A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

Resumo

Nós descrevemos um romance In vivo Técnica de imagem que os casais ratos quiméricos fluorescentes com janelas intracraniana e alta resolução, microscopia dois fótons. Esta imagem plataforma estudos auxiliares de mudanças dinâmicas no tecido cerebral e da microvasculatura, a um nível de uma única célula, na sequência de insultos patológicos e é adaptável para avaliar a entrega da droga intracraniana e distribuição.

Resumo

Estamos integrados com sucesso previamente estabelecido janela intracraniana (ICW) tecnologia ^1-4 com intravital microscopia confocal dois fótons para desenvolver uma plataforma nova que permite a visualização direta de longo prazo da estrutura do tecido mudanças intracraniana. Imagem em uma resolução única célula de uma forma em tempo real fornece informações dinâmicas complementares além do previsto pela análise histológica padrão de ponto final, que analisa apenas as "snap shot" secções de tecido.

Estabelecer esta técnica de imagem intravital em camundongos quiméricos fluorescentes, que são capazes de imagem quatro canais fluorescentes simultaneamente. Ao incorporar células marcadas por fluorescência, como a GFP + da medula óssea, é possível rastrear o destino destas células a estudar a migração de longo termo, integração e diferenciação no tecido. Continuação da integração de uma célula repórter secundário, tal como uma linha de tumor de glioma de mCherry, permite a caracterizaçãozação de interacções célula-célula. As mudanças estruturais no microambiente do tecido podem ser destacadas por meio da adição de corantes vitais intra-e anticorpos, por exemplo, CD31, anticorpos marcados e das moléculas de dextrano.

Além disso, descrevem a conjugação do nosso modelo de imagens ICW com um animal pequeno micro-irradiador que fornece irradiação estereotáxica, criando uma plataforma através da qual as alterações dinâmicas de tecido que ocorrem após a administração de radiação ionizante pode ser avaliado.

Limitações atuais do nosso modelo incluem penetrância do microscópio, que é limitada a uma profundidade de até 900 mM a partir da superfície subcorticais, limitando imagiologia para o eixo dorsal do cérebro. A presença do osso do crânio faz a ICW um processo técnico mais difícil, em comparação com os modelos de câmara mais estabelecidos e utilizados actualmente utilizados para o estudo de tecidos e as almofadas de gordura mamaria ^5-7. Além disso, a ICW provides muitos desafios em termos de optimização de imagem.

Introdução

Uma melhor compreensão das alterações estruturais e biológicas que possam surgir no cérebro em resposta a várias patologias, e intervenções terapêuticas é crítico para melhorar estratégias de tratamento. No entanto, um dos desafios atuais em estudar essas mudanças estruturais e biológicos, particularmente em relação às patologias intracranianas, é a inacessibilidade do tecido e da incapacidade para estudar a evolução temporal e progressão dinâmica de mudanças em um cenário em vivo. A geração da "janela" A tecnologia já havia sido bem sucedida em examinar as mudanças dos tecidos moles através do desenvolvimento de tumor ^5-7. O desenvolvimento de modelos ICW prova ser mais tecnicamente difícil, devido à necessidade de remover o osso do crânio, sem danificar a instigar a infecção no tecido cerebral subjacente. Trabalhos anteriores tentaram diluir o crânio para visualizar os ^8-10 tecido no entanto, a produção de alta resolução clara imidades remoção completa do osso do crânio é necessário ^11. Repita a longo prazo de imagem (30 dias +) só recentemente se tornou uma opção viável através de imagens ^1,11, prazos mais curtos anteriormente foram estudados ^5.

Durante a última década, um objectivo importante tem sido a elucidar a origem de estímulos patológicos seguintes neo-vascularização, em particular, em resposta à formação e progressão tumoral, para fornecer novos alvos terapêuticos para o tratamento de tumores. Muita controvérsia continua em torno da fonte de nova vasculatura no cérebro durante o desenvolvimento do tumor ou a radiação seguinte. Tradicionalmente, tem sido considerado vascularização ocorrer através de angiogénese, um processo pelo qual novos vasos se formam a partir do surgimento de vasos pré-existentes ^12. Estudos mais recentes, no entanto, sugerem que o processo embrionário anteriormente assumido de vasculogénese podem jogar um papel mais importante na formação de vasculatura patológico. Vasculogenesis envolve o recrutamento dos homólogos angioblast adultas da medula óssea, o que por sua vez são, então, envolvidos directamente na formação de novo endotélio dos vasos ^12-14. Acumulando as evidências indicam que as células precursoras endoteliais são mobilizados da medula óssea para iniciar formação de novo de vaso em resposta a mediadores oncogénicos ^15-17. No entanto, esses estudos fornecem evidências contraditórias para a contribuição direta dessas células derivadas da medula óssea (BMDCs) ao endotélio dos vasos com percentual de contribuição variando com o tipo de estímulo patológico e resposta ao tratamento ^18-21.

Por conseguinte, estabelece métodos experimentais reprodutíveis que permitem elevada resolução de imagem para intravital estudo repetido a longo prazo do processo de integração no BMDC vasculatura do tumor e, em resposta à terapia é valiosa. Técnicas histológicas padrão deixar de fornecer a informação dinâmicamação necessária para determinar a sobrevivência a longo prazo, diferenciação e integração das células que dão origem a neovasculatura e, portanto, não pode demonstrar definitivamente os mecanismos de interacção célula.

Mostrámos utilizando a nossa abordagem experimental que existe um grau variável de recrutamento BMDC, tanto após radiação ionizante intracraniana e o crescimento do tumor, um processo de recrutamento que é, no entanto, o local da patologia específica e não uma invasão de todo o tecido intracraniana ^11,22. Nós mostramos que o recrutamento segue um padrão sensível vez demonstrado pela imagem repetida de um único animal ^11,22. Da mesma forma, imagem in vivo também pode fornecer informações valiosas para o mimetismo das células tumorais através do qual as células tumorais fluorescente etiquetado podem ser visualizados e monitorados com um anticorpo CD31 intra-vital para as células endoteliais para destacar a possibilidade de transdiferenciação de células tumorais para formar diretamente o seu próprio endotélio.

A versatilidade do modelo é reforçada pela capacidade de imagem 4 canais fluorescentes, proporcionando um número de combinações exaustiva para o estudo de diferentes processos celulares e biológicas. Somos capazes de intravitally imagem CFP (azul), GFP (verde), Cereja / RFP (vermelho), e Alexa647/APC (far-vermelho), simultaneamente em um único campo repetidamente ao longo do tempo. Os investigadores podem modificar geneticamente as células para expressar fluorocromos para cada um dos canais, bem como corantes de compra e de anticorpos para realçar as alterações estruturais de interesse particular. Até à data, os corantes e os anticorpos utilizados em estudos incluem CD31 e dextrano que salientam a microvasculatura e das suas alterações no tecido ^1,11,23,24, embora utilizados no canal vermelho extremo para este propósito, tanto estão disponíveis para uso na outra canais mencionados. Da mesma forma, outros corantes incluindo Sytox laranja, que irá destacar as áreas de apoptose, e marcadores, como os da empresa VisEn, têm sido specamente projetado para uso in vivo. Para além dos quatro canais fluorescentes utilizadas mencionadas, canal de uma segunda geração de harmónicas (SHG) podem ser adicionados e optimizado para a imagem das fibras de colagénio endógenas do modelo ^7, visualizando a membrana basal vascular circundante.

Para demonstrar a capacidade de adaptação do nosso modelo, assim como as interacções célula-célula acima citadas, foram capazes de estudar as interacções célula-droga. Nós olhamos inibidores de drogas como AMD3100, um inibidor da SDF-1, e seu papel na sinalização redes envolvidas no recrutamento BMDC ^11. Do mesmo modo, temos geneticamente para células U87 xenoenxertos de glioma de expressar VEGFTrap, um inibidor de VEGF ^25, em conjunto através de uma IRES para uma molécula de GFP. Usando RFP + BM somos capazes de estudar o papel do VEGF tem sobre o recrutamento de BMDCs na vasculatura. Mais recentemente, têm utilizado o modelo para estudar a cinética de drogas olhando para o MEChanism trás do tumor delinear droga Fluoresceína ^26, a um nível celular. Através da utilização de uma encomenda foi construído em casa pequena irradiador de animais que foram capazes de integrar de radiação administrada estereotáxico para avaliar a resposta de ambos os tumores e BMDCs ao tratamento.

Através do uso das nossas novas imagens intravital método pesquisadores irão obter insights sobre os unicelulares mudanças em tempo real que ocorrem em diferentes patologias e sistemas, auxiliando na elucidação de muitas características funcionais e biológicos de alterações do tecido.

Protocolo

TODO O TRABALHO animal tem sido realizado sob um cuidado ANIMAL E COMITÊ DE USO protocolo aprovado e executado em conformidade com todas as orientações pertinentes, REGULAMENTOS e as agências reguladoras.

Para referência Tabela de solução de problemas 2.

1. Medula Óssea Reconstituição (Opcional) Figura 1 (30 min preparação, 5 min por mouse)

Todos cirurgia deve ser realizada utilizando uma técnica asséptica rigorosa com material esterilizado em autoclave.

Um camundongo doador vai reconstituir três ratos de acolhimento.

1. Anestesiar destinatário camundongos NODscid e posição, com chumbo para proteger a cabeça, dentro do centro irradiador da Gammacell 40 'opressor'.
2. Irradiar camundongos NODscid com 2,5 Gy de irradiação corporal total (TBI).

Passo crítico: Otimização do TCE pode ser necessária devido à variação na dose necessária para suficiente imune do hospedeiro ceesgotamento ll em diferentes cepas do mouse.

Ponto Pausa: ratos de host podem ser irradiados com antecedência, mas deve ser usado dentro de 24 horas de irradiação.

3. Eutanásia camundongos doadores de acordo com as orientações do comitê de cuidados de animais institucionais. Limpe os membros posteriores e remover a tíbia eo fêmur de ambos, tirando todo o excesso de tecido dos ossos (Figuras 1ai, 1aii).

Passo crítico: ossos da fíbula não são viáveis ​​para o uso devido a lume muito estreitas.

4. Remover placas finais de ambas as extremidades de quatro ossos extraídos e lave-os com uma agulha 22 G e 1 ml de PBS estéril até que eles são brancos na aparência (Figura 1aiii). Tabela de Referência 2.
5. Misture a medula óssea (BM) suspensão extraído bem e tirar 300 ml em três 27 agulhas de tuberculina. BM extraído deve conter cerca de 2 x 10 ⁷ células eé suficiente para 3 de acolhimento ratos reconstituições. Tabela de Referência 2.
6. Injectar a suspensão na veia lateral da cauda de três ratinhos NODscid previamente irradiados a partir do passo 1.1 (Figura 1b). Tabela de Referência 2.

ATENÇÃO: Para verificar a esterilidade da BM injetado recomendamos chapeamento o restante BM e cultura por 24 horas para verificar se há infecção. Principal causa de morte neste momento é a infecção em camundongos recém-reconstituída.

2. Geração Janela intracraniana - Figura 2 (30 min por mouse)

Todos cirurgia deve ser realizada utilizando uma técnica asséptica rigorosa com equipamentos esterilizados em autoclave e sob uma lâmpada de calor para manter os animais quentes (Figura 2A).

1. Anestesiar receptores ratinhos NODscid com IACUC aprovado anestésico, a injecção IP de Avertin a 0,5 mg / g e de posição, com a vantagem de proteger a cabeça, dentro da área doGammacell 40 'opressor' irradiador. Remover o cabelo do couro cabeludo. Além disso aplicar o gel rasgo para evitar a desidratação da córnea.
2. Couro cabeludo limpo primeiro com solução de betadine e em seguida com álcool, em seguida, fazer uma incisão desde o ponto médio das orelhas até acima dos olhos. Remover couro cabeludo 3 milímetros de cada lado da primeira incisão, expondo o crânio e marcos da superfície do crânio (Figura 2BI).
3. Eleve o periósteo, injetando lidocaína a 2%: solução de adrenalina e dissecar longe da superfície do crânio (Figura 2Bii).
4. Usando 2,7 milímetros trefina, enfraquecer a mm círculo do crânio de 2,7 sobre o córtex do hemisfério direito entre lambda e bregma. Não penetram o osso com a broca (Figura 2Biii). Referência Tabela 2.

Passo crítico: se broca passa através do crânio superfície do cérebro serão danificados que influenciam os resultados com tra adicionalUMA. Além disso o sangramento excessivo irá ocorrer impedindo que uma janela transparente de ser gerada.

5. Retire a retalho ósseo enfraquecido, usando uma pinça de dissecção e gancho dental e força deliberada, mas controlada (Figura 2Biii).
6. (Opcional) Se olhando para a patologia tumoral, injectar escolhidas linhas celulares tumorais (com o gene repórter fluorescente) no centro da janela gerado na etapa 2.5.
   1. Coloque 10 ml 30 G Hamilton seringa com suspensão de células de carga e agulha em um quadro estereotáxico.
      Passo crítico: O número de células necessitará de ser optimizado para as células tumorais em uso e cronologia do crescimento necessária. Para U87 culturas usamos 2 x 10 ⁵ células em 10 mL por mouse.
   2. Carregar rato sobre a armação estereotáxica digitais alinhar a agulha para o ponto central da janela gerado centro.
   3. Agulha menor até tocar a superfície cortical e redefinir as coordenadas digital.
   4. Baixoer a agulha a 3,2 mm para o tecido cortical e injectar a 3 mm de profundidade.
   5. Retrair agulha lentamente, em seguida, remover o mouse do quadro.
      Passo crítico: Injectar solução sobre a duração de 1 min e deixe a agulha na posição após a injeção para garantir reduzido o fluxo de retorno.
      Passo fundamental: Se a hemorragia menor é encontrado irrigar com soro fisiológico estéril para 1-5 min para parar o sangramento superficial. Prossiga com as etapas subseqüentes.
7. Humedecer superfície do cérebro com uma gota de PBS estéril para manter o tecido cerebral irrigado.
8. Flutuador lamela de 3 mm sobre a superfície cerebral para vedar totalmente em torno da janela de 2,7 milímetros gerado. Tabela de Referência 2.
9. Crânio circundante osso seco, em seguida, aplicar Vetbond para todo o crânio exposto ao tecido do couro cabeludo reseal ao osso do crânio e da lamela no lugar. NÃO aplique um excesso, uma vez que vai vazar no vidro e diminuir o potencial de imagem.
10. Mix fresco em pó acrílico dental e da solução, cerca de 30% (w / v), e aplicar por cima do Vetbond. Para assegurar uma boa vedação sobrepõem-se o acrílico ligeiramente sobre o bordo lamela de vidro (Figura 2Biv). Referência Tabela 2.

ATENÇÃO: Dental acrílico é extremamente perigoso, por isso recomendamos o uso de luvas e máscara durante os procedimentos.

Passo crítico: acrílico dental necessita de permanecer flexível durante a moldagem para assegurar uma boa vedação e reduzir o excesso. Acumulação de acrílico na janela vai borrar as imagens.

11. Permitir ratos para recuperar em uma gaiola quente.

3. Radiação estereotáxica (Opcional) - Figura 3 (25 min por mouse)

Variações vai existir nas diferentes irradiadores utilizados e, como tal, será necessária optimização. Usamos um irradiador projetado.

1. Anestesiar ratosutilizando isoflurano em 4% para indução seguido de 1,5-2% em todo o processo com 0,5-1 litro O ₂ a min, e lugar para restrainer cabeça personalizado dentro do irradiador estereotáxica (Figura 3ai).
2. Obter um 360 ° tomografia computadorizada de feixe cônico com o tubo de raios-X rodando a 40 kVp e 0,05 mA através de um filtro de alumínio 2 mm. Utilizar a imagem para guiar o movimento da fase, orientando a radiação isocentre ao hemisfério direito garantindo que é central no sentido ventral dorsal.
3. Insira o colimador hemisférica de 8 mm x 11 mm bloco.

Passo crítico: Collimators pode ser projetado para muitas configurações diferentes e por isso pode ser melhorado para incluir e excluir diferentes partes do cérebro. 8 milímetros x 11 mm define uma área hemisférica do cérebro.

4. Obtenção de imagens ortogonais individuais CT tanto de cima (AP) e inferior (PA) através do colimador para aumentar ainda mais o posicionamento do cérebro, Anatestruturas ósseas omical pode ser usado para a reprodutibilidade.
5. O filtro de alumínio para um tratamento de cobre 0,93 milímetros de câmbio filtrar e administrar a metade da dose de radiação desejada com o tubo de raios X funcionando com 225 kVp e 13 mA a partir do topo num sentido AP.
6. Retorno pórtico para a posição inferior e administrar a segunda metade da dose de radiação de novo com o tubo de raios X funcionando com 225 kVp e 13 mA forma o fundo numa direcção PA.

Passo crítico: É essencial para irradiar a partir de ambas as extremidades superior e inferior para reduzir o gradiente de temperatura ambiente através do tecido do cérebro, mas também ajuda o alinhamento do isocentre ao centro do cérebro.

4 In vivo Two Photon Laser Microscopy -. Figura 3 (1-3 horas por sessão)

Variações vai existir nas diferentes microscópios usados ​​e, como tal, será necessária optimização. Nós usamos uma Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal microscópio.

1. Anestesiar ratos com IACUC aprovado anestésico, a injecção IP de Avertin a uma janela de 0,5 mg / g, e limpo utilizando álcool spray.
2. 1. (Opcional) Injectar marcaram vascular corante 5-10 minutos antes da imagiologia, na veia da cauda antes da imagiologia. Alexa647-Dextrano usado a 0,35 mg / g ou APC-CD31 usado a 0,2 ug / g. Ver Tabela 2.
   2. (Opcional) Injectar fluoresceína através da veia da cauda a uma dose de 7,7 mg / kg, 5 minutos antes da imagiologia, para delinear tumor. Tabela de Referência 2.
3. Canais de instalação no microscópio confocal, conforme determinado pelo fluorocromo utilizado no ratinho quimérico gerado. Tabela 1 mostra os canais descritas neste modelo.
4. Inverter o mouse no palco microscópio móvel e estabilizar a cabeça em posição com plasticina moldável. (Figura 3Aii) Tabela de Referência 2.

passo crítico: A ICW deve ser perpendicular ao ponto de laser e, como tal, devem ser posicionados na horizontal para assegurar a imagiologia é a ideal.

5. Ligue primeiro laser de canal e usada para posicionar-se no centro da ICW.
6. Use lente de 5x e levar uma imagem de toda a janela para usar como um mapa para imagens de alta resolução mais.
7. Imagem deve ser efectuada utilizando 10X e 20X lentes "de longo alcance" para obter a melhor qualidade de imagem.

Passo crítico: Canais e os objectivos da 2PLM deve ser configurado usando células manipuladas in vitro, antes da imagem de modelos murinos para garantir que destacar o fluorocromo correta.

Fluorocromo	PCP	GFP / Fluorescein / FITC	mCherry / RFP / DsRed	APC / Alexa647	SHG autofluorescência
Laser de excitação	458 nm	488 nm	543 nm	633 nm	Chameleon laser de 820 nm
Coleção Filtro	480-520 nm	500-550 nm	565-615 nm	650-710 nm	390-465 nm

Tabela 1. Guias de Instalação Fluorocromo. Para que o usuário veja o laser de excitação e colecionador de espectros de emissão utilizados para cada um dos canais disponíveis no modelo.

Resultados

O passo opcional de reconstituição da BM de ratinhos NODscid deve resultar numa absorção de 80% do "dador" fluorescente BM em 100% dos ratinhos NODscid o "hospedeiro", no entanto optimização do TCE irá ser necessária para melhorar a reconstituição no outro não -immunocompromsed cepas. Se os ratos são, sem sucesso reconstituído eles vão ficar doentes e morrer rapidamente após o procedimento, os ratos enfraquecidos podem requerer adicional de alimentos e fontes de água.

A ICW uma vez terminado deverá ser parecido com o observado na Figura 2Biv. É ideal para ter uma crista de acrílico em torno da lamela de vidro, pois isso dá força para a junção com o crânio. Janelas perfeitos são reprodutíveis e permitir a imagiologia repetido até 8 semanas após a sua produção (Figura 2C). Imagens produzidas por estas janelas óptimos será como as observadas na Figura 3Bi. Imperfeições na geração janela irá produzir imagens de baixaqualidade, por exemplo, bolhas de ar sob a janela irá impedir campos inteiros de exibição que está sendo trabalhada, áreas aparece escuro como o ar impede a gravação a laser (Figura 3Bii). Com excesso de cola e acrílico sobre a lamela haverá um elevado nível de fundo fluorescência e áreas do campo que está sendo apagado, como visto na Figura 3Biii, da mesma forma, se há sujeira nas janelas pequenos pontos de fluorescência de fundo será visível no campo (Figura 3Biv).

O sucesso da ICW imagiologia é predeterminado pela integridade da técnica cirúrgica, no entanto, até mesmo ICWS óptimas podem ter problemas durante a sessão de imagem. Como tal, uma gama eo grau de clareza existe nas imagens geradas como pode ser visto na Figura 3. A qualidade de imagem publicação retratado na Figura 3C ocorre quando tudo está ótimo. Embora não seja possível, para todos os ratos, é realista esperar que 80% da imagems gerado para ficar assim. Uma das principais falhas na configuração microscopia corrente é o uso de lasers invertidos. Ratos têm de ser posicionados em suas costas e isso resulta em estresse excessivo e desconforto que pode levar à dificuldade para respirar durante a imagem. Isto produz uma imagem "alinhado" como a respiração interfere com a média que ocorre durante a criação da imagem, pelo que, cada fila de pixels é fotografada e quatro vezes a média dos quatro é apresentado na imagem final. Qualquer movimento durante o cálculo da média, como a causada pela respiração difícil, vai criar um artefato que aparece como uma linha na imagem, como pode ser visto na Figura 3D. Ratos que são insuficientemente anestesiado durante o exame pode encontrar esse problema também. O efeito "alinhado" pode ser diminuída, limitando a imagem média em que, no entanto, este por sua vez irá reduzir a qualidade da imagem e não pode eliminar o problema. Alternativamente, os ratos podem ser reposicionados ou repetida quando a respiração se normalizou. O uso de of um 2PLM verticais negaria este problema como ratos pode ser trabalhada "na posição prona. Um problema adicional com a imagem sobre um 2PLM invertido inclui a acessibilidade limitada para posicionar a ICW uma vez que o ratinho está no microscópio, e isto leva a imagens 'segmentados' como as observadas na Figura 3E. Aqui, o laser e lamela não estão posicionados perpendicularmente uma à outra e, como tal, a imagiologia ocorre em um ângulo. Isto resulta na geração de uma imagem de "segmentada", onde os lados do campo de visão não são gravadas. O problema é resolvido facilmente com o reposicionamento do rato para assegurar a lamela é completamente horizontal uma vez sobre a cabeça de montagem como visto na Figura 3Aii.

O modelo apresentado aqui foi usado especificamente para examinar o papel de BMDCs na vascularização do tecido tumoral e demonstra a capacidade de usar três canais diferentes ao mesmo tempo (Cherry, GFP, Far-vermelho - Alexa647 e APC) fazendog PCP e SHG redundante para esta história particular. Fomos capazes de ratinhos da imagem longitudinalmente por até 8 semanas, estudando o recrutamento ea integração de células de MO na vasculatura de um único nível de célula, sem efeitos prejudiciais causados ​​pela janela. Este modelo demonstra a facilidade de coleta de informações dinâmicas sobre a origem e formação da vascularização e da interação de diferentes tipos de células de interesse, previamente perdidos através do ponto final de análise histológica.

Passo	Problema	Raciocínio	Solução
1.4	Osso quebrar	Ferramentas Blunt	Recolha de medula óssea formar um rato fresco com uma tesoura afiada ou bisturi fresco, fragmentos de ossos irá inibir a injeção de TV
1.5	Baixa extração (baixo viscosity)	Endplates osso cortado muito distal; método de coleta de pobres	Bones deve ser cortado como proximal possível e coletados com o osso no interior do tubo de recolha para evitar respingo de volta Tempo deve ser gasto para extrair o máximo BM e com cuidado Se a piscina necessário mais do que um rato em 1 ml
	Extração de alta (alta viscosidade)	Buffer de coleta baixo	Diluir a solução com acréscimo de 0,1% BSA, dividido em três ratos destinatário até 500 mL por rato máximo
1.6	Bad injeção intravenosa	Vasodilatação pobres e visibilidade navio	Melhorar a dilatação com lâmpada de calor. Coloque o rato em restrainer veia da cauda com construído em fonte de luz para ajudar o acesso
1	Ratos doentes	Infecção	Sacrificar camundongos de acordo com as regras da instituição. Certifique-se de caudas são limpos antes da injeção e verificar a esterilidadeextraídos do BM na cultura
	Ratos morrer	Má absorção BM	Verifique% de absorção fluorescente BM de rato morto. Otimizar TBI para linhagem de camundongos sendo usados Aumenta quantidade de BM injeção (por exemplo o uso de um camundongo doador para dois destinatários)
2.4	Hemorragia Minor	Dura violado durante a perfuração	Pressão com almofadas de gel e solução salina estéril e lavagem contínua
	Grande hemorragia	Cérebro danificado por perfuração	Sacrifício do mouse de acordo com as diretrizes da instituição
2.8	Bolhas de ar sob a lamela	Mau contato com a superfície cortical impede a colocação adequada	Remover lamela e adicionar PBS extra para flutuar sobre a lamela da janela para remover as bolhas
2.10	Derrapagem de lamela durante a colagem	Acrmassa ylic é pesado, colocando pressão sobre a lamela e move-se a lamela para fora do caminho	Pinças deve ser usado para armazenar lamela para baixo, enquanto Vetbond e acrílico é aplicada
4.2	Bad injeção intravenosa	Vasodilatação pobres e visibilidade navio	Melhorar a dilatação com lâmpada de calor. Coloque o rato em restrainer veia da cauda com construído em fonte de luz para ajudar o acesso
4.4 Figura 3C	Imagens 'alinhados'	Trabalharam ou respiração irregular	Retire do mouse de quadro e permitir a recuperação Aumentar o nível de anestésico administrado e ajustar a posição para garantir o pescoço não é excessivamente flexionado ou estendido para impedir a respiração
Figura 3C	Image 'segmentada'	Cérebro não é paralelo aos objetivos	Ajuste a posição da lamela para garantir que ele é plano
	Navio não visualizou	injeção não vi intravascular	Refazer injeção na veia da cauda alternativa, rabo quente para garantir uma boa vasodilatação
	Alta fundo	Sujo lamela, Bolhas de ar, acrílico	Limpe com pano úmido lamela de etanol a 70%, não encharcar como podem penetrar em acrílico e danificar o tecido cerebral

Tabela 2. Solução de problemas. Uma diretriz para medidas corretivas necessárias para áreas problemáticas dos procedimentos.

Schemata 1. Diagrama de fluxo Experimental. Isso demonstra o cronograma de eventos por meio de medidas experimentais 1-4. Modelos de mouse são configurados mais de uma semana, agarantir a BM reconstitui corretamente, e não são tratados com a droga até o dia 7 do tumor para garantir os enxertos tumorais. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 1. Reconstituição BM. (A) procedimento de extração BM i. Dissecção dos ossos dos membros posteriores. Ii. Fêmur e tíbia dissecado dos membros posteriores, limpo e pronto para a extração. Iii. Ossos com placa final removida e lavada através, demonstrando a aparência branca dos ossos vazios. (B), demonstrando que Schemata nervuras laterais para injecção são posicionados na cauda.

Figura 2. Geração ICW. (A) a instalação asséptica recomendado (B), i. Superfície do crânio exposta revela os marcos necessários para a cirurgia, a ICW deve ser posicionada no hemisfério direito, equidistantes do bregma e lambda. Ii. Periostieum içadas com solução de lidocaína, pronto para a remoção . iii. gancho dental necessário para a remoção do fragmento de osso gerados com a broca. iv. acabamento ICW com acrílico dental. (C) de três janelas exemplo demonstrar a reprodutibilidade do método.

Figura 3. 2PLM resultados esperados. Todas as imagens mostram verde BM, tumor vermelho, azul (pseudo cor muito vermelha) vasculatura. (A) i. Demonstra o quadro cabeça que mantém o fluxo de isoflurano dentro da pequena irradiador animal. A 8 x 11 mm mira também podem ser vistos movendo-se através do pórtico. Ii. Mouse no invertido posicionados no quadro cabeça necessário para geração de imagens, plastercine moldável garante todas as janelas podem ser acomodados. (B) Fotos demonstrativos dos resultados de problemas com a geração de janela a partir de i. uma janela ideal, ii. uma janela com bolhas de ar presas embaixo, iii derrame acrílico sobre a lamela e iv. sujeira na própria janela. (C) Destaca os problemas que ocorrem com a imagem seguindo geração bem sucedida de um ICW i. ótima imagem ii artefatos. respiratórioscriar uma imagem de 'alinhado' iii. lamela não perpendiculares ao laser gerar uma imagem "segmentada". Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4. Utilizações funcionais e adaptações do modelo. (A) PCP pós processamento de imagem da imagem em que a GFP é subtraída da imagem PCP para revelar a imagem PCP verdade que pode ser sobreposta aos outros três canais em branco. Verde BM, tumor Vermelho Branco CSCs, Azul (pseudo cor muito vermelha) vasculatura (B) Demonstração das fibras de colágeno que pode ser fotografada com SHG. verde Dextran, BM vermelho, Cyan colágeno (C) i. células VEGFTrap em VITRó demonstrar o sinal de GFP produzida com o VEGFtrap. ii. In vivo de imagens demonstra que as células VEGFtrap claramente e, além disso destaca a facilidade de mudar de canal para demonstrar o sistema que você está olhando. VEGFTRap Verde + Tumor, BM Vermelho, Azul (pseudo colorida vermelho longínquo) vasculatura. (D) Demonstra a recolha de fluoresceína no estroma do tumor e não em células directamente, mostrado pela falta de sinal verde de sobreposição com o tumor vermelho. Verde Fluorescein, tumor Vermelho. Clique aqui para ver a figura maior .

Discussão

Os três canais descritas todas as imagens até agora são intercambiáveis ​​por três marcadores de interesse em outros modelos e folhas de pesquisadores com um inestimável conjunto de ferramentas para procurar uma numerosos tipos de células e interações. O planeamento é necessário para assegurar que todos os marcadores e tipos de células integraram com sucesso uma molécula repórter fluorescente em um canal diferente.

Além dos três canais padrão usados ​​aqui que também foram capazes integrar um quarto canal PCP (Figura 4A) e uma base de colagénio SHG canal ⁷ (Figura 4B). Isto prolonga a possibilidade de olhar para interacções celulares in vivo e, além disso permite a de utilizador para realizar a mistura da população para estudar as interacções célula-célula específicas mantendo dois canais para outros marcadores. Por exemplo, nós olhamos células tumorais (RFP) e as células-tronco cancerosas (PCP) na proporção de 1:3 com um interesse em comparar o seu intratuminterações orais (Figura 4A). Observou-se que sete dias pós-implantação da população mista a relação foi confirmada e duas populações de células ainda podia ser visto.

O canal PCP fornece problemas técnicos, devido à sobreposição com o canal de GFP em ambos os espectros de excitação e de emissão e, como tal, o pós-processamento de imagem requer a definir o verdadeiro PCP + células daqueles que estão efectivamente a GFP +. Pós-processamento de imagem pode ser efectuada nos microscópios 2-photon construídos em software Zeiss LSM directamente através do qual, a GFP é subtraída da imagem a partir da imagem resultante PCP em células PCP verdadeiros sendo deixadas para trás (Figura 4A). A premissa para a relação de subtração é dependente de imagens igualmente brilhantes e é devido ao PCP do laser (458 nm) fluorescentes tanto PCP e células GFP, enquanto o GFP a laser (488 nm) é muito alta para fluorescência das células PCP. Além PCP também foram capazes de utilizar configurações previamente publicados para olhar o SHGníveis e assim retratam as fibras de colagénio que constituem a membrana basal em torno vasculatura, (Figura 4B).

Outra adaptação deste modelo foi feita vantagem de uma pequena irradiador animais construído sob encomenda, que tem a capacidade de utilizar a radiação guiada estereotáxico para irradiar secções do tecido tão pequena como 2 mm de diâmetro. Visando a janela com a irradiação é possível olhar para a radiação tem efeito sobre o tecido subjacente. Temos um estudo publicado recentemente olhando para a radiação tem efeito sobre o tecido cerebral normal relativamente ao recrutamento de BMDCs à vasculatura, olhando especificamente para o seu papel em modificações pós-radiação dos tecidos. Descobrimos que o recrutamento dos BMDCs era tanto tempo e dose-dependente no tecido normal ^11.

É possível estudar os mecanismos de fornecimento e integração de terapêuticas que fornecem o medicamento é marcado com um marcador fluorescente. Durantenossa pesquisa, temos sido capazes de controlar a produção de VEGFTrap, uma droga anti-angiogênico que bloqueia toda a sinalização de VEGF no local de produção ^25. Ao modificar geneticamente as nossas células tumorais para expressar o gene VEGFtrap juntamente com um IRES para EGFP (Figura 4ci) e usando RFP 'doador' BM fomos capazes de a imagem da EGFP: produção VEGFtrap, interação BMDC e vasculatura simultaneamente (Figura 4Cii). Este resultado demonstra a versatilidade do modelo e os canais disponíveis. Também é possível olhar na cinética do fármaco, devido à promessa de resolução de uma única célula. Fluoresceína (GFP +) é utilizado para delinear os tumores durante a cirurgia para assegurar a ressecção máxima é atingida ^26. Por injecção intravenosa de imagem, embora seja possível demonstrar que a delimitação não ocorre através da absorção activa da fluoresceína nas próprias células do tumor, mas em vez disso, através da recolha do fármaco para a área do estroma com o tempo, visto pela ausência de co-localização de 10 min após a injecção da fluoresceína (Figura 4D).

No geral a nossa estratégia combina técnicas novas e existentes para conseguir uma plataforma experimental original, o que é vantajoso no estudo das interacções celulares dinâmicas. Esta estratégia tem provado ser uma abordagem de valor inestimável para examinar a evolução dinâmica de uma única célula de alta resolução de BMDC, tumor e normal da vascularização do cérebro em resposta à terapêutica, intracraniana. Intravital de imagem podem proporcionar uma melhor compreensão dos reguladores moleculares de recrutamento BMDC, migração e diferenciação na vasculatura do tumor intracraniano cérebro, bem como muitos outros processos dinâmicos adaptáveis ​​a outras áreas de investigação. Factores putativos inibidores que regulam BMDC em combinação com outras estratégias terapêuticas podem ajudar a identificação da temporização precisa de terapias combinatórias. Além disso, esta estratégia pode ser adaptada a muitas futuro projects utilizando não apenas in vivo corantes de coloração intravital, mas também pequenos inibidores moleculares e nanopartículas que são fluorescente etiquetado permitindo aos pesquisadores traçar a distribuição e os padrões de migração de terapêuticas mais específicas, bem como olhar longitudinalmente em sua cinética.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
NODSCID mice	Jackson Lab	001303	8 week old
B5/EGFP Mice	Jackson Lab	003516
ACTB/DsRED mice	Jackson Lab	005441
Tear Gel	Novartis	T296/2
2% Lidocaine-Epinephrine	Bimeda MTC	25SP	Use neat
Vetbond	3M	1469SB
Self curing acrylic kit	Bosworth	166260	Use ~30% (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647	Invitrogen	D22914	Use @ 0.6 mg/kg in Saline
CD31-APC	BDPharmingen	551262	Use @ 0.3 mg/kg in Saline
AK-fluor (Fluorescein) 10%	AKORN inc.	NDC 17478-253-10	Use @ 7.7 mg/kg in Saline
Betadine solution	Purdue Products	NDC 67618-150
Equipment
Fine Tweezers	VWR	82027-402
Fine Dissection Scissors	VWR	25870-002
22G Needle	BD	305156
27G 0.5 ml TB syringe	BD	305620
Handheld Micro-Drill	Fine Science Tools	18000-17
2.7 mm Trephine drillbit	Fine Science Tools	18004-27
10 μl 30G Hamilton syringe	Sigma Aldrich	20909-U
Glass Coverslip 3 mm	Warner Instruments	64-0720 CS-3R
Fluorescence goggles	BLS	FHS/T01	Basic head frame
Stereotaxic frame	stoelting	51950
Mouse restrainer for IV injection	Brain Tree Lifescience	MTI