Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Özet

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Özet

Bu, parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun sayısal ölçümler için standart bir optik mikroskop kullanılmasını tarif eder. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. Düşük sayısal açıklık (NA) aydınlatma, zayıf saçılma ve numune tarafından ışığın zayıf emilimi: NIQPM dalga yayılımının basitleştirilmiş bir modeline dayanan, üç temel varsayımlar ile, paraksiyel yaklaşım olarak adlandırılır. Neyse ki, boyanmamış hücre örnekleri bu varsayımları karşılamak ve düşük NA aydınlatma kolayca ticari mikroskopları üzerinde elde edilir. HTDIC yüksek NA aydinlatma altında odak-boyunca DIC görüntüleri hacimsel bilgileri elde etmek için kullanılıration koşulları. Yüksek aydınlatma NA optik eksen boyunca numunenin geliştirilmiş bölümlendirilmeleri sağlar. Hilbert DIC görüntü işleme dönüşümü büyük ölçüde yığınlarının arka olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları artırır. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları "off-the-raf" mikroskop kullanarak teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Ticari kapsamları yavaş z-yığını alma zamanı henüz hızlı 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma lağvetti, ve ikincisi, kırınım etkileri 10'a kadar 0.2 ila nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak: Bu yöntemlerin iki temel sınırlamaları vardır sırasıyla (NIQPM) ve çapı 20 (HTDIC) um. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, çoğu sabit cellular örnekler hali hazırda, bu yöntemler ile incelenmiştir.

Giriş

Optik mikroskop kullanımı artık hücresel organizmaların araştırılmasında her yerde. Nedeniyle görünür optik spektrum üzerinde düşük endojen absorbans ve zayıf saçılma özellikleri, hücreler güçlü onları geçme optik dalgaların genlik etkileyebilir ve böylece standart parlak alan mikroskopları ile görüntülenmiş zaman yarı saydam görünmüyor. Hücresel örnekleri, bununla birlikte, doğrusal ışık hareket ettiği alanı belirli bir bölgede yerel bir kütle yoğunluğunun miktarı ile ilgili bir şekilde, kendi içinde seyahat eden optik dalgalar aşağı yavaş yok. Bu heterojen gecikmeyle veya mikroskobik yoluyla bulaşan optik dalgaların "faz" profilinin yararlanması ilk Fritleri Zernike ¹ tarafından 1935 yılında tarif edilen ve deneysel Zernikein 1942 ² tarafından gerçekleştirilmiştir. Zernike bu başarı için 1953 yılında Nobel ödülü aldı. Zeiss 1945 ³ bu yöntemi ticari. 1955 yılında Smith ve Nomarski diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, bir kontrast mekanizması olarak faz uzaysal gradyanı kullanan bir yöntem kullanımıyla ⁴ ve ⁵ teorisi üzerindeki ilk çalışma mevcut olacaktır. DIC Nomarski ⁶ ile 1965in yakın işbirliği içinde Zeiss tarafından ticari oldu. 1981 yılında, iki laboratuvar DIC mikroskop ^{7, 8} optik trenin içine video kameralar eklenmesi ile kaydedilmiş ilk canlı hücre DIC görüntüleri gösterdi. Canlı hücre görüntüleme çağı doğdu.

O tarihten bu yana, ticari mikroskoplar üzerinde faz kontrast ve DIC hem yürütme büyük ölçüde değişmeden olmuştur. Morfolojisi, hücre altı yapıların takibi, ve membran dinamikleri ⁹ soruşturmalarının izlenmesi: Bu yöntemler esas nitel amaçlar için hücrelerin görüntülerini üretmek için biyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu teknikler faz ve dı olarak "off-the-raf" konfigürasyonunda nitelC görüntüleri keyfi ışık kaynağı yoğunluğu fonksiyonları, aydınlatma optik ayarları ve CCD kamera kazanç, gama ve pozlama ayarları vardır.

Fizikçiler ve optik mühendisleri küçük bir lejyon ticari görüntüleme yöntemleri nicel yapmak için çaba harcadı. İlk çabaları arasında hekim-açık-Biyofizikçi Robert Barer piyasada bulunan bir fazlı mikroskop kullanarak bu hücre türleri ile faz değişimleri tahmin ederek hücrelerin hücre kuru kütlesini belirlemek için faz mikroskobu kullanımı gösterilmiş olan 1952 ve 1953 yılında Nature iki mektup vardı ^{10, 11.} Faz mikroskopi ^10,11, DIC mikroskopi ^12-17, ve optik yol uzunluğu, faz, kütlesini belirlemek için parlak bir alan ^18-22: alan üç temel etiket ücretsiz kontrast mekanizmaları etrafında dayalı takip eden yılda teknikleri çok sayıda geliştirdi yoğunluk, kırılma indeksi ve hücre hacmi.

Paragraftallel, özel optik araçlar geniş bir koleksiyon da 1950'lerden beri geliştirilmiştir ve parazit büyüme ²³ uygulamalar, kırmızı kan hücrelerinin ²⁵ membran dinamikleri soruşturma hücre döngüsünü ²⁴ belgeleyen değişen optik ölçümler geniş kapsamlı yaptık. Özellikle, son on yıl kırınım faz mikroskobu ²⁶ şeklinde, tomografik faz mikroskopi ^27, dijital holografik mikroskopi ^28, faz duyarlı optik koherens mikroskopi ^29, uzaysal ışık girişim mikroskopisi ^30, Hilbert etiket içermeyen nicel mikroskopi bir zenginlik gördü faz mikroskopi ^31, ve kantitatif faz mikroskopi ^32. Toplu başarılara rağmen, bu araçlar onların karmaşık enstrümantasyon ve hesaplama gereksinimleri, çoğunlukla nedeniyle biyolojik araştırmacıların büyük alana saçılmış olmamıştır.

Burada biz dAydınlık saha ve DIC görüntülerinin bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun niceliksel ölçümlerini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop kullanımını escribe. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Başarılı yürütülmesi için gerekli olan görüntüleme koşulları en ticari olarak temin edilebilir mikroskoplar normal çalışma kapsamı içindedir. Ayrıca, post-işleme algoritmaları, istikrarlı, hızlı ve sağlam - mümkün hızlı Fourier (FFT) tabanlı algoritmaları dönüşümü kullanılarak MATLAB uygulanmakta olan.

NIQPM faz ve cel, eksensel olarak entegre kütle yoğunluğu oluşturmak için bir yöntemdirparlak bir alan görüntülerinden lular örnekleri. Numunenin bu alan üzerinde eksensel olarak entegre kütle yoğunluğunun toplamı numunenin toplam kuru kütle içeriği verir. Bir hücrenin faz profili numunenin odak-boyunca parlak bir alan görüntülerinin yeniden inşa edilebileceği gösterilmiştir edildiği - - NIQPM protokol Paganin ve Nugent ^{18, 19} döşediği deneysel temellere dayanmakta ve Frank teorik çalışma , Altmeyer ve Wernicke ²⁰ - verimli bir FFT-tabanlı şekilde paraksiyel dalga modellerini çözme. Kuru kütle yoğunluğuna fazın bağlantı Barer ^{10, 11} ve ³³ ile Popescu çalışma üzerine dayanır.

Hacimsel bilgiler optik eksen boyunca numunenin optik olarak kısımlara sağlayan yüksek NA aydınlatma koşulları altında odak-boyunca DIC görüntü elde edilebilir. Hilbert DIC görüntü yığınlarının üzerinde işlem dönüşümü büyük ölçüde artırırArka plan olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları. Bu kontrast ve numunenin otomatik analizi için bir hacimsel sobel dayalı kenar algılama yöntemi geliştirmek için her iki Fourier filtreleme sebep olacak, ancak bu çalışma Arinson et al. ³⁴ ile kaynaklanmaktadır. Biz de kırınım sınırından yukarı çapı ^36, 20 mikron boyutu arasında değişen polistiren küreler daha önce HTDIC geçerliliği var.

NIQPM ve HTDIC hem ticari mikroskopları onların gelişimine nedeniyle teknolojik erişilebilir olmakla birlikte, yöntemler temelde mikroskopları kendilerini donanım konfigürasyonu ile sınırlıdır. Bu tekniklerin temel sınırlamalar iki kat vardır: aksine nedeniyle tüm numune aşamasında çeviri, ticari Kabinlerdekilerden yavaş z-yığını alma zamanı sadece objektif lens içinŞu anda hızlı kabaca 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma sınırlar, ve ikincisi, kırınım etkileri sırasıyla, çapı 10 ve 20 mikron kadar 0.2 arasında değişen büyüklüklerde nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri tipik "off-the-raf" enstrümanlar üzerinde bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, en sabit hücresel örnekleri kolayca bu yöntemler ile incelenmiştir.

NIQPM ve HTDIC protokollerin bir genel görünüşü Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2 biz, parlak alan ve DIC görüntüleri hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma koşulları altında optimal ve optimal yoluyla odak görüntüleme göstermektedir. 3 ve 4 başarılı ve başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQPM algoritmasının parametre bağımlılığını göstermektedir Rakamlar. Şekil 5, HTDIC görüntü işleme algoritması dahil adımları göstermektedir ve hücre hacmini belirlemek için algoritmanın en uygun uygulama göstermektedir.

Protokol

1.. Mikroskop Özellikleri

Doğru şekilde görüntüleme yürütmek için mikroskop aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır:

1. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve aydınlık (BF) kontrast hem de sahip.
2. Bilgisayar kontrollü z-eksen hareketi var.
3. Yoğunlaştırıcı mercek sayısal açıklık değişeceği için ayarlanabilir diyafram durak var. Derecelendirilmiş bir kural veya elektronik okuma bir diyafram sayısal diyafram değerini bilmek gereklidir. Sayısal açıklık NIQPM için 0.1 HTDIC için 0.9 (veya daha yüksek) kadar aralık olmalıdır.
4. Mikroskop parlak bir alan görüntüleme için kullanılmak üzere bir dar bant renk filtresi olmalıdır. Bu filtre, kırılma artış, NIQP kütle yoğunluğuna faz dönüştürmek için kullanılan bir dalga boyuna bağımlı facture gidermek için gereklidir.

2. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Z-yığın Edinme

1. Slidebook yazılım a açınnd resim koleksiyonu için yeni bir slayt oluşturmak.
2. Sonra, Odak penceresi açmak. Filtre Seti bölümünde, DIC seçin. Kapsam sekmesinde, Kondenser bölümünde, uzak doğru pozisyonda (tüm yol açmak) için Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın. Bu yüksek sayısal açıklık aydınlatma sağlar ve numunenin optik bölümlendirilmeleri artırır.
3. Bir DIC objektif kullanılarak numune odaklanın. Örnek kolayca görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Kamera doymuş varlık değildir sağlamak için, Odak Penceresinde Kamera sekmesini seçin ve piksel yoğunluğunun histogram kameranın dinamik aralığında olduğunu kontrol edin.
4. Görüntü Yakalama penceresini açın. Yakalama Türü bölümünde, 3D kutusunu işaretleyin. 3D Capture bölümünde, merkez etrafında Aralığı seçmek ve mevcut yere geri dönün kutuları ve Z-yönü aralığı, uçak sayısını ve adım boyutunu belirtin. Z-doğrultusu aralığı, tüm numune içermelidir.
5. Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, DIC kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı ve görüntüleme başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin.

3. Parlak Field (BF) Z-yığın Edinme

1. Mikroskop numunenin DIC Z-yığını toplama bittikten sonra, Odak penceresi açmak ve Filtre Seti bölümünde Aç seçeneğini seçin. Düşük NA aydınlatma sağlamak için (tüm yol kapalı) uzak sol konumuna Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın.
2. Yeşil mikroskop ışık yolu filtresini değiştirin. Örnek görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Seçerek kamera doygunluk var olun Kamera Odak Penceresinde sekmesini ve piksel yoğunluğunun histogram belirtilen aralıkta olduğunu kontrol.
3. Görüntü Yakalama penceresini açın. DIC Z-yığın iktisabından 3D Çekim ayarları görüntülenir.
4. Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, AÇIK kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı, ve Z-yığın görüntü toplama başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin.

4. Z-yığın Görüntüler İhracat

1. Z-yığın yakalama açın. % 100 görünümünü değiştirin. 0 arasında görüntülenecek piksel değerlerinin histogram ve kameranın maksimum piksel değeri (4.095 12 bit kameralar, 16 bit için 65.535.) Ayarlayın.
2. Görünüm> Dışa Aktar> TIFF Seri seçin. Bu TIFF görüntüleri bir dizi olarak Z-yığını ihraç edecek(Her Z düzlemi için bir tane). Sonunda (yani "DIC Stack 1_") da bir çizgi bir adla ayrı bir klasörde TIFF dizi kaydedebilirsiniz. Her DIC veya BF Z-yığını ile bu işlemi tekrarlayın.

5. Hacim Ölçümleri

1. "JoVE_HTDIC_v1.m" başlıklı HTDIC MATLAB programını açın.
2. HTDIC programın Bölüm 0 altında, bağımlılıkları dizin değişkeni güncelleştirmek. Kopyala ve "dependencies_directory =" Aşağıdaki tek tırnak arasındaki explorer hilbert_transform_dic.m ve sobel_edge_detect.m dosyaları (PC) içeren dizini yapıştırın. JoVE_HTDIC_v1.m program ExecuteSection 0.
3. Bölüm 1, "images_directory" güncelleyin. Yine, kopyalama ve tek tırnak arasında. Tif biçiminde yoluyla odak görüntüleri içeren dizini yapıştırın. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN.
4. Hizalama ve Hilbert için görüntülerin dönme çalıştırın kod Bölüm 2. dönüşümü. "HTDIC parametreleri tanımlayın" başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Beş numbers kullanıcı gereklidir: numune DIC görüntü odakta odak düzlemi sayısı, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), DIC görüntünün dönüş açısı Hilbert dönüşümü gerçekleştirmek için gerekli tipik değerler 45 ve -135 bulunmaktadır. Son olarak, ilgi boyutta bölge girmek, bu parametre, daha sonra görünür bir kutunun bir yan uzunluğunu tanımlayan - tipik değer 400'dür. Ok tıklayın.
5. Odak düzlemi sayısına göre belirlenen DIC odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği üzerinde kutusunu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Kutu arzu edilen bölgeye, kutunun içinde çift tıklayarak üzerinde konumlandırılmış edildikten sonra.
6. Başka bir rakam şimdi görünecektir: Bu rakam bir önceki adımda seçilen ilgi bölgenin bir kırpılmış ve döndürülmüş görüntüsünü içerir. Görüntünün kontrast şekilde olmalıdırparlak özellikleri sağ tarafta görünür iken o karanlık özellikleri solda görünür. Ilgi bölgesi üzerinde mavi kutuyu sürükleyin, gerektiğinde yeniden şekillendirmek.
7. Bölüm 3 z-yığın küp için bir maske oluşturur. Dikdörtgen bir maske hücrenin etrafına bir dikdörtgen ve elle ilgi hücre anahat ücretsiz bir el aracı oluşturmak için: Mevcut İki maske türü vardır.
8. Dikdörtgen bir maske, dosyamıza hattı 167 ve açıklama satırı 170 (bu çizginin başında bir "%" koyarak bir satırı yorum) oluşturmak için. Programın Bölüm 3. yürütün. Görüntüdeki tıklayın ve dikdörtgen maske tanımlayarak başlamak için fareyi sürükleyin. Bunu kabul etmek kutuya çift tıklayın.
9. Elle çizilmiş bir maske, Yorum satırı 167 ve yorumsuz hattı 170 oluşturmak ve Bölüm 3. yürütün. Tıklayın ve fare ile istenen maske çizin. Bunu kabul etmek maskesi üzerine çift tıklayın.
10. Hilbert inşa 4to çalıştırın Bölüm DIC Görüntü yığını ve ilgi alanının tekabül DIC görüntü yığınını dönüştürdü.Bölüm 3 inşa maske DIC yığını ve "Maskon" satırında 179 1'e set edilir düzenli DIC yığını dönüştürmek Hilbert uygulanacaktır. 0 "Maskon" ayarı maske uygulamadan görüntü yığınlarının inşa edecek.
11. Ilgi bölgenin xz kesit görüntülerin görüntü segmentasyon optimize Bölüm 5 çalıştırın. Program tarafından üretilen rakam 500, kontrast, üç farklı görüntüleme görünür. Hücrenin sınırları bulmak için algoritmanın başarısı, kullanılan maske ve program doğrultusunda 229 at "eşik" değerinin bir kombinasyonu ile bağımlıdır. 0.5 bir değerle başlar. Eşik değerini ayarlamak ve doğru özetleyen sütunlardan birinde elde edilinceye kadar programın bu bölümü yeniden çalıştırın.
12. Anahat 1. sütunda iyi olsaydı, DIC görüntü segmentasyon kullanarak ses seviyesini belirlemek için Bölüm 6 kullanın. Sütun 2 optimum sonuçlar verdiyse, Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri hücre hacmini belirlemek için Bölüm 7 çalıştırın. Eğer sütun 3 gave optimal sonuçları, koşmak Bölüm 8 Fourier-filtreden Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri kullanarak hacmini belirlemek.
13. Küp mikron (fl) rapor numunenin ölçülen hacim, hacim ölçümü seçildiği bağlı olarak program tarafından üretilen Şekil 600, 700, veya 800 başlığında sunulmuştur.

6. Kütle Ölçümleri

1. "JoVE_NIQPM_v1.m" başlıklı NIQPM MATLAB programını açın.
2. NIQPM programın Bölüm 0 altında, programı çalıştırmak için gerekli üç dizin konumunu güncelleştirmek. Bunlar "dependencies_directory," "brightfield_directory," ve vardır "dic_directory."
3. Sonraki Bölüm 1. çalıştırın. Bu kod bölüm görüntüler tüm setinin tam alanında parlak bir alan görüntü küp oluşturur. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN.
4. Sonraki Bölüm 2. çalıştırın. "NIQPM parametreleri tanımlayın" başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Dört numaraları kullanıcı gereklidir: odak düzlemi numarası nerede ve parlak alan görüntüörnek odakta olduğu, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), ve faiz boyutu bölgesi, bu parametre bir tarafı uzunluğunu belirler sonradan görünecektir kutusu - tipik bir değer 200'dür. Ok tıklayın.
5. Odak düzlemi sayısına göre belirlenen aydınlık alan odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir.
   1. Görüntü odakta değilse, mavi kutu ve tekrar çalıştırın Bölüm 2 çift tıklayın, iletişim kutusunda odak düzlemi sayısını ayarlamak için emin olun.
   2. Görüntü odakta ise, resmin etrafında mavi kutuyu sürükleyin ve kutunun düğümlerin seçimi ve gerektiğinde bunları sürükleyerek yeniden boyutlandırmak. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği etrafında kutu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Bunu kabul etmek kutunun içini çift tıklatın.
6. Sonraki çalıştırmak parlak alan görüntülerin bir yığın oluşturmak için Bölüm 3 içinde bölgeye kırpılmışterest.
7. Faz haritası, sözde DIC görüntü ve parlak bir alan görüntüler ve gerçek DIC görüntüye karşılaştırmalar oluşturmak için, Bölüm 4 çalıştırın.
8. Sözde ile DIC ve kütle yoğunluğu haritası, toplam kütle ve hücre yoğunluğu histogram mümkün olduğunca benzer doğru DIC görsel bölüm 5a veya 5b çalıştırarak belirlenebilir. Hattında 300 at optimize "eşik" - - Bölüm 5a alanının otomatik yatılı tespitini gerçekleştiren tipik değerleri 0,1-1 arasında değişmektedir. Eşik değerini optimize etmek gerektiği gibi, bu bölümü yeniden çalıştırın. Kullanıcı ilgi hücresini özetliyor sonra bölüm 5b vb kitle belirlenmesi, yürütmektedir.

Sonuçlar

Odak-boyunca görüntü alımı sırasında doğru örnek aydınlatma NIQPM nd HTDIC algoritmaları başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir. Şekil 2 biz DIC ve polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW620 için parlak bir alan kontrast altında hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma göstermektedir. 2A Şekiller, 2C, 2I, ve 2K NIQPM için optimal görüntüleme göstermektedir. 2F, 2H Rakamlar, 2N,

Tartışmalar

Genel olarak, NIQPM ,25-44,7 değişen optik yol uzunlukları üzerinde doğrulanmış bir kırınım-sınırlı bir tekniktir. Doğrulama n gerçekleştirilmiştir = Fluoromount G içinde süspansiyon haline 0.11-9.8 um çap arasında değişen 1,596 polistiren küreler (veriler gösterilmemiştir). Hücreler yaklaşık 0-7 aralığında optik yol uzunluklarına sahip.

Bir numunenin yoğunluk dağılımını ölçerken bir yoğunluk haritası, arka plandaki istenmeyen katkıları sahip iken...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media