve in vivo ortamda bir değişim dinamik ilerleme incelemek için yetersizliğidir. "Pencere" teknoloji üretimi daha önce ^5-7 tümör gelişimi ile yumuşak doku değişiklikleri inceleyerek başarılı kanıtlamıştır. ICW modellerinin geliştirilmesi daha teknik zorlu, altta yatan beyin dokusunda enfeksiyon kışkırtmak üzerinde zarar vermeden kafatası kemiği kaldırmak için gerekliliği nedeniyle olduğunu kanıtlamaktadır. Önceki kağıtları yüksek çözünürlüklü net im üretmek için, ancak doku ^8-10 görselleştirmek için kafatası inceltmek için çalıştılarkafatası kemik yaşları tam çıkarılması ^11. gereklidir. Uzun süreli görüntüleme (30 gün +) ancak son zamanlarda görüntüleme ^1,11 ile uygun bir seçenek haline gelmiştir tekrarlayın, daha önce kısa zaman dilimlerinde ⁵ incelenmiştir.

Son on yıl içinde önemli bir hedef tümörlerin tedavisi için yeni terapötik hedefler sağlamak için, tümör oluşumu ve ilerleme yanıt olarak, özellikle, neo-damar sistemi aşağıdaki patolojik uyaranların kökenli aydınlatmak için olmuştur. Çok tartışma tümör gelişimi ya da aşağıdaki radyasyon sırasında beyinde yeni damar kaynağı etrafında kalır. Geleneksel olarak vaskülarizasyon anjiyojenez, yeni damarlar önceden var olan gemiler ¹² filizlenmesi ikinci oluşturan bir işlem boyunca ortaya olarak kabul edilmiştir. Daha yeni çalışmalar, ancak, vaskülogenez ve önceden tahmin embriyonik süreç patolojik damar oluşumu, daha önemli bir rol oynuyor olabilir düşündürmektedir. Vasculogenesis da daha sonra doğrudan yeni damar endotel ^12-14 oluşumuna katılan kemik iliğinden yetişkin angioblast meslektaşları istihdamı içerir. Biriken deliller endotel öncü hücreler onkojenik aracılar ^15-17 yanıt olarak de novo damar oluşumu başlatmak için kemik iliğinden seferber olduğunu gösterir. Ancak bu çalışmalar patolojik uyarıcı ve tedaviye ^18-21 yanıt türüne değişen yüzde katkı ile damar endotel bu kemik iliğinden elde edilen hücrelerin doğrudan katkı (BMDCs) için çelişkili kanıt.

Bu nedenle, tümör damar içine ve tedaviye yanıt olarak BMDC entegrasyon sürecinin tekrar uzun süreli çalışma için yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme izin tekrarlanabilir deneysel yöntemler kurulması ölçülemez. Standart histolojik teknikler dinamik bulu sağlamak için başarısızformasyonu yeni damar oluşmasına neden olabilir ve bu yüzden kesin hücre etkileşiminin mekanizmaları göstermek olamaz hücrelerinin uzun süreli hayatta kalma, farklılaşma ve entegrasyon belirlemek için gereklidir.

Biz intrakranial iyonizan radyasyon ve tümör büyümesini hem de takip BMDC işe değişen derecelerde, ancak bir işe alım, patoloji özel konum ve değil tüm tümöral doku ^11,22 bir işgal olduğunu bizim deneysel yaklaşım kullanarak göstermiştir. Biz işe tek bir hayvan ^11,22 tekrar tekrar görüntüleme gösterdiği bir zaman duyarlı bir yol izler göstermiştir. Floresan etiketli tümör hücreleri doğrudan kendi endotel oluşturmak için tümör hücre transdiferansiasyon olasılığını vurgulamak için endotel hücreleri için içi hayati CD31 antikoru ile görüntülü ve takip edilebilir sayede Benzer şekilde, in vivo görüntüleme de tümör hücresi taklit içine değerli bilgiler sağlayabilir.

Modelin çok yönlülük hücresel ve biyolojik süreci değişen çalışma için kombinasyonları kapsamlı bir dizi sağlayan, görüntü 4 floresan kanal yeteneği ile geliştirilmiştir. Biz aynı anda zaman içinde tekrar tekrar tek bir alanda, intravitally görüntü CFP (mavi), GFP (yeşil), Kiraz / RFP (kırmızı) ve Alexa647/APC (uzak-kırmızı) edebiliyoruz. Araştırmacılar genetik olarak özel ilgi yapısal değişiklikleri vurgulamak için kanallarının yanı sıra satın alma boyalar ve antikorların her biri için fluorochromes ifade hücreleri değiştirebilirsiniz. Yaygın çalışmalarda kullanılan boyaların ve antikor Bugüne kadar CD31 ve dekstran dahil olan her iki vurgulamak Bu amaçla uzak-kırmızı kanalı kullanılmaktadır, ancak her ikisi de diğer kullanım için uygun olan mikro-damar ve doku ^1,11,23,24 meydana gelen değişikliklerin, kanalları bahsetti. Benzer şekilde, Sytox apoptoz alanları vurgular Portakal, ve bu şirket Visen gelenler gibi işaretleri dahil olmak üzere diğer boyalar, SPE olmuşturcifically in vivo kullanım için tasarlanmıştır. Bahsedilen dört yaygın olarak kullanılan floresan kanalları, bundan başka, ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal eklenebilir ve damar çevreleyen bazal membran görselleştirme, görüntü modelinin ⁷ endojen kollajen lifleri için optimize edilmiştir.

Bizim modelin uyum, hem de yukarıda bahsedilen hücre-hücre etkileşimleri göstermek için, ilaç-hücre etkileşimleri incelemek mümkün olmuştur. Biz AMD3100, bir SDF-1 inhibitörü ve BMDC işe ¹¹ dahil ağları sinyal rolü gibi ilaç inhibitörleri baktım. Aynı şekilde biz genetik bir GFP molekülüne bir IRES ile birlikte VEGFTrap, bir VEGF inhibitörü ^25, ifade etmek U87 glioma xenografts hücreleri tasarladık. TTT + BM kullanarak biz VEGF damar için BMDCs istihdamı üzerindeki rolünü çalışmak edebiliyoruz. En son biz mec bakarak ilaç kinetik çalışma modeli kullanmış olmasıBir hücresel düzeyde tümör sınırlarını belirleyen ilaç Floresein ^26, arkasında hanism. Aracılığıyla bir özel inşa biz tedavi için tümör ve BMDCs hem de yanıtı değerlendirmek için stereotaktik teslim radyasyon entegre mümkün olmuştur evin küçük hayvan ışınlayıcı içinde.

Bizim yeni intravital görüntüleme yöntemi araştırmacıların kullanımı sayesinde doku değişiklikleri birçok fonksiyonel ve biyolojik özelliklerinin aydınlatılması yardım, çeşitli patolojiler ve sistemlerinde meydana gelen tek hücreli gerçek zamanlı değişiklikleri anlamak olacaktır.

Protokol

TÜM HAYVAN İŞ BİR HAYVAN BAKIM ALTINDA GERÇEKLEŞTİRİLEN VE KULLANIM KURULU TÜM İLGİLİ İLKELER, KURALLAR VE MEVZUAT KURUMLAR UYGUN PROTOKOL ONAYLI VE İDAM EDİLMİŞTİR.

Sorun giderme referans Tablo 2 için.

1. Kemik İliği Sulandırma (İsteğe bağlı) Şekil 1 (30 dakika hazırlık, fare başına 5 dakika)

Tüm cerrahi otoklav steril ekipmanları ile sıkı aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır.

Bir donör fare sulandırmak üç ana fareler olacak.

1. Gammacell 40 'exactor' ışınlama en merkezi içinde, baş korumak için kurşun ile Anesteziyoloji alıcı NODscid fare ve konumu,.
2. 2.5 Gy total vücut ışınlaması (TBI) ile NODscid fareler ışın tedavisi.

KRİTİK ADIM: TBI optimizasyonu nedeniyle yeterli konak immün ce için gereken doz değişimi için gerekli olabilirfarklı fare suşları ll tükenmesi.

Duraklama noktası: Ana fareler önceden ışınlanmış olabilir ama aydınlatarak 24 saat içinde kullanılmalıdır.

3. Kurumsal hayvan bakımı komitesi kurallarına göre donör fareler Euthanize. Arka ayaklarında temizleyin ve kemikler (Şekil 1ai, 1aii) tüm aşırı doku sıyırma, hem tibia ve femur çıkarın.

KRİTİK ADIM: Fibula kemikleri çok dar lümen nedeniyle kullanım için uygun değildir.

4. Dört çıkarılan kemiklerin her iki uçtan uç plakaları çıkarın ve görünümü (Şekil 1aiii) beyaz kadar bir 22 G iğne ve 1 ml steril PBS kullanarak onları yıkayın. Başvuru Tablosu 2.
5. De çıkarılan kemik iliği (BM) süspansiyon karıştırın ve üç 27 G tüberkülin iğne içine 300 ul çizin. Çıkarılan BM yaklaşık 2 x 10 ⁷ hücre içeren ve gerektiği3 ana fareler reconstitutions için yeterlidir. Başvuru Tablosu 2.
6. Adım 1.1 (Şekil 1b) üç daha önce ışınlanmış NODscid farelerin lateral kuyruk ven içine süspansiyon enjekte edilir. Başvuru Tablosu 2.

DİKKAT: BM sterilite kontrol etmek için biz enfeksiyon kontrol etmek için 24 saat boyunca kalan BM ve kültür kaplama tavsiye enjekte. Bu noktada ölüm başlıca nedeni yeni sulandırılmış farelerde enfeksiyondur.

2. Kafa içi Pencere Üretimi - Şekil 2 (fare başına 30 dakika)

Tüm cerrahi (Şekil 2A) hayvanları sıcak tutmak için otoklav steril ekipman ve bir ısı lambası altında sıkı aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır.

1. IACUC onaylı anestezi, 0.5 Avertin IP enjeksiyon ile Anesteziyoloji alıcı NODscid fareler kafa korumak için kurşun mg / g ve pozisyon, ortasına içGammacell 40 'exactor' ışınlama. Kafa derisi saç kaldırmak. Ayrıca kornea su kaybını önlemek için göz yaşartıcı jel uygulayın.
2. Sonra Betadine çözüm ve alkol ile ilk temiz kafa derisi, sonra sadece gözleri yukarıda kulak orta noktası bir kesi yapmak. Kafatası ve kafatası yüzeyinin yerlerinden (Şekil 2BI) açığa, kafa derisi 3 mm ya ilk kesi yan çıkarın.
3. % 2 lidokain enjekte edilerek periost Elevate: epinefrin çözüm ve kafatası yüzeyi (Şekil 2Bii) uzak incelemek.
4. 2.7 mm trefin matkap kullanarak, lambda ve bregma arasında doğru yarımkürenin korteks üzerinde kafatası bir 2.7 mm daire zayıflatmak. Matkap (Şekil 2Biii) ile kemik nüfuz YAPMAYIN. Başvuru Tablosu 2.

KRİTİK ADIM: matkap kafatası yoluyla giderse beyin yüzeyi ek tra ile etkileyen sonuçlar zarar görüruma. Buna ek olarak aşırı kanama oluşturulan bir açık pencere önlenmesi ortaya çıkar.

5. Diseksiyon cımbız ve diş kanca ve kasıtlı ama kontrollü güç (Şekil 2Biii) kullanarak zayıflamış kemik flep çıkarın.
6. Tümör patoloji bakarak (İsteğe bağlı), adım 2.5 oluşturulan pencerenin merkezine seçilen tümör hücre hatları (floresan muhabiri gen ile) enjekte edilir.
   1. Bir stereotaktik çerçeve içine hücre süspansiyonu ve yük iğne ile 10 ul 30 G Hamilton şırınga yükleyin.
      KRİTİK ADIM: Hücre numarası gerekli büyüme kullanımı ve zaman çizelgesi tümör hücreleri için optimize edilmesi gerekir. U87 kültürler için biz fare başına 10 ul 2 x 10 ⁵ hücre kullanın.
   2. Dijital stereotaktik çerçeve üzerine fare yüklemek oluşturulan pencerenin merkez noktası için iğne hizalayın.
   3. Sadece kortikal yüzey dokunur ve dijital koordinatları sıfırlamak Alt iğne kadar.
   4. Düşüker kortikal doku içine 3.2 mm iğne ve derin 3 mm enjekte.
   5. Iğne geri çekin yavaş yavaş daha sonra çerçeveden fare çıkarın.
      KRİTİK ADIM: 1 dk süresi boyunca çözüm enjekte edilir ve geri azaltılmış akışını sağlamak için pozisyon verildikten enjeksiyon iğnesi bırakın.
      KRİTİK ADIM: küçük kanama karşılaşılırsa yüzeysel kanamayı durdurmak için 1-5 dakika steril tuzlu su ile yıkayınız. Sonraki adımlarla devam edin.
7. Beyin dokusu sulu tutmak için steril PBS bir damla ile beyin yüzey nemlendirilmelidir.
8. Üretilen 2.7 mm pencere etrafında tam mühür beyin yüzeyine 3 mm lamel yüzer. Başvuru Tablosu 2.
9. Kuru çevreleyen kafatası sonra kafatası kemik ve yerine lamel reseal kafa derisi doku için tüm maruz kafatasına Vetbond geçerli bone. Camın altına sızabilir ve görüntüleme potansiyelini azaltmak gibi bir aşırı UYGULANAMAMAKTADIR.
10. Mix taze diş akrilik tozu ve çözelti, yaklaşık% 30 (w / v) ve Vetbond üst üzerine uygulanır. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için hafifçe cam lamel kenarına (Şekil 2Biv) üzerine akrilik üst üste. Başvuru Tablosu 2.

DİKKAT: Diş eldiven ve prosedürleri boyunca maske kullanmanızı tavsiye ederiz böylece akrilik son derece tehlikelidir.

KRİTİK ADIM: Diş akrilik iyi bir sızdırmazlık sağlamak ve fazla azaltmak için döküm sırasında esnek kalması gerekiyor. Pencerede akrilik oluşturmak görüntüleri bulanıklık olacaktır.

11. Fareler sıcak bir kafese kurtarmak için izin verin.

3. Stereotaktik Radyasyon (İsteğe bağlı) - Şekil 3 (fare başına 25 dk)

Varyasyonlar kullanılan ve gibi optimizasyon gerekecektir farklı ışınlama var olacaktır. Biz özel tasarlanmış ışınlama kullanılır.

1. Fareler uyuşturan0.5-1 litre O ₂ dk, ve stereotaktik ışınlama içinde özel baş süzgeç üzerine yer (Şekil 3Al) ile işlem boyunca 1.5-2% takip indüksiyon için% 4 İsofluranın kullanarak.
2. X-ışını tüpü, 2 mm alüminyum filtre ile 40 kVp ve 0.05 mA çalışan ile 360 ​​° koni ışın BT edinin. Bu Dorsal ventral yönde merkezi sağlanması sağ hemisfer için radyasyon isocentre yönlendiren, sahne hareketi rehberlik görüntü kullanın.
3. Hemisferik kolimatör, 8 mm x 11 mm blok yerleştirin.

KRİTİK ADIM: Kolimatörleri çok farklı kurulumları için dizayn edilebilir ve böylece beynin farklı bölgelerinde eklemek veya çıkartmak için geliştirilebilir. 8 mm x 11 mm beynin bir hemisferik alanı tanımlar.

4. Daha fazla beyin, anat yerleştirilmesi geliştirmek için kolimatör ile üst (AP) ve alt (PA) hem tek BT ​​dik görüntü eldeomical kemik yapıları tekrarlanabilirlik için kullanılabilir.
5. Değişimi, 0.93 mm bakır tedavisi için alüminyum filtre filtre ve X-ışını tüpü bir AP yönde bir üst 225 kVp ve 13 mA'da çalışan istenen radyasyon dozunun yarısı yönetmek.
6. Alt konumuna portal dönün ve X-ışın tüpü 225 kVp ve 13 mA formu PA yönde altındaki çalışan ile tekrar radyasyon dozunun ikinci yarısında yönetmek.

KRİTİK ADIM: Bu üst ve beyin dokusu ile oda sıcaklığına gradyan azaltmak için alt hem de ikinci ışın tedavisi için gerekli olan, aynı zamanda beyin merkezine isocentre uyum ile yardımcı olur.

4 vivo İki Foton Lazer Mikroskopi -. Şekil 3 (oturum başına 1-3 saat)

Varyasyonlar kullanılan ve gibi optimizasyon gerekecektir farklı mikroskoplar var olacaktır. Biz bir Carl Zeiss LSM510 META Lazer Tarama Confoc kullanılanal Mikroskop.

1. IACUC onaylı anestezi, alkol sprey kullanarak 0.5 mg / g ve temiz pencere Avertin IP enjeksiyon ile fareler uyuşturan.
2. 1. (İsteğe bağlı) önce görüntüleme için kuyruk damar içine önce görüntüleme etiketli vasküler boya 5-10 dakika, enjekte edilir. Alexa647-Dextran 0.35 mg 0.2 mg / g kullanılan / g veya APC-CD31 kullanılan. Tablo 2 bakınız.
   2. (İsteğe bağlı) tümör tanımlamak için, görüntüleme önce 7.7 mg / kg, 5 dakika arasında bir dozda, kuyruk veni yolu ile Floresin enjekte edilir. Başvuru Tablosu 2.
3. Üretilen kimerik fare kullanılan florokrom ile tayin edildiği gibi konfokal mikroskop Ayar kanalları bulunmaktadır. Tablo 1, bu modelde tanımlanan kanal göstermektedir.
4. Hareketli mikroskop sahneye fare ters çevirin ve şekillendirilen hamuru. (Şekil 3Aii) Başvuru Tablosu 2 pozisyonda kafa stabilize.

KRİTİK ADIM: ICW lazer noktasına dik olması ve bu gibi görüntüleme en iyi olduğundan emin olmak için yatay yerleştirilmelidir gerekir.

5. İlk kanal Lazer açın ve ICW ortasına konumlandırmak için kullanın.
6. 5x objektif kullanın ve daha yüksek çözünürlüklü görüntüler için bir harita olarak kullanmak için tüm pencerenin bir görüntü alır.
7. Görüntüleme en iyi görüntü kalitesini elde etmek için 10X ve 20X 'uzun menzilli' lens kullanılarak yapılmalıdır.

KRİTİK ADIM: 2PLM üzerine Kanallar ve hedefleri onlar doğru florokrom vurgulamak için ön fare modellerin görüntüleme in vitro mühendislik hücreleri kullanılarak ayarlanmalıdır.

Florokrom	CFP	GFP / Fluorescein / FITC	mCherry / RFP / DsRed	APC / Alexa647	SHG Otofloresans
Uyarma lazer	458 nm	488 nm	543 nm	633 nm	Chameleon lazer 820 nm
Toplama Filtresi	480-520 nm	500-550 nm	565-615 nm	650-710 nm	390-465 nm

Tablo 1. Kullanıcı florokrom tertibat. Fazlası modeli mevcut olan her bir kanal için kullanılan lazer eksitasyon ve emisyon spektrumlarına toplayıcı görmek.

Sonuçlar

NODscid farelerin BM yeniden yapılandırılması ve isteğe bağlı adım NODscid 'ev sahibi' farelerin% 100 floresan 'donör' BM bir% 80 alım olur, TBI ancak optimizasyon Diğer uzun sulandırma geliştirmek için gerekli olacaktır -immunocompromsed suşları. Fareler başarısız yeniden Eğer onlar hasta ve prosedürü izleyerek hızla ölecek, zayıflamış fareler ek gıda ve su kaynakları gerektirebilir.

Bir kez bitmiş ICW Şekil 2Biv görülen böyle bakmak gerekir. Bu kafatası ile birleştirme kuvvet verir gibi cam lamel çevreleyen akrilik bir sırt için idealdir. Mükemmel pencereler tekrarlanabilir ve nesil (Şekil 2C) ardından en fazla 8 hafta için tekrar görüntüleme için izin verir. Bu en iyi pencerelerden üretilen Görüntüler Şekil 3Bi görüldüğü gibi bakacağız. Pencere nesil kusurları kötü görüntüleri üretecekörneğin kalite, pencerenin altında hava kabarcıkları görüntülü olan bakış tüm alanları önleyecektir, alanları hava lazer görüntüleme (Şekil 3Bii) engeller olarak. karanlık görünür lamel aşırı yapıştırıcı ve akrilik ile arka plan yüksek düzeyde olacaktır floresan ve kir eşiğe pencere küçük noktalar üzerinde olup benzer ise, Şekil 3Biii görüldüğü gibi büsbütün kör olan alanın alanları alanında (Şekil 3Biv) görünür olacak.

ICW görüntüleme Başarı cerrahi teknik bütünlüğünü tarafından önceden belirlenmiş, ancak, hatta en iyi ICWS görüntüleme oturumu sırasında sorunlarla karşılaşabilirsiniz. Bu nedenle, bir dizi açıklık derecesi ve Şekil 3'te görüldüğü üretilen görüntüler bulunmaktadır. Her şey iyi olduğunda Şekil 3C tasvir yayın kaliteli görüntü oluşur. Tüm fareler için mümkün değildir, ancak bu, görüntünün% 80 beklemek mümkün olduğunus şöyle oluşturulur. Mevcut mikroskopi kurulumunda büyük kusurları biri ters lazerlerin kullanılmasıdır. Fareler görüntüleme sırasında nefes yorucu yol açabilir aşırı stres ve rahatsızlık sırtlarına ve bu sonuçlar üzerinde konumlandırılmış olması gerekir. Solunum oluşur ortalama engelleyen gibi bu bir 'çizgili' görüntü oluşturur görüntüleme sırasında, bu sayede, her piksel satır dört kez ve dört ortalama, en son resimde görüntülenir görüntülü. Nefes, Şekil 3D görülen görüntü üzerinde bir çizgi olarak görünür bir eser yaratacak yorucu bu tür bu kadar ortalama sırasında herhangi bir hareket neden oldu. Görüntüleme sırasında yetersiz anestezi olan Fareler de bu sorunla karşılaşabilirsiniz. 'Çizgili' etkisi için ortalama görüntü sınırlayarak azaltılabilir, ancak bu görüntü kalitesini düşürür dönecek ve sorunu ortadan kaldırmak değil. Alternatif olarak fareler yeniden yerleştirilebileceğini ya da solunum normale ne zaman denenmesi. Kullanmak ofareler 'yüzüstü pozisyonda' görüntülü olabilir gibi f dik 2PLM bu sorunu inkâr olur. Ters 2PLM üzerinde görüntüleme ile ek bir sorun fare mikroskop ve bu Şekil 3E görülen olduğu gibi 'parçalı' görüntülere yol açar kez ICW konumlandırma için sınırlı erişilebilirlik içerir. Burada, lazer ve kapak birbirine dik konumlandırılmış ve bu görüntü bir açı ortaya çıkar değildir. Görüş alanının iki yansıma olmayan bir segmentli 'görüntünün üretimi ile sonuçlanır. Sorun kolayca lamel Şekil 3Aii görülen tutturma ile kafasına bir kez tamamen yatay olmasını sağlamak için fare yeniden konumlandırılması ile çözülmüştür.

Makin - modeli özellikle tümör dokusunun damarlanmada BMDCs rolünü incelemek için kullanılan ve aynı anda üç farklı kanal kullanma yeteneği (Alexa647 ve APC Kiraz, GFP, Uzak-kırmızı) gösteren edildi Burada sunulang bu özel hikaye için OBP ve SHG gereksiz. Biz pencere kaynaklanan herhangi bir zararlı etkisi ile, bir tek hücre düzeyinde damar içine BM hücrelerin işe alım ve entegrasyon eğitim, en fazla 8 hafta için boyuna görüntü farelere başardık. Bu model, kaynak ve damar oluşumu ve önceden son nokta histolojik analizi yoluyla kaybedilen ilgi farklı hücre tipleri, etkileşim dinamik bilgi toplama kolaylığı göstermektedir.

Adım	Sorun	Muhakeme	Çözüm
1.4	Paramparça Kemik	Blunt araçları	Bilenmiş makas veya taze neşter bıçak kullanarak yeni bir fare oluşturan kemik iliği toplamak, kemik parçaları TV enjeksiyon engeller
1.5	Düşük çıkarma (düşük viscosity)	Kemik omurun çok distal kesmek, kötü toplama yöntemi	Kemikler olarak proksimale mümkün kesilmiş ve geri sıçrama önlemek için toplama tüpünün içindeki kemik ile tahsil edilmesi gerekir Zaman maksimum ve dikkatle BM ayıklamak için harcanan olmalıdır 1 ml su içine gerekli havuzu birden fazla fare Eğer
	Yüksek Ekstraksiyon (yüksek Viskozite)	Düşük toplama tampon	, Ekstra% 0.1 BSA ile çözüm sulandırmak fare maksimum 500 ul için üç alıcı fareler kadar bölünmüş
1.6	Bad intravenöz enjeksiyon	Kötü vazodilatasyon ve damar görünürlük	Isı lambası ile dilatasyon geliştirin. Erişim yardım etmek için ışık kaynağı yerleşik kuyruk ven süzgeç yerleştirin fare
1	Hasta Fare	Enfeksiyon	Kurumun kurallarına göre fareler kurban. Kuyrukları önce enjeksiyon için temizlenir emin olun ve sterilite kontrolkültür çıkarılan BM
	Fare die	Kötü BM alımı	Ölü fare floresan BM alımını% kontrol edin. Kullanılan farelerin gerginlik için TBI optimize BM enjeksiyon (örneğin iki alıcılar için kullanmak bir donör fare) miktarını artırın
2.4	Küçük kanama	Dura sondaj sırasında ihlal	Jel yastıkları ile baskı ve ve sürekli steril serum fizyolojik yıkama
	Büyük kanama	Beyin delme zarar	Kurum kurallarına göre fare Sacrifice
2.8	Lamel altında Hava kabarcıkları	Kortikal yüzeyi ile zayıf iletişim doğru yerleştirilmesi önler	Lamel çıkarın ve kabarcıklarını çıkarmak için pencere üzerine lamel yüzer ekstra PBS ekleyin
2.10	Yapıştırma sırasında lamel kayması	AcrAKRİLİK kitle lamel üzerinde baskı, ağır ve yol lamel dışında hareket	Vetbond ve akrilik uygulanır ise cımbız lamel basılı tutun için kullanılmalıdır
4.2	Bad intravenöz enjeksiyon	Kötü vazodilatasyon ve damar görünürlük	Isı lambası ile dilatasyon geliştirin. Erişim yardım etmek için ışık kaynağı yerleşik kuyruk ven süzgeç yerleştirin fare
4.4 Şekil 3C	'Çizgili' görüntüleri	Yorucu veya düzensiz nefes	Çerçeveden fareyi çıkarın ve kurtarmak için izin Anestezi uygulanan düzeyi artırmak ve boyun sağlamak için konumunu ayarlamak aşırı fleksiyonda veya nefes önlemek için genişletilmiş değildir
Şekil 3C	'Segment' görüntü	Beyin hedefleri paralel değil	Düz olduğundan emin olmak için lamel konumunu ayarlamak
	Gemi görüntülendi değil	enjeksiyon intravasküler görmedim	Iyi vazodilatasyon sağlamak için alternatif kuyruk ven, sıcak kuyruk içine enjeksiyon yeniden
	Yüksek arka plan	Kirli lamel, Hava Bubbles, Akrilik	Nemli% 70 etanol bezle lamel silin, akrilik altında nüfuz olabilir ıslatın ve beyin dokusu zarar vermez

Tablo 2'de. Sorun Giderme. Prosedürlerin sorunlu alanlar için gerekli düzeltici adımlar için bir kılavuz.

Schemata 1. Deneysel akış diyagramı. Bu deneysel adımları 1-4 ile olayların zaman çizelgesi göstermektedir. Fare modelleri için, bir hafta boyunca ayarlanmıştırtümör greft sağlamak için tümörün Gün 7. kadar BM düzgün tekrar oluşturur ve ilaç ile tedavi edilmez sağlamak büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 1. BM Sulandırma. (A) BM çıkarma işlemi arka bacak kemikleri i. Diseksiyon. Arka bacaklarda gelen ii. Dissected femur ve tibia, temizlenmesi ve çıkarılması için hazır. Iii. Bones uç plakası ile beyaz görünümü gösteren, ile kaldırıldı ve kızarmış boş kemiklerin. (B) enjeksiyon için yan damarlar kuyruk konumlandırılmış nerede Şemaları gösteren.

Şekil 2. ICW nesil. (A) Tavsiye Aseptik kurulum (B) i. Exposed kafatası yüzeyi cerrahi için gerekli olan yerler ortaya, ICW bregma ve lamda eşit uzaklıkta sağ yarımkürede yerleştirilmelidir. Ii. Periostieum kaldırılması için hazır, lidokain solüsyonu ile kaldırdı . III. matkap ile üretilen kemik fragmanının alınması işlemi için gereken Diş kanca. IV. diş akrilik plaka ile tamamlandı. (C) üç örnek pencere yöntemin tekrarlanabilirlik göstermektedir.

Şekil 3,. 2PLM beklenen sonuçlar. Tüm görüntüler yeşil BM, kırmızı tümör, Mavi (sözde renkli çok kırmızı) damar göstermektedir. (A) i. Küçük hayvan ışınlayıcı içinde izofluran akışı korur baş çerçeve gösterir. 8 x 11 mm kolimatör da en portal. Ii. Fare ile etrafında hareket görülebilir görüntüleme için gerekli kafa çerçevesine yerleştirilmiş ters, moldable plastercine tüm pencereleri yerleştirilebilir sağlar. Sorunların sonuçlarının (B) İşaret fotoğrafları i pencere üretimi ile. optimal pencere, ii. lamel ve iv üzerinde iii akrilik dökülme, altında hava kabarcığı ile bir pencere. pencere kendisi kir. (C) bir ICW i başarılı üretimi takiben görüntüleme ile ortaya çıkan sorunları vurgular. en iyi görüntüleme ii . nefes eserleroluşturmak bir 'çizgili' görüntü iii. lamel lazer bir 'bölünmüş' görüntü oluşturmak için dik değil. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Fonksiyonel kullanımları ve Model uyarlamaları. GFP görüntü beyaz diğer üç kanal yerleştirilmiştir edilebilir gerçek OBP görüntü ortaya çıkarmak için OBP görüntüden çıkarılır sayede (A) OBP sonrası görüntü işleme. Yeşil BM, Kırmızı tümör, Beyaz CSCS, Mavi (sözde renkli çok kırmızı) damar (B) SHG ile görüntülü olabilir kollajen liflerinin gösterilmesi. Yeşil Dekstran, kırmızı BM, Mavi Kollajen (C) i. vitr içinde VEGFTrap hücreleriVEGFtrap. ii ile üretilen GFP sinyal göstermek o. vivo görüntüleme açıkça VEGFtrap hücreleri gösterir ve ek olarak bakıyorsun sistem göstermek için kanal geçiş kolaylığı vurgulamaktadır. Yeşil VEGFTRap + Tümör, Kırmızı BM, Mavi (renkli sözde uzak kırmızı) damar. (D) tümör stromasında Floresein toplanmasını gösterir ve olmayan hücrelere doğrudan kırmızı tümörü olan yeşil sinyal bindirmenin eksikliği ile gösterilir. Yeşil Floresein, Kırmızı tümör. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Tüm görüntüleri açıklanan üç kanal şu ​​ana kadar bir çok sayıda hücre tipleri ve etkileşimleri bakmak için araçlar paha biçilmez bir dizi diğer modelleri ve yaprakları araştırmacıların ilgi üç işaretleri için değiştirilebilir. Planlama bütün belirteçler ve hücre tipi başarılı bir şekilde ayrı kanal bir raportör molekülü floresan entegre etmiş sağlamak için gereklidir.

Burada kullanılan standart üç kanal ek olarak biz de dördüncü bir CFP kanal (Şekil 4A) ve SHG tabanlı kolajen kanal ⁷ (Şekil 4B) entegre başardık. Bu in vivo ve ek olarak hücresel etkileşimleri bakarak olasılığı uzanır sağlar Kullanıcı diğer belirteçler için iki kanal koruyarak belirli hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için karıştırma nüfus üstlenecek. Örneğin, kendi intratum karşılaştırarak bir ilgi ile 1:3 oranında tümör hücrelerinin (TTT) ve kanser kök hücreleri (OBP) baktımOral etkileşimleri (Şekil 4A). Biz karışık nüfusun 7 gün sonrası implantasyon oranı onadı ve her iki hücre popülasyonlarının hala görülebilir görülmektedir.

CFP kanal + hücreleri aslında GFP + olduğu olanlardan CFP doğru tanımlayan ve sonrası görüntü işleme gerektirir eksitasyon ve emisyon spektrumlarına hem de GFP gibi kanal ile örtüşme nedeniyle teknik sorunları içerir. Mesaj görüntüleme işleme Zeiss LSM yazılım doğrudan sayede inşa 2-foton mikroskop üzerinde yapılabilir, GFP görüntü (Şekil 4A) geride olan gerçek OBP hücrelerinde sonuçlanan OBP görüntü çıkarılır. Oranı çıkarma için öncül eşit parlak görüntüler bağlıdır ve GFP lazer (488 nm) iken OBP ve GFP hücreleri hem floresanlama CFP lazer (458 nm) nedeniyle OBP hücreleri floresan için çok yüksek. CFP ek olarak biz de SHG bakmak için daha önce yayınlanmış kurulumları kullanmak mümkün olmuşturdüzeyleri ve bu nedenle damar çevreleyen bazal membran, (Şekil 4B) oluşturan kolajen lifleri betimliyor.

Bu modelin bir diğer uyum çapı 2 mm kadar küçük doku bölümleri ışın tedavisi için stereotaktik rehberliğinde radyasyon kullanma yeteneğine sahip özel inşa küçük bir hayvan ışınlama avantaj aldı. Işımasıyla pencere hedefleyerek sahip temel dokusu üzerindeki etkisini radyasyon bakmak mümkündür. Biz son zamanlarda etkisi radyasyon bakarak bir çalışma yayınladı damar için BMDCs istihdamı ile ilgili olarak normal beyin dokusu üzerindeki sonrası radyasyon doku değişiklikleri rollerini de özellikle bakarak. Biz BMDCs istihdamı zaman ve normal doku ^11'de bağımlı doz hem de oldu bulundu.

Bu ilacın sağlayan tedavi teslim ve entegrasyon mekanizmaları incelemek için mümkün olduğu bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş. Sırasındaaraştırma biz VEGFTrap üretimi, üretim ²⁵ yerel alan tüm VEGF sinyal bloke bir anti-anjiyogenik ilaç izlemek mümkün olmuştur. VEGFtrap üretim, BMDC etkileşim ve aynı anda damar (Şekil 4Cii): genetik EGFP bir IRES ile birleştiğinde VEGFtrap gen (Şekil 4ci) ifade için tümör hücreleri değiştirerek ve TTT 'donör' BM kullanarak biz görüntü EGFP başardık. Bu modeli ve kanalları çok yönlülük gösterdi. Bu tek hücreli çözüm vaadi nedeniyle ilacın kinetik bakmak da mümkündür. Fluoresein (GFP +) maksimal rezeksiyon ²⁶ sağlandığından emin olmak için cerrahi sırasında tümör tanımlamak için kullanılır. Intravenöz iken görüntüleme enjekte edilerek bu tarif tümör hücrelerinin kendilerini içine Floresein en aktif alımı yoluyla değil oluşur göstermek mümkündür, ancak bunun yerine ilacın koleksiyonu ile t stromal alanı içineFluorescein (Şekil 4D) ve enjeksiyonu takiben co-lokalizasyon 10 dakika eksikliği görülen ime,.

Genel olarak bizim strateji dinamik hücresel etkileşimlerin çalışmaya avantajlıdır benzersiz deneysel bir platform, elde etmek için yeni ve mevcut teknikleri birleştirir. Bu strateji intrakranial, tedaviye yanıt olarak BMDC, tümör ve normal beyin kanlanması yüksek çözünürlüklü tek hücreli dinamik evrim incelenmesi için çok değerli bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Intravital görüntüleme BMDC alımları, göç ve farklılaşma intrakranial beyin tümör damar hem de diğer araştırma alanlara adapte olabilen birçok başka dinamik süreçlerin moleküler düzenleyiciler daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Diğer tedavi stratejileri ile birlikte düzenlemeye BMDC inhibe olası faktörleri kombinatoryal tedavilerin hassas zamanlamasının belirlenmesi yardımcı olabilir. Ayrıca, bu strateji, birçok gelecek pr uyarlanabilirin vivo intravital boyama boyalar değil sadece kullanan değil, aynı zamanda küçük molekül inhibitörleri ve floresan araştırmacılar sıra kinetik de boyuna bakmak gibi daha hedefli tedavi dağılımı ve göç yollarını izlemek için izin etiketlenir nanopartiküller ojects.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
NODSCID mice	Jackson Lab	001303	8 week old
B5/EGFP Mice	Jackson Lab	003516
ACTB/DsRED mice	Jackson Lab	005441
Tear Gel	Novartis	T296/2
2% Lidocaine-Epinephrine	Bimeda MTC	25SP	Use neat
Vetbond	3M	1469SB
Self curing acrylic kit	Bosworth	166260	Use ~30% (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647	Invitrogen	D22914	Use @ 0.6 mg/kg in Saline
CD31-APC	BDPharmingen	551262	Use @ 0.3 mg/kg in Saline
AK-fluor (Fluorescein) 10%	AKORN inc.	NDC 17478-253-10	Use @ 7.7 mg/kg in Saline
Betadine solution	Purdue Products	NDC 67618-150
Equipment
Fine Tweezers	VWR	82027-402
Fine Dissection Scissors	VWR	25870-002
22G Needle	BD	305156
27G 0.5 ml TB syringe	BD	305620
Handheld Micro-Drill	Fine Science Tools	18000-17
2.7 mm Trephine drillbit	Fine Science Tools	18004-27
10 μl 30G Hamilton syringe	Sigma Aldrich	20909-U
Glass Coverslip 3 mm	Warner Instruments	64-0720 CS-3R
Fluorescence goggles	BLS	FHS/T01	Basic head frame
Stereotaxic frame	stoelting	51950
Mouse restrainer for IV injection	Brain Tree Lifescience	MTI