Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

Resumo

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Resumo

Descreve-se o uso de um microscópio ótico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo brilhante e diferencial interferência imagens de contraste. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC) para determinar volume. NIQPM baseia-se um modelo simplificado de propagação da onda, denominado aproximação paraxial, com três suposições: baixa abertura numérica (NA) de iluminação, a dispersão fraca, e fraca absorção de luz pela amostra. Felizmente, as amostras celulares não coradas satisfazer estes pressupostos e baixa iluminação NA é facilmente alcançada em microscópios comerciais. HTDIC é usado para obter informações volumétrica a partir de imagens através de foco DIC sob alta ilumin NAcondições ation. Iluminação elevada NA permite melhor corte da amostra ao longo do eixo óptico. Transformada de Hilbert da transformação na imagem DIC empilha aumenta muito algoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica utilizando microscópios "off-the-shelf". Existem duas limitações básicas destes métodos: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais ab-roga atualmente a investigação dos fenômenos mais rápido do que um frame / minuto, e em segundo lugar, os efeitos de difração de restringir a utilidade da NIQPM e HTDIC a objetos de 0,2 até 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) um de diâmetro, respectivamente. Assim, os espécimes e o seu tempo associado dinâmica de interesse deve satisfazer certos restrições de tamanho e temporais, para permitir o uso de tais métodos. Empolgante, a cellula mais fixor espécimes são prontamente investigadas com estes métodos.

Introdução

O uso de microscopia óptica é agora onipresente na investigação de organismos celulares. Devido ao seu baixo de absorção e de espalhamento fraco propriedades endógenas mais visível do espectro óptico, as células não afetam fortemente a amplitude de ondas ópticas atravessando-los e, assim, aparecer semitransparente quando fotografada com microscópios de campo brilhante padrão. Amostras celulares, no entanto, diminuir ondas ópticas viajam através deles de uma forma que é linearmente relacionada com a quantidade de densidade de massa local em uma determinada região do espaço através do qual a luz viaja. A utilização desse intervalo de tempo heterogêneo ou perfil "fase" de ondas ópticas transmitidos através espécimes microscópicas foi descrita pela primeira vez em 1935 por Frits Zernike ¹ e experimentalmente realizado por Zernikein 1942 ^2. Zernike foi agraciado com o prêmio Nobel em 1953 por essa conquista. Zeiss comercializado esta modalidade em 1945 ^3. Em 1955, Smith e NomarskGostaria de apresentar o seu trabalho inicial sobre o uso ^{de 4} e ⁵ de teoria de interferência diferencial contraste (DIC) de microscopia, uma modalidade que utiliza o gradiente espacial de fase como um mecanismo de contraste. DIC foi comercializado por Zeiss em 1965in estreita colaboração com Nomarski ^6. Em 1981, dois laboratórios demonstraram a primeira célula viva imagens DIC registada com a incorporação de câmaras de vídeo para o trem óptica do microscópio DIC ^{7, 8.} A era das imagens de células vivas nasceu.

Desde essa altura, a execução de ambos de contraste de fase e DIC em microscópios comerciais tem sido largamente inalterada. Estes métodos são utilizados principalmente por biólogos para produzir imagens de células para fins qualitativos: o monitoramento da morfologia, rastreamento de estruturas subcelulares e investigações de dinâmica da membrana ^9. Estas técnicas são qualitativa na sua configuração de "off-the-shelf" tanto como fase e DIImagens c são funções arbitrárias da intensidade da fonte de luz, as configurações óptica iluminação, e ganho da câmera CCD, gama e configurações de exposição.

Uma pequena legião de físicos e engenheiros ópticos tem se esforçado para fazer exames de imagem comerciais quantitativa. Entre os primeiros esforços foram duas cartas à natureza em 1952 e 1953, em que o médico que virou biofísico Robert Barer demonstrado o uso de microscopia de fase para determinar a massa seca celular das células estimando mudanças de fase através destes tipos de células utilizando um microscópio de fase disponível comercialmente ^{10, 11.} O campo tem desenvolvido uma infinidade de técnicas ao longo dos anos seguintes com base em torno de três mecanismos básicos de contraste sem rótulo: microscopia de fase ^10,11, microscopia DIC ^{12-17, 18-22} e brilhante campo para determinar óptico caminho de comprimento, fase em massa densidade, índice de refração, e volume celular.

No Parállel, uma grande coleção de instrumentos ópticos personalizados também têm sido desenvolvidos desde os anos 1950, e fizeram de longo alcance medições ópticas que vão desde aplicações em crescimento do parasita ^23, para documentar o ciclo celular ²⁴ para investigar a dinâmica da membrana das células vermelhas do sangue ^25. Em particular, nos últimos dez anos tem visto uma riqueza de microscopia quantitativa sem rótulo na forma de microscopia de fase difração de ^26, microscopia tomográfica fase ^27, microscopia holográfica digital ^28, sensível microscopia de coerência óptica fase ^29, microscopia de interferência de luz espacial ^30, Hilbert fase microscopia ^31, e microscopia de fase quantitativa ^32. Apesar de seus sucessos coletivos, estes instrumentos não tenham sido divulgadas ao maior campo de pesquisadores biológicos, devido, principalmente, à sua instrumentação complexa e requisitos computacionais.

Aqui nós describe o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo claro e imagens DIC. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC), para determinar o volume. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica. As condições de imagem necessários para a sua realização bem sucedida estão dentro do âmbito do funcionamento normal da maioria dos microscópios disponíveis comercialmente. Além disso, os algoritmos de pós-processamento são estáveis, rápido e robusto - tendo sido implementado em MATLAB usando transformada de Fourier rápida algoritmos (FFT) com base, sempre que possível.

NIQPM é um método para reconstruir fase e a densidade de massa integrada axialmente de celespécimes intracelular de imagens de campo claro. Soma desta densidade de massa integrada axialmente ao longo da área da amostra dá o teor de matéria seca total da amostra. O protocolo NIQPM baseia-se nas bases experimentais definidas por Paganin Nugent e ^{18, 19} - em que foi demonstrado que o perfil de fase de uma célula pode ser reconstruído a partir das imagens da amostra através do foco de campo brilhante - e o trabalho teórico de Frank , Altmeyer e Wernicke ²⁰ - na resolução dos modelos de ondas paraxiais de forma eficiente com base em FFT. A ligação da fase com a densidade de massa seca é baseado no trabalho por Barer ^{10, 11} e Popescu ^33.

Informações volumétrica podem ser obtidas a partir de imagens por meio de DIC-focagem sob condições de iluminação elevados de NA que permitem o corte óptico da amostra ao longo do eixo óptico. Hilbert transformar processamento nas pilhas de imagens DIC aumenta muitoalgoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. Isto origina trabalho com Arinson et al. Embora ³⁴ foram introduzidos os dois métodos de filtragem de Fourier para aumentar o contraste e um método de detecção de borda à base de Sobel para análise volumétrica automatizada de amostra. Temos também validado HTDIC anteriormente em esferas de poliestireno que variam em tamanho desde o limite de difração de até 20 m de diâmetro ^36.

Embora ambos NIQPM e HTDIC são tecnologicamente acessíveis devido ao seu desenvolvimento em microscópios comerciais, os métodos são fundamentalmente limitada pela configuração das próprias microscópios de hardware. As limitações primárias de estas técnicas são duas vertentes: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais, devido à tradução de todo o estágio da amostra ao invés de apenas a lente objetiva, Limita actualmente a investigação de fenómenos mais rápidos do que cerca de um quadro / minuto, e, por outro, os efeitos de difracção de restringir a utilidade de NIQPM e HTDIC para objectos que variam em tamanho desde 0,2 até 10 e 20 um de diâmetro, respectivamente. Assim, a amostra e sua dinâmica de tempo associados de interesse deve atender determinado tamanho e restrições temporais para permitir a utilização destes métodos em instrumentos típicos "off-the-shelf". Empolgante, a maioria das amostras celulares fixos são prontamente investigadas com estes métodos.

Uma visão geral do NIQPM e protocolos HTDIC são apresentados na Figura 1. Na Figura 2 ilustramos imagem ideal e de qualidade inferior por meio de foco em condições de baixa e alta iluminação NA tanto para campo claro e imagens DIC. Figuras 3 e 4 demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQPM destacando implementações bem sucedidas e mal sucedidas. A Figura 5 ilustra os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem HTDIC e demonstra a aplicação óptima do algoritmo para determinar o volume celular.

Protocolo

1. Microscópio Especificações

Para a realização de imagens na forma correta o microscópio deve ter as seguintes especificações:

1. Possuir tanto contraste de interferência diferencial (DIC) e de campo claro (BF) de contraste.
2. Já movimento do eixo z controlados por computador.
3. Possui uma paragem de abertura ajustável para variar a abertura numérica da lente de condensador. Uma abertura com uma regra graduada ou leitura eletrônica é necessária para saber o valor da abertura numérica. A abertura numérica que varia de 0,1 para NIQPM até 0.9 (ou superior) para HTDIC.
4. O microscópio deve ter um filtro de cor estreita faixa a ser utilizado para brilhante imagem de campo. Este filtro é necessário para corrigir o incremento de refração, uma facture dependente do comprimento de onda utilizado para converter fase de densidade de massa para NIQP.

2. Contraste de interferência diferencial (DIC) Aquisição Z-stack

1. Abra o software de um Slidebookª criar um novo slide para a coleta de imagem.
2. Em seguida, abra a janela Focus. Na seção Conjunto de Filtros, selecione DIC. Na guia Escopo, na seção do condensador, ajuste o controle deslizante de abertura para o mais distante posição correta (aberto todo o caminho). Isto proporciona uma iluminação elevada abertura numérica e de corte aumenta óptica da amostra.
3. Concentre-se na amostra usando uma objetiva DIC. Ajuste a intensidade da lâmpada de halogéneo até que a amostra é facilmente visível. Para garantir que a câmera não está sendo saturado, selecione a aba Camera na Janela Foco e verifique se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa dinâmica da câmera.
4. Abra a janela de Captura de Imagem. Na seção Tipo de captura, marque a caixa 3D. Na seção de captura 3D, selecione o intervalo em torno do centro e voltar para o local atual caixas e especificar o intervalo Z-direção, número de aviões e tamanho do passo. O intervalo Z-direção deve incorporar toda a amostra.
5. Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa DIC e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a imagem.

3. Campo Bright (BF) Aquisição Z-stack

1. Uma vez que o microscópio foi concluída a coleta do Z-stack da amostra DIC, abra a janela de foco e selecione Abrir na seção Set Filter. Ajuste a barra deslizante de abertura para o mais distante posição esquerda (fechado todo o caminho) para fornecer iluminação baixa NA.
2. Mude o filtro microscópio de luz caminho para verde. Ajustar a intensidade de luz de halogéneo, até a amostra é visível. Certifique-se de que não há saturação da câmera selecionando o guia Câmera na Janela Foco e verificar se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa especificada.
3. Abra a janela de Captura de Imagem. As configurações de captura 3D a partir da aquisição Z-stack DIC será exibida.
4. Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa aberta e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a aquisição de imagens Z-stack.

4. Exportando Z-stack Images

1. Abra uma captura Z-stack. Alterar a vista para 100%. Ajustar o histograma dos valores de pixel a serem exibidas entre 0 e o valor de pixel máximo da câmara (4,095 para 12 câmaras de bits, 65.535 para 16 bits.).
2. Selecione Exibir> Export> Série TIFF. Isto irá exportar o Z-stack como uma série de imagens TIFF(Um para cada plano Z). Salve a série TIFF em uma pasta separada com um nome que tem um sublinhado no final (ou seja, "DIC Stack 1_"). Repita este procedimento com cada Z-stack DIC ou BF.

5. Desconto Medidas

1. Abra o programa HTDIC MATLAB intitulado "JoVE_HTDIC_v1.m".
2. Nos termos do artigo 0 do programa HTDIC, atualize a variável diretório dependências. Copie e cole o diretório que contém o hilbert_transform_dic.m e arquivos sobel_edge_detect.m do explorador (PC) entre as aspas simples seguinte "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 do programa JoVE_HTDIC_v1.m.
3. Na Seção 1, atualize o "images_directory". Mais uma vez, copie e cole o diretório que contém as imagens através de foco na forma tif. Entre as aspas simples. Só correr SEÇÃO 1 VEZ.
4. Alinhamento e rotação de imagens para Hilbert transformar Run Seção 2 do código. A caixa de diálogo intitulada "Definir parâmetros HTDIC" irá aparecer. Cinco numbers são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem DIC da amostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), o ângulo da imagem DIC rotação necessária para realizar a transformada de Hilbert, os valores típicos são de 45 e -135. Por fim, entram na região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de uma caixa, que em seguida aparecem - valor típico é de 400. Clique em OK.
5. Uma imagem do plano focal DIC especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul. Posicione a caixa sobre a característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Uma vez que a caixa foi posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro da caixa.
6. Outra figura aparecerá agora: esta figura contém uma imagem recortada e rodado da região de interesse selecionada na etapa anterior. O contraste da imagem deve ser talcaracterísticas que escuras aparecem na esquerda, enquanto características brilhantes aparecem na direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse, reformular, se necessário.
7. Seção 3 gera uma máscara para o cubo z pilha. Existem dois tipos de máscaras disponíveis: uma máscara retangular para criar um retângulo ao redor da célula e uma ferramenta à mão livre para delinear a célula de interesse com a mão.
8. Para gerar uma máscara retangular, linha 167 e descomente comentário linha 170 (comentário de uma linha para fora, colocando um "%" no início da linha). Executar Seção 3 do programa. Clique na imagem e arraste o mouse para começar a definir a máscara retangular. Dê um clique duplo na caixa de aceitá-lo.
9. Para gerar uma máscara desenhada à mão, o comentário linha 167 e linha 170 descomente e executar Seção 3. Clique e tirar a máscara desejada com o mouse. Dê um duplo clique sobre a máscara para aceitá-la.
10. Seção Execute 4to construir o Hilbert transformado pilha de DIC e os correspondentes imagem Pilha da área de interesse DIC.A máscara construída na Seção 3 serão aplicadas ao Hilbert transformar pilha DIC ea pilha DIC regular quando "maskon" está definido para 1 na linha 179. Definição "maskon" para 0 irá construir pilhas de imagens sem aplicar a máscara.
11. Execute Seção 5 para otimizar a segmentação das imagens seccionais xz transversais da região de interesse. Figura 500, produzido pelo programa, é exibida com três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo para encontrar os limites da célula é dependente de uma combinação de a máscara usado e o valor de "limiar", na linha 229 de programa. Comece com um valor de 0,5. Ajuste o valor de limiar e execute novamente esta seção do programa até o delineamento adequado é alcançado em uma das colunas.
12. Se o delineamento foi o melhor na coluna 1, use a Seção 6 para determinar o volume usando uma imagem segmentação DIC. Se a coluna 2 deu os melhores resultados, execute Seção 7 para determinar o volume da célula a partir de imagens DIC Hilbert-transformada. Se a coluna 3 gave os melhores resultados, executar Section 8 para determinar o volume usando Fourier filtrada imagens DIC Hilbert-transformada.
13. O volume medido da amostra, relatado em mM cúbico (fl) é apresentado no título da Figura 600, 700, ou 800 produzido pelo programa, dependendo de qual a medição de volume é escolhido.

6. Medidas de Massa

1. Abra o programa NIQPM MATLAB intitulado "JoVE_NIQPM_v1.m".
2. Nos termos do artigo 0 do programa NIQPM, atualizar o local de três diretórios necessários para executar o programa. Estes são o "dependencies_directory," o "brightfield_directory," e o "dic_directory."
3. Em seguida, execute Seção 1. Esta seção do código gera um campo brilhante imagem Cubo do campo cheio de todo o conjunto de imagens. Só correr SEÇÃO 1 VEZ.
4. Em seguida, execute Seção 2. A caixa de diálogo intitulada "Definir parâmetros NIQPM" irá aparecer. Quatro números são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem de campo claro daamostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para a aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), e a região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de um caixa que vai aparecer posteriormente - um valor típico é 200. Clique em OK.
5. Uma imagem do plano focal de campo claro especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul.
   1. Se a imagem não está em foco, clique duas vezes na caixa azul e reprise Seção 2, certifique-se de ajustar o número de plano focal na caixa de diálogo.
   2. Se a imagem está em foco, arraste a caixa azul ao redor da imagem e redimensioná-lo, selecionando os nós da caixa e arrastando-os quando necessário. Posicione a caixa em torno da característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Clique duas vezes dentro da caixa para aceitá-la.
6. Em seguida, executar o ponto 3 para a construção de uma pilha de imagens de campo brilhante foi colhido para a região de emjuro.
7. Para gerar a imagem DIC pseudo mapa de fase, e as comparações com a imagem DIC verdadeira imagem e campo claro, correr Seção 4.
8. Com o pseudo DIC e imagens verdadeiras DIC tão semelhantes quanto possível, o mapa de densidade de massa, a massa total, e um histograma da densidade celular pode ser determinada através da execução secção 5a ou 5b. Seção 5a realiza detecção boarder automatizada do campo - otimizar "limite" na linha 300 - valores típicos variam entre 0,1-1. Execute novamente nesta seção, conforme necessário para otimizar o valor do limite. Seção 5b realiza a determinação da massa, etc depois que o usuário define a célula de interesse.

Resultados

Iluminação amostra correta durante a aquisição de imagem através de foco é fundamental para o sucesso da implementação do NIQPM um ​​nd algoritmos HTDIC. Na Figura 2 ilustramos baixa e alta iluminação NA sob tanto DIC e brilhante contraste campo para uma esfera de poliestireno ea linha de células de adenocarcinoma colorretal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I e 2K demonstrar imagem ideal para NIQPM. Figuras 2F, 2H, 2N, e 2P...

Discussão

Em geral, NIQPM é uma técnica de difração limitada validado no caminho comprimentos ópticos que vão ,25-44,7. Validação foi realizada em n = 1,596 esferas de poliestireno que variam em diâmetro 0,11-9,8 mM suspenso em Fluoromount G (dados não mostrados). As células possuem comprimentos de caminho óptico que variam de cerca de 0-7.

Ao medir a distribuição da densidade de uma amostra pode-se achar que a imagem do pseudo DIC parece bem, enquanto o mapa de densidade possui indeseja...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media