Роман с высоким разрешением<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображений методика исследования динамических характеристик внутричерепных структур к росту опухоли и терапии

Резюме

Мы описываем роман В естественных условиях Метод визуализации, который пары флуоресцентных химерных мышей с внутричерепным окнами и высоким разрешением 2-фотонной микроскопии. Это изображение платформы СПИД исследования динамических изменений в тканях мозга и микрососудов, на уровне одной клетки, следующие патологические оскорбления и адаптируется для оценки внутричерепного доставки и распространения наркотиков.

Аннотация

Мы успешно интегрировали ранее установленные внутричерепных окна (МСЖ) технологии ^1-4 с прижизненной 2-фотонной конфокальной микроскопии в разработке нового платформа, которая позволяет для прямых долгосрочных визуализации структуры тканей интракраниально изменений. Изображениями на одной разрешение ячейке в режиме реального времени мода обеспечивает дополнительную динамическую информацию, кроме предоставляемой стандартной конечной точки гистологического анализа, который смотрит только на сечения "моментальный снимок" ткани.

Установление этого прижизненный метод визуализации в люминесцентных химерных мышей, мы можем изображение четырех флуоресцентных каналов одновременно. Объединив флуоресцентно меченых клеток, таких как GFP + костный мозг, это можно проследить судьбу этих клеток изучения их долгосрочной миграции, интеграции и дифференциации внутри ткани. Дальнейшая интеграция вторичного элемента репортер, например опухолевой линии mCherry глиома, позволяет характеристикиризации из межклеточное взаимодействие. Структурные изменения в ткани микросреды могут быть выделены путем добавления внутри витальных красителей и антитела, например антитела CD31 помеченный и декстран молекул.

Кроме того, мы расскажем, что именно наша модель визуализации ICW с небольшим животных микро-облучатель, который обеспечивает стереотаксической облучения, создавая платформу, через которую динамические изменения тканей, которые происходят после введения ионизирующего излучения могут быть оценены.

Текущие ограничения нашей модели включают проницаемость микроскопа, которая ограничена на глубину до 900 мкм от подкорковых поверхность, ограничивая изображений на оси спинного мозга. Присутствие кости черепа делает МСЖ более сложной технической процедуры, по сравнению с более созданы и использованы камера модели в настоящее время используется для изучения ткани молочной железы и жировые ^5-7. Кроме того, ICW провиды многие проблемы при оптимизации изображений.

Введение

Лучшего понимания структурных и биологических изменений, возникающих в мозге в ответ на различные патологии и лечебных мероприятий, имеет решающее значение для улучшения стратегии лечения. Тем не менее, одна из текущих проблем в изучении этих структурных и биологических изменений, особенно в отношении внутричерепной патологией, является недоступность ткани и невозможности изучения временной эволюции и динамического прогрессирование изменений в естественных условиях. Поколение "окна" технологии ранее оказались успешными в изучении изменений мягких тканей через развитие опухоли ^5-7. Разработка моделей МСЖ оказывается более технически сложной задачей, в связи с необходимостью, чтобы удалить кости черепа без повреждения о возбуждении инфекции в основной мозговой ткани. Предыдущих работах попытались тонкий череп, чтобы визуализировать ткани ^8-10 Тем не менее, для получения высокого разрешения ясно IMвозраст полное удаление кости черепа требуется ^11. Повторите долгосрочных томография (30 дней +) лишь недавно стала реальным вариантом путем создания образов ^1,11, ранее более короткие временные рамки были изучены ^5.

За последнее десятилетие основной целью было выяснить происхождение нео-сосудистой следующие патологические раздражители, в частности в ответ на образование опухоли и прогрессии, разработка новых терапевтических мишеней для лечения опухолей. Остается много спорных вопросов вокруг источника новой сосудистой системы в мозге во время развития опухоли или после излучения. Традиционно васкуляризации считалась происходить через ангиогенез, процесс, при котором новые сосуды образуют от прорастания уже существующих судов ^12. Более поздние исследования, однако, показывают, что ранее предполагалось, эмбриональные процесс сосудов может играть более значительную роль в формировании патологической сосудистой сети. Vasculogenesis включает в себя набор взрослым коллегам ангиобласт из костного мозга, в свою очередь, затем непосредственное участие в формировании новых эндотелия кровеносных ^12-14. Количество фактов говорит, что эндотелиальные клетки-предшественники мобилизованных из костного мозга, чтобы начать заново сосудов в ответ на онкогенные посредники ^15-17. Однако, эти исследования дают противоречивые показания для прямого вклада этих костного мозга клеток (BMDCs) до эндотелия сосудов с процентным вкладом изменяющиеся в зависимости от типа патологического стимула и реакции на лечение ^18-21.

Таким образом, создание воспроизводимых экспериментальных методов, которые позволяют с высоким разрешением прижизненной визуализации для повторного долгосрочного исследования процесса BMDC интеграции в сосудистую сеть опухоли и в ответ на терапию имеет неоценимое значение. Стандартные гистологические методы не обеспечивают динамическое Inforполучения необходимой информации для определения долгосрочного выживания, дифференциации и интеграции клеток, которые приводят к сосудистой и поэтому не может продемонстрировать окончательно механизмы клеточного взаимодействия.

Мы показали, используя наш экспериментальный подход, что существует различная степень BMDC после набора как внутричерепное ионизирующего излучения и рост опухоли, вербовки, которая, однако, патология конкретного участка, а не вторжением всего внутричерепной ткани ^11,22. Мы показали, что вербовка следующим чувствительным временем картина свидетельствует повторное отображение одного животного ^11,22. Аналогичным образом, в естественных изображений также может оказать неоценимую понимание клетки опухоли мимика которой флуоресцентно меткой опухолевые клетки могут быть отображены и отслеживаться с внутри-CD31 антитело жизненно важных для эндотелиальных клеток, чтобы выделить возможность опухоли трансдифференцировку клетки непосредственно формировать собственные эндотелия.

Универсальность модели усиливается способность к изображению 4 флуоресцентных каналов, обеспечивая исчерпывающий число комбинаций для исследования различных клеточных и биологических процессов. Мы в состоянии прижизненно изображения CFP (синий), GFP (зеленый), вишня / RFP (красный), и Alexa647/APC (дальний красный), одновременно в одном поле несколько раз с течением времени. Исследователи можно генетически модифицировать клетки выразить флюорохромы для каждого из каналов, а также покупки красители и антител для выделения структурных изменений представляет особый интерес. На сегодняшний день красителей и антитела, обычно используемые в исследованиях, включают CD31 и декстран котором оба выделить микрососудов и его изменений в ткани ^1,11,23,24, хотя мы использовали дальнего красного канала для этой цели оба доступны для использования в других названных каналов. Аналогичным образом, другие красители Sytox включая Orange, которая позволит установить области апоптоза, и маркеры, такие как те, от компании VisEn, были SPEcifically предназначен для использования в естественных условиях. В дополнение к четырем обычно используются люминесцентные названных каналов, второй гармоники (ГВГ) канал можно добавить и оптимизированы для изображений эндогенных коллагеновых волокон модели ^7, визуализируя базальной мембраны окружающих сосудов.

Чтобы продемонстрировать адаптивность нашей модели, а также межклеточных взаимодействий уже упоминалось выше, мы смогли с исследуемым препаратом межклеточных взаимодействий. Мы рассмотрели, как наркотик ингибиторы AMD3100, SDF-1 ингибитор, и его роль в передаче сигналов сетей, занимающихся BMDC наборе ^11. Аналогичным образом мы генной инженерии из U87 глиомы ксенотрансплантатов клеток экспрессировать VEGFTrap, ингибитор VEGF ^25, в сочетании через IRES к GFP молекулы. Используя RFP + BM мы можем изучить роль VEGF имеет о наборе BMDCs в сосудистую. Совсем недавно мы использовали модель для изучения кинетики препарата глядя на MEChanism за опухолью разграничения препарата флуоресцеина ^26, на клеточном уровне. Благодаря использованию специально построен в дом небольшой облучатель животных мы смогли интегрировать стереотаксической доставлены излучения для оценки отклика как опухолевые, так и BMDCs к лечению.

С помощью нашего нового метода исследователи прижизненной визуализации будет разобраться в одноклеточных реальном времени изменения, которые происходят при различных патологиях и систем, помогая выяснению многих функциональных и биологических особенностей изменения тканей.

протокол

Все животные работа была проведена в рамках уходу и использованию животных КОМИТЕТ утвержденного протокола и выполнена с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов.

Для устранения неполадок ссылкой Таблица 2.

1. Восстановление костного мозга (необязательно) Рисунок 1 (30 мин подготовки, 5 мин на мышь)

Все операции должны быть выполнены с использованием строгого асептических с автоклавного стерильное оборудование.

Один из доноров мыши воссоздать трех мышей хозяин.

1. Анестезировать получатель NODscid мышей и позиции, со свинцом, чтобы защитить голову, внутри центра облучателя Gammacell 40 'вымогатель.
2. Облучать NODscid мышей с 2,5 Гр тотального облучения тела (TBI).

Важным шагом Оптимизация TBI может быть необходима в связи с изменением дозы, необходимой для достаточного иммунного сеLL истощение в различных линиях мышей.

Пауза точки: Host мышей можно облучить заранее, но следует использовать в течение 24 часов облучения.

3. Усыпить донора мышей в соответствии с ведомственным руководящим принципам ухода за животными комитета. Очистите задние конечности и удалите кости и бедренной кости с обеих, лишая все лишние ткани из костей (рис. 1ai, 1aii).

Важнейший шаг: малоберцовой кости не являются жизнеспособными для использования в связи с очень узким просветом.

4. Удалить торцевые пластины с обоих концов четыре извлечены кости и промойте их с помощью иглы 22 г и 1 мл стерильной PBS, пока они не белые по внешнему виду (рис. 1aiii). Ссылка Таблица 2.
5. Смешайте извлеченную костного мозга (КМ) Подвеска хорошо и привлечь 300 мкл на три иглы 27 G туберкулин. Извлеченные BM должен содержать около 2 х 10 ⁷ клеток иДостаточно в течение 3 реципиента reconstitutions. Ссылка Таблица 2.
6. Введите суспензии в латеральную хвостовую вену из трех предварительно облученных мышей NODscid с шагом 1,1 (рис. 1b). Ссылка Таблица 2.

ВНИМАНИЕ: Для проверки стерильности BM вводят мы рекомендуем посева оставшиеся BM и культуры в течение 24 часов, чтобы проверить на инфекцию. Основной причиной смерти на данный момент является инфекция в недавно восстановленной мышей.

2. Внутричерепное поколения Window - рисунок 2 (30 мин на мышь)

Все операции должны быть выполнены с использованием строгого асептических с автоклавного стерильным оборудованием и под инфракрасной лампой держать животных теплой (рис. 2А).

1. Анестезировать получатель NODscid мышей с IACUC утвержденных анестетик, Авертен IP-инъекции в дозе 0,5 мг / г, и положением, свинцом для защиты головы, в центреGammacell 40 'вымогатель "облучателя. Удалить волосы из головы. Кроме того применяются слезу геля, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы.
2. Чистая кожа головы первого раствором Бетадин, а затем с алкоголем, а затем сделать разрез от середины ушей до чуть выше глаз. Удалить кожу головы 3 мм обе стороны от первого разреза, обнажая череп и достопримечательностей поверхности черепа (рис. 2Bi).
3. Поднимите надкостницы введением 2% раствора лидокаина: адреналина решения и отсечь от поверхности черепа (рис. 2Bii).
4. Использование 2,7 мм трепана дрель, ослабить 2,7 мм круг черепа по коре правого полушария между лямбда и темени. Не проникают в кости со сверлом (рис. 2Biii). Справочная таблица 2.

Важным шагом: если сверло проходит через череп мозга поверхность будет повреждена влияющих результаты с дополнительным TRAУма. Кроме того чрезмерное кровотечение будет происходить предотвращение прозрачное окно из генерируются.

5. Удалите ослабленные лоскута рассечение кости, используя пинцет и стоматологических крюка и преднамеренное но контролируемая сила (рис. 2Biii).
6. (Необязательно) Если глядя на опухолевой патологии, вводят выбранной линии опухолевых клеток (с флуоресцентными ген-репортер) в центре окна, созданного на шаге 2.5.
   1. Загрузите 10 мкл 30 G Гамильтон шприц с клеточной суспензии и нагрузки иглы в стереотаксической рамки.
      Важным шагом: Число клеток должны быть оптимизированы для опухолевых клеток в использовании и сроки роста требуется. Для U87 культур мы используем 2 х 10 ^{5 клеток} в 10 мкл на мышь.
   2. Загрузите мыши на цифровую рамку стереотаксической выровнять иглу к центру точки окна генерируется.
   3. Нижняя игла пока он не коснется поверхности коры и сброса цифровых координат.
   4. НизкийER иглу до 3,2 мм в ткани коры и вводят в 3 мм в глубину.
   5. Уберите иглой медленно снимите мыши с рамы.
      Важнейший шаг: Введите решения в течение срока действия 1 мин и оставить в положении иглы после инъекции, чтобы обеспечить уменьшение обратного потока.
      Важнейший шаг: Если незначительные кровотечения встречается орошения стерильным физиологическим раствором в течение 1-5 мин, чтобы остановить кровотечение поверхностны. Продолжать с последующим шагам.
7. Смочить поверхность мозга с каплей стерильного PBS сохранить ткани мозга орошается.
8. Поплавок 3 мм покровным на поверхности мозга, чтобы запечатать полностью вокруг 2,7 мм окно генерируется. Ссылка Таблица 2.
9. Сухие окружающие кости черепа Vetbond затем применить ко всей подвергается черепа запечатать тканей головы до костей черепа и покровных на месте. НЕ наносите избыточное, как это будет протекать под стекло и уменьшения изображения потенциал.
10. Мих свежий зубной порошок акриловые и раствор, примерно 30% (вес / объем), а также применять поверх Vetbond. Для обеспечения герметичности перекрытия акриловых слегка на край покровного стекла (рис. 2Biv). Справочная таблица 2.

ВНИМАНИЕ: Стоматологические акриловые крайне опасно, поэтому мы рекомендуем использовать перчатки и маски во всех процедурах.

Важнейший шаг: Стоматологическая акриловая должно оставаться гибким в процессе формования для обеспечения хорошего уплотнения и снижения лишнего. Наращивание акрил окно размытия картинки.

11. Разрешить мышей, чтобы восстановить в теплой клетке.

3. Стереотаксической радиации (дополнительно) - рисунок 3 (25 мин на мышь)

Вариации будут существовать в различных излучателей использовать и в качестве такой оптимизации будет требоваться. Мы использовали специально созданных облучателя.

1. Анестезировать мышейизофлураном на уровне 4% для индукционных последующим 1,5-2% на протяжении всей процедуры с 0,5-1 литра O ₂ мин, а на месте головы пользовательские фиксатор внутри стереотаксической облучатель (рис. 3AI).
2. Получают 360 ° конус луч КТ с рентгеновской трубки работает на 40 кВп и 0,05 мА через 2 мм алюминий фильтра. Использование изображений для направления движения этап, направляя излучение изоцентр для правого полушария обеспечение это центральное в спинного брюшной направлении.
3. Вставьте полушария коллиматор, 8 мм х 11 мм блока.

Важнейший шаг: коллиматоры могут быть разработаны для различных установок и так может быть повышена для включения и исключения различных частях мозга. 8 мм х 11 мм определяет полушария области мозга.

4. Получение одного КТ ортогональных изображений и сверху (AP) и нижней (PA) через коллиматор для дальнейшего повышения размещение головного мозга, Anatomical костных структур могут быть использованы для воспроизводимости результатов.
5. Биржи алюминиевый фильтр для обработки меди 0,93 мм фильтровать и управлять половину нужной дозы облучения с рентгеновской трубкой работает на 225 кВп и 13 мА сверху в направлении AP.
6. Возврат портальный в нижнее положение и администрировать второй половине дозы облучения снова с рентгеновской трубки работает на 225 кВп и 13 мА форме нижней по направлению PA.

Важным шагом: Очень важно, чтобы облучать из верхней и нижней части, чтобы уменьшить градиент RT через ткань головного мозга, но также помогает с выравнивание изоцентр к центру мозга.

4 В естественных условиях двухфотонного лазерной микроскопии -. Рисунок 3 (1-3 часов за сессию)

Вариации будут существовать в различных микроскопов и, таким оптимизации потребуется. Мы использовали Carl Zeiss LSM510 META лазерного сканирования Confocдр. микроскопом.

1. Анестезировать мышей с IACUC утвержденных анестетики, Avertin IP инъекций в дозе 0,5 мг / г, а чистая окно с помощью алкоголя спрея.
2. 1. (Необязательно) Введите отмеченных сосудистых краситель 5-10 мин до изображений, в хвостовую вену до визуализации. Alexa647-декстрана использовали при 0,35 мкг / г или APC-CD31 используется на 0,2 мкг / г. См. таблицу 2.
   2. (Необязательно) Введите флуоресцеина через хвостовую вену в дозе 7,7 мг / кг, за 5 мин до изображений, чтобы очертить опухоль. Ссылка Таблица 2.
3. Установка каналов на конфокального микроскопа, как это определено флуорохромом, используемых в химерной мыши генерируется. Таблица 1 демонстрирует каналов описаны в этой модели.
4. Инверсия мыши на подвижный столик микроскопа и стабилизации головы в положении с формовочную пластилина. (Рис. 3Aii) Ссылка Таблица 2.

<р = класса "jove_content"> Важнейший шаг: ICW должно быть перпендикулярно лазерному точки и как таковой должен быть расположен горизонтально для обеспечения визуализации является оптимальным.

5. Включите первый лазерный канал и использовать на позицию в центре ICW.
6. Используйте 5-кратным и сделайте снимок всего окна для использования в качестве карты для дальнейшего более высокого разрешения.
7. Изображений должно быть осуществлено с использованием 10X и 20X линзы 'дальний', чтобы получить лучшее качество изображения.

Важнейший шаг: Каналы и задачи на 2PLM должно быть настроено с помощью сконструированные клетки в пробирке до визуализации мышиных моделях, чтобы обеспечить их выделить правильный флуорохрома.

Флюорохром	CFP	GFP / флуоресцеина / FITC	mCherry / RFP / DsRed	APC / Alexa647	SHG аутофлуоресцентной
Лазерного возбуждения	458 нм	488 нм	543 нм	633 нм	Chameleon лазерные 820 нм
Коллекция Фильтр	480-520 нм	500-550 нм	565-615 нм	650-710 нм	390-465 нм

Таблица 1. Флуорохром установки. Руководство для пользователя, чтобы увидеть лазерным возбуждением и коллектор эмиссионных спектров использовали для каждого из каналов, доступных в модели.

Результаты

Необязательный этап воссоздания костном мозге мышей NODscid должно привести к 80% поглощение флуоресцентных BM 'доноры' в 100% «хозяин» NODscid мышах, однако оптимизация TBI будет необходимо для повышения восстановления в других, не -immunocompromsed штаммов. Если мышам неудачно восстановленные они болеют и умирают быстро в соответствии с процедурой, ослабленный мышей может потребоваться дополнительное питания и источников воды.

ICW как только закончите должно выглядеть, как показано на рисунке 2Biv. Это идеальное место, чтобы иметь хребта акриловых окружающих стекло покровное, так как это дает силы присоединиться к черепу. Идеальный окна воспроизводимым и позволяют повторять изображение на срок до 8 недель после их генерации (рис. 2С). Изображения, через эти окна оптимальной будет выглядеть как показано на рисунке 3BI. Дефекты в окне поколения будет производить образы бедныхКачество например, пузырьки воздуха под окном предотвратит целые поля зрения изображаемого, области будет темным, как воздух, предотвращает лазерной визуализации (рис. 3Bii). С избыточный клей и акриловые на покровное будет высокий уровень фона флуоресценции и районах области быть уничтожены как показано на рисунке 3Biii, так же, если есть грязь на окне маленькие точки фоновой флуоресценции будут видны в области (рис. 3Biv).

Успех ICW изображений предопределено целостность хирургической техники, однако, даже оптимальная ИВВ может столкнуться с проблемами во время отображающей сессии. Таким образом, диапазон и степень ясности существует в изображения, создаваемые, как показано на рисунке 3. Изображения публикации качества изображается на рисунке 3C происходит, когда все является оптимальным. Хотя это и не возможно для всех мышей, вполне реально ожидать 80% изображенияс генерируется выглядеть следующим образом. Одним из основных недостатков в текущей настройки микроскопии является использование перевернутой лазеров. Мыши должны быть расположены на спине, и в результате чрезмерного напряжения и дискомфорта, которые могут привести к затрудненное дыхание во время визуализации. Это приводит к "картонных" изображение в качестве дыхание мешает усреднение, которое происходит во время формирования изображения, при этом каждый пиксель строка изображается четыре раза, и среднее значение четырех отображается в конечном изображении. Любое движение при усреднении, вызванного, например, на затрудненное дыхание, создаст артефакт, который в виде линии на изображении, как показано на рисунке 3D. Мыши, которые являются недостаточно анестезию во время съемки может столкнуться с этой проблемой тоже. "Картонных" эффект может быть уменьшен за счет ограничения изображение усреднения на, однако это в свою очередь будет уменьшать качество изображения, и не может устранить эту проблему. Альтернативно мыши можно перемещать или повторно, когда дыхание нормализовалось. Использование OF вертикально 2PLM свело бы на нет этой проблемы, как мыши могут быть отображены "в положении лежа. Еще одна проблема с отображением на инвертированный 2PLM включает в себя ограниченный доступ для позиционирования МСЖ один раз мышью на микроскопе, и это приводит к "сегментированный 'изображений, как те, в фиг.3Е. Здесь лазера и покровное стекло не расположены перпендикулярно друг другу и, таким изображений происходит под углом. Это приводит к образованию "сегментированный 'изображение, на котором сторонам поле зрения не вошедшие в образ. Эта проблема легко решается с репозиционирование мыши для обеспечения покровного полностью горизонтальное один раз на голову горе как показано на рисунке 3Aii.

Представленная модель была специально используется для изучения роли BMDCs в васкуляризации опухолевой ткани и демонстрирует способность использовать три различных каналов одновременно (вишня, GFP, дальне-красный - Alexa647 и APC) Макинг CFP и ГВГ избыточными для данной конкретной истории. Мы смогли изображения мышей продольно на срок до 8 недель, изучая набор и интеграции ВМ-клеток в сосудистую сеть на уровне одной клетки, без вредных эффектов, вызванных окна. Эта модель демонстрирует легкость сбора динамической информации об источнике и формирование сосудистой и взаимодействие различных типов клеток интересов, ранее утраченные через конечную точку гистологического анализа.

Шаг	Проблема	Рассуждение	Решение
1,4	Кости разрушаются	Блант инструменты	Сбор костного мозга образуют свежей мыши, используя заостренные ножницами или скальпелем свежим, фрагменты костей будет препятствовать ТВ инъекций
1,5	Извлечение низкой (низкая viscositу)	Кость концевых пластинах сократить слишком дистально; слабый метод коллекцию	Кости должны быть сокращены как проксимально как это возможно и собрали с костью внутри пробирки, чтобы предотвратить всплеск назад Время должно быть потрачено, чтобы извлечь максимально BM и с осторожностью При необходимости бассейн более одной мыши в 1 мл
	Высокое извлечение (высокая вязкость)	Низкий буфера коллекции	Развести из раствора с дополнительным 0,1% BSA, Сплит, чтобы получатель трех мышей до 500 мкл на мышь максимально
1,6	Нежелательном внутривенном введении	Плохо сосудов и сосудов видимости	Повышение расширение с инфракрасной лампой. Мышь помещают в вену хвоста фиксатор со встроенным источником света, обеспечивающие доступ
1	Больных мышей	Инфекция	Жертвоприношение мышей в соответствии с правилами учреждения. Убедитесь, хвосты убирали перед инъекцией и проверьте стерильностьдобываемого BM в культуре
	Мыши умирают	Плохо BM поглощения	Проверьте% флуоресцентных BM поглощение мертвую мышь. Оптимизация для TBI штамм мышей используются Увеличение количества BM инъекции (например использование одной мыши-донора в течение двух получателей)
2,4	Малые кровотечения	Dura нарушен во время бурения	Давление с гелем и колодки и непрерывного стерильным физиологическим раствором мыть
	Основные кровоизлияния	Мозг поврежден бурения	Жертвоприношение мыши в соответствии с руководящими принципами учреждения
2,8	Пузырьков воздуха под покровное	Плохой контакт с поверхности коры препятствует правильному размещению	Удалить покровное и добавить дополнительные PBS плавать покровное на окно, чтобы удалить пузырьки
2,10	Скольжение покровного во время склеивания	Acrмодальной массы тяжелая, оказывая давление на покровное стекло и перемещает покровное из пути	Пинцет должен быть использован для хранения покровное вниз, а Vetbond и акриловые применяется
4,2	Нежелательном внутривенном введении	Плохо сосудов и сосудов видимости	Повышение расширение с инфракрасной лампой. Мышь помещают в вену хвоста фиксатор со встроенным источником света, обеспечивающие доступ
4,4 Фиг.3С	"Выложены" изображения	Затрудненное или нерегулярное дыхание	Удалить мыши из рамы и позволяют восстановить Увеличение уровня анестезии и отрегулируйте положение для обеспечения шея не слишком согнуты или расширены, чтобы предотвратить дыхания
Фиг.3С	«Сегментированной имидж	Мозг не параллельно целей	Отрегулируйте положение покровного чтобы убедиться в его плоской
	Судно не визуализируется	инъекции не видел внутрисосудисто	Повторить инъекции в хвостовую вену альтернативные, теплый хвост, чтобы обеспечить хорошую вазодилатации
	Высокий фон	Грязные покровное, Пузырьки воздуха, акриловые	Протрите влажной покровное 70% этанола тканью, не промокают, как может пройти под акриловые и повреждение тканей мозга

Таблица 2. Поиск и устранение неисправностей. Ориентиром для корректирующих мер, необходимых для проблемных участков процедур.

Schemata 1. Экспериментальная схема. Это показывает хронологию событий через экспериментальные шаги 1-4. Мышь модели могут быть сконфигурированы в течение недели, чтобыобеспечение BM восстанавливает должным образом, и не получавших препарат, пока день 7 опухоли для обеспечения опухоли трансплантатов. Щелкните здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 1. BM восстановления. (A) BM процедуры экстракции я. Рассечение кости задних конечностей. II. Расчлененный бедра и голени от задних конечностей, очищены и готовы к добыче. III. Кости с торцевой пластины удалены и промыть, демонстрируя белый цвет пустого костей. (B) Schemata демонстрирующий где боковые жилки для инъекций расположены в хвосте.

Рисунок 2. ICW поколения. (A) асептические настройки рекомендуется (B) я. Открытые поверхности черепа показывает ориентиры необходимы для хирургии, ICW должны быть расположены на правом полушарии на равном расстоянии от темени и лямбда. II. Periostieum поднял с раствором лидокаина, готовые для удаления . III. Стоматологический крюк, необходимые для удаления костного фрагмента, созданных с помощью дрели. IV. Готовые МСЖ с зубной акрила. (C) Три пример окна демонстрации воспроизводимости метода.

Рисунок 3. 2PLM ожидаемых результатов. Все изображения показывают BM зеленые, красные опухоли, синий (псевдо цветным дальнего красного) сосудов. (А) спасибо. Демонстрирует рама головки, которая сохраняет изофлурана потока внутри облучателя небольшого животного. 8 х 11 мм коллиматор может также рассматриваться передвигаться через портальные. II. Мышь в перевернутом расположены в голове кадр необходимые для работы с изображениями, формовочную plastercine гарантирует, что все окна могут быть размещены. (B) Показательное фото итогов проблемы с окном от поколения я. оптимальное окно, II. окна с пузырьками воздуха в ловушку под, III акриловые утечки более покровного и IV. грязи на само окно. (C) Основные проблемы, которые возникают с изображениями после успешного поколения ICW я. оптимальное изображение II . дыхание артефактовсоздать "подкладке" образ III. покровного не перпендикулярно лазерному генерировать 'сегментированных' изображения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4. Функциональное использование и адаптацию модели. (A) CFP пост обработки изображения которого GFP изображения вычитается из CFP изображение, чтобы показать истинный образ CFP, которые могут быть перекрыты другими тремя каналами в белом. BM Зеленый, красный опухоль, ЦОК Белый, синий (псевдо цветным дальнего красного) сосудистая (B) демонстрация волокна коллагена, которые могут быть отображены с ГВГ. Декстрана Зеленый, красный Б.М., Cyan Коллаген (C) я. VEGFTrap клеток в VitrØ продемонстрировать GFP сигнала производится с VEGFtrap. II. прижизненного изображения демонстрирует VEGFtrap клетки четко и в дополнение отмечает простоту переключения каналов для демонстрации системы, которую вы смотрите. Зеленая VEGFTRap + опухоли, BM Красный, синий (псевдо цветные дальнего красного) сосудов. (D) демонстрирует коллекцию флуоресцеина в строме опухоли, а не в клетках напрямую, показали отсутствие зеленого сигнала наложения с красной опухоли. Зеленый флуоресцеина, красный опухоли. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Обсуждение

Три канала описана во всех изображений до сих пор являются взаимозаменяемыми в течение трех маркеров интерес к другим моделям и листья исследователям неоценимую набор инструментов, чтобы посмотреть многочисленные типы клеток и взаимодействия. Планирование необходимо для обеспечения всех маркеров и типы клеток успешно интегрировали молекулы репортера флуоресценцию в отдельный канал.

В дополнение к стандартным три канала, используемый здесь мы также смогли интегрировать четвертый канал CFP (фиг. 4А) и ГСП на основе коллагена канал ⁷ (фиг. 4В). Это расширяет возможность смотреть на клеточных взаимодействий в естественных условиях и в дополнение позволяет Пользователь предпринять населения смешивания для изучения специфических межклеточных взаимодействий при сохранении двух каналов для других маркеров. Например, мы смотрели на опухолевые клетки (RFP) и раковых стволовых клеток (СФП) в соотношении 1:03, заинтересованных в их сравнении intratumустного взаимодействия (рис. 4а). Мы заметили, что через 7 дней после имплантации смешанным населением соотношение было оставлено в силе, и обе популяции клеток еще можно увидеть.

Канал CFP обеспечивает технические проблемы за счет перекрытия с каналом GFP в обоих спектрах возбуждения и излучения и, соответственно, требует пост обработки изображений для определения истинного CFP + клеток от тех, которые на самом деле GFP +. Сообщение обработки изображений может осуществляться на 2-фотонных микроскопов Zeiss построен в LSM программного обеспечения непосредственно которой, изображение GFP вычитается из CFP изображения по вертикали, в истинной CFP клетки остаются позади (рис. 4а). Предпосылкой для отношения вычитание зависит от одинаково яркие образы и связано с CFP лазер (458 нм) и флуоресцирующие CFP и GFP в то время как клетки GFP лазер (488 нм) слишком высока, чтобы светиться CFP клеток. В дополнение к CFP мы также были в состоянии использовать ранее опубликованные установок смотреть на ГВГуровней и так изображают коллагеновых волокон, которые составляют базальной мембраны окружающих сосудистой сети, (рис. 4В).

Другой адаптации этой модели воспользовалась обычай построен небольшой облучатель животное, которое имеет возможность использовать стереотаксической направляемого излучения для облучения кусочки ткани размером до 2 мм в диаметре. По ориентации окно с облучением можно посмотреть на эффект излучение имеет на основной ткани. Мы недавно опубликовали исследование, глядя на радиационное воздействие оказывает на нормальные ткани мозга по отношению к набору BMDCs в сосудистую, глядя именно на их роль в пост изменения ткани излучения. Мы обнаружили, что набор BMDCs было и время, и зависит от дозы в нормальной ткани ^11.

Вполне возможно, для изучения механизмов поставки и интеграция терапии предоставления наркотиков помечена флуоресцентным маркером. Во времянашего исследования мы смогли отслеживать производство VEGFTrap, антиангиогенного препарат, который блокирует все VEGF сигнализации в районе производства ^25. По нашей генетической модификации опухолевых клеток, чтобы выразить VEGFtrap гена в сочетании с IRES к EGFP (рис. 4Ci) и используя BM 'доноры' RFP мы смогли изображения EGFP: VEGFtrap производства, BMDC взаимодействия и сосудистую одновременно (рис. 4Cii). Это показывает универсальность модели и доступных каналов. Возможно также, чтобы смотреть на кинетику препарата обусловлен обещанием одноклеточных разрешение. Флуоресцеина (GFP +) используется для разграничения опухоли во время операции для обеспечения максимальной резекции достигается ^26. Вводя внутривенно в то время как изображения, можно показать, что определение происходит не за счет активного поглощения флуоресцеина в сами опухолевые клетки, но вместо этого путем сбора лекарственного средства в стромальных область тиме, рассматривается в связи с отсутствием совместной локализации 10 мин после инъекции флуоресцеина (фиг. 4D).

В общем наша стратегия сочетает в себе новые и существующие методы для достижения уникальной экспериментальной платформы, что является преимуществом при изучении динамических клеточных взаимодействий. Эта стратегия оказалась неоценимой подхода для изучения высокого разрешения одноклеточные динамической эволюции BMDC, опухолевые и нормальные кровоснабжение мозга в ответ на терапию, интракраниально. Прижизненной визуализации может обеспечить лучшее понимание молекулярных регуляторов BMDC найма, миграцию и дифференцировку внутричерепной сосудистой опухоли головного мозга, а также многие другие динамические процессы адаптированы к условиям других областей исследования. Ингибирование предполагаемых факторов, которые регулируют BMDC в комбинации с другими терапевтическими стратегии могут помочь идентификации точного времени комбинаторной терапии. Кроме того, эта стратегия может быть адаптирован для многих будущих прOjects использования не только в естественных условиях прижизненного окрашивания красителями, но и низкомолекулярные ингибиторы и наночастиц, которые флуоресцентно меткой позволяет исследователям проследить распределения и миграций более целенаправленной терапии, а также смотреть в продольном направлении их кинетики.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
NODSCID mice	Jackson Lab	001303	8 week old
B5/EGFP Mice	Jackson Lab	003516
ACTB/DsRED mice	Jackson Lab	005441
Tear Gel	Novartis	T296/2
2% Lidocaine-Epinephrine	Bimeda MTC	25SP	Use neat
Vetbond	3M	1469SB
Self curing acrylic kit	Bosworth	166260	Use ~30% (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647	Invitrogen	D22914	Use @ 0.6 mg/kg in Saline
CD31-APC	BDPharmingen	551262	Use @ 0.3 mg/kg in Saline
AK-fluor (Fluorescein) 10%	AKORN inc.	NDC 17478-253-10	Use @ 7.7 mg/kg in Saline
Betadine solution	Purdue Products	NDC 67618-150
Equipment
Fine Tweezers	VWR	82027-402
Fine Dissection Scissors	VWR	25870-002
22G Needle	BD	305156
27G 0.5 ml TB syringe	BD	305620
Handheld Micro-Drill	Fine Science Tools	18000-17
2.7 mm Trephine drillbit	Fine Science Tools	18004-27
10 μl 30G Hamilton syringe	Sigma Aldrich	20909-U
Glass Coverslip 3 mm	Warner Instruments	64-0720 CS-3R
Fluorescence goggles	BLS	FHS/T01	Basic head frame
Stereotaxic frame	stoelting	51950
Mouse restrainer for IV injection	Brain Tree Lifescience	MTI