Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

Riepilogo

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Descriviamo l'uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e interferenze immaginario contrasto differenziale. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC) per determinare il volume. NIQPM si basa su un modello semplificato di propagazione delle onde, chiamata approssimazione parassiale, con tre ipotesi di base: bassa apertura numerica (NA), illuminazione, diffusione deboli e debole assorbimento della luce da parte del campione. Fortunatamente, i campioni cellulari non colorati soddisfano questi presupposti e bassa illuminazione NA è facilmente raggiunti nei microscopi commerciali. HTDIC viene utilizzato per ottenere informazioni volumetrico da tramite a fuoco DIC immagini ad alta illumin NAcondizioni di cooperazione. Illuminazione elevata NA agevola la massima sezionamento del campione lungo l'asse ottico. Trasformata di Hilbert di elaborazione dell'immagine DIC su pile migliora notevolmente algoritmi di rilevamento del bordo per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica con microscopi "off-the-shelf". Ci sono due limiti fondamentali di questi metodi: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali attualmente abroga l'indagine dei fenomeni più veloce di 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l'utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti da 0.2 fino a 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) micron di diametro, rispettivamente. Quindi, la dinamica dei campioni e la sua associata di interesse devono soddisfare certa dimensione e vincoli temporali per consentire l'uso di questi metodi. Eccitante, cellula più fissoI campioni r sono prontamente studiate con questi metodi.

Introduzione

L'uso della microscopia ottica è ormai onnipresente nelle indagini di organismi cellulari. Grazie al loro basso endogeni di assorbanza e di scattering deboli strutture in spettro ottico visibile, le cellule non influenzano fortemente l'ampiezza delle onde ottiche li attraversano e quindi appaiono semitrasparente quando ripreso con microscopi da campo luminoso standard. Campioni cellulari, tuttavia, rallentano onde ottiche viaggiano attraverso di loro in un modo che è linearmente correlata alla quantità di densità di massa locale in una particolare regione dello spazio attraverso il quale la luce viaggia. Utilizzo di questo sfasamento temporale eterogenea profilo o "fase" di onde ottiche trasmessi attraverso campioni microscopici è stato descritto nel 1935 da Frits Zernike ¹ e sperimentale realizzato da Zernikein 1942 ^2. Zernike ha ricevuto il premio Nobel nel 1953 per questo risultato. Zeiss commercializzato questa modalità nel 1945 ^3. Nel 1955, Smith e NomarskVorrei presentare il loro lavoro iniziale per l'uso ⁴ e ⁵ teoria di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio, una modalità che utilizza il gradiente spaziale di fase come un meccanismo di contrasto. DIC è stato commercializzato da Zeiss nel 1965in stretta collaborazione con Nomarski ^6. Nel 1981, due laboratori hanno dimostrato il primo registrato cellule vive DIC immagini con l'incorporazione di telecamere nel treno ottica del microscopio DIC ^{7, 8.} L'era di imaging cellulare dal vivo è nato.

Da questo momento, l'esecuzione sia contrasto di fase e DIC sui microscopi commerciali è sostanzialmente rimasta invariata. Questi metodi sono principalmente utilizzati dai biologi per produrre immagini di cellule a fini qualitativi: il monitoraggio della morfologia, il monitoraggio delle strutture subcellulari, e ricerche di dinamica della membrana ^9. Queste tecniche sono di qualità nella loro configurazione "off-the-shelf" sia come fase e DIImmagini c sono funzioni arbitrarie della intensità della sorgente luminosa, le impostazioni ottica di illuminazione, e guadagno della telecamera CCD, gamma, e le impostazioni di esposizione.

Una piccola legione di fisici e ingegneri ottici si è sforzata di rendere le modalità di imaging commerciali quantitativa. Tra i primi sforzi erano due lettere a Nature nel 1952 e nel 1953 in cui il medico-gir-biofisico Robert Barer dimostrato l'uso della microscopia fase per determinare la massa secca cellulare delle cellule stimando sfasamenti attraverso questi tipi di cellule utilizzando un microscopio a fase disponibile in commercio ^{10, 11.} Il campo ha sviluppato una moltitudine di tecniche nel corso degli anni successivi, basata soprattutto tre meccanismi di contrasto di base label-free: microscopia fase di ^10,11, DIC microscopia ^12-17, e in campo chiaro ^18-22 per determinare ottica percorso di lunghezza, fase, massa densità, indice di rifrazione, e volume cellulare.

In parallel, una vasta collezione di strumenti ottici personalizzati sono stati sviluppati dal 1950, e hanno fatto di vasta portata misurazioni ottiche che vanno da applicazioni in crescita del parassita ^23, a documentare il ciclo cellulare da ²⁴ a indagare le dinamiche della membrana dei globuli rossi ^25. In particolare, negli ultimi dieci anni ha visto una ricchezza di microscopia quantitativa label-free in forma di microscopia fase di diffrazione ^26, tomografica microscopio fase ^27, digitale microscopia olografica ^28, sensibile alla fase a coerenza ottica microscopio ^29, spaziale microscopio interferenza della luce ^30, Hilbert fase microscopia ^31, e microscopia fase quantitativa ^32. Nonostante i loro successi collettivi, questi strumenti non sono stati diffusi al campo più ampio dei ricercatori biologici a causa, principalmente, alla loro complessa strumentazione e requisiti di calcolo.

Qui abbiamo DEscribe l'uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e DIC immaginario. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC), per determinare il volume. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica. Le condizioni di imaging necessaria per la corretta esecuzione rientrano nell'ambito del normale funzionamento della maggior parte dei microscopi disponibili in commercio. Inoltre, gli algoritmi di post-processing sono stabili, veloce e robusto - essendo stato implementato in MATLAB utilizzando trasformata veloce di Fourier algoritmi (FFT) basate quando possibile.

NIQPM è un metodo per ricostruire fase e la densità di massa assialmente integrata di celesemplari lular provenienti da campi immagini luminose. Sommatoria di questa densità di massa assialmente integrata sull'area del campione si ottiene il tenore massa secca totale del campione. Il protocollo NIQPM si basa sulle fondamenta sperimentali previste dal Paganin e Nugent ^{18, 19} - in cui è stato dimostrato che il profilo fase di una cella potrebbe essere ricostruita dal passante focalizzazione campo chiaro immaginario del campione - e il lavoro teorico di Frank , Altmeyer, e Wernicke ²⁰ - sulla soluzione dei modelli di onda retti in modo efficiente basata su FFT. Il collegamento di fase alla densità massa secca si basa sul lavoro da Barer ^{10, 11} e ³³ Popescu.

Informazioni volumetrica può essere ottenuta da passante fuoco DIC imagery sotto alte condizioni di illuminazione NA che consentono sezionamento ottico del campione lungo l'asse ottico. Trasformata di Hilbert trattamenti sulle pile di immagini DIC aumenta notevolmentealgoritmi di rilevamento dei bordi per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. Questo lavoro nasce con Arinson et al. ³⁴ sebbene abbiamo introdotto entrambi i metodi di filtraggio di Fourier per aumentare il contrasto e un metodo di rilevamento del bordo basato Sobel per l'analisi volumetrica automatizzata del campione. Abbiamo anche convalidato HTDIC precedenza su sfere di polistirolo che variano nel formato dal limite di diffrazione fino a 20 micron di diametro ^36.

Mentre sia NIQPM e HTDIC sono tecnologicamente accessibili a causa del loro sviluppo sui microscopi commerciali, i metodi sono fondamentalmente limitate dalla configurazione hardware dei microscopi stessi. I limiti principali di queste tecniche sono duplici: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali, grazie alla traduzione di tutta la fase del campione in contrasto con appena la lente obiettivo, Attualmente limita l'indagine dei fenomeni più veloce di circa 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l'utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti che variano nel formato da 0,2 fino a 10 e 20 micron di diametro, rispettivamente. Quindi, il campione e le sue dinamiche temporali associati di interesse devono soddisfare determinate dimensioni e dei vincoli temporali per consentire l'utilizzo di questi metodi su strumenti tipici "off-the-shelf". Eccitante, la maggior parte dei campioni cellulari fissi sono prontamente studiate con questi metodi.

Una panoramica del NIQPM e protocolli HTDIC sono indicati nella figura 1. Nella figura 2 si illustrano di imaging ottimale e subottimale attraverso fuoco in NA condizioni sia bassa e alta illuminazione sia per campo chiaro e DIC immagini. Figure 3 e 4 dimostrano la dipendenza dei parametri dell'algoritmo NIQPM evidenziando implementazioni di successo e insuccesso. Figura 5 illustra i passaggi necessari per l'algoritmo di elaborazione delle immagini HTDIC e illustra l'implementazione ottimale dell'algoritmo per determinare il volume cellulare.

Protocollo

1. Microscopio Specifiche

Per eseguire l'imaging nel modo corretto, il microscopio dovrebbe avere le seguenti specifiche:

1. Possedere entrambi contrasto di interferenza differenziale (DIC) e campo chiaro (BF) contrasto.
2. Avere movimento asse z controllato da computer.
3. Avere un diaframma regolabile per variare l'apertura numerica della lente condensatore. Un'apertura con una regola graduata o lettura elettronica è tenuto a conoscere il valore della apertura numerica. L'apertura numerica deve variare da 0,1 per NIQPM fino a 0.9 (o superiore) per HTDIC.
4. Il microscopio dovrebbe avere un filtro di colore a banda stretta per essere utilizzato per l'imaging campo chiaro. Questo filtro è tenuta a fissare l'incremento di rifrazione, una fabbricazione lunghezza d'onda dipendente utilizzato per convertire fase della densità di massa per NIQP.

2. Interferenza differenziale contrasto (DIC) Acquisizione Z-stack

1. Aprire il software SlideBook unnd creare una nuova diapositiva per raccolta di immagini.
2. Quindi, aprire la finestra di Focus. Nella sezione Filter Set selezionare DIC. Nella scheda Ambito, nella sezione condensatore, regolare la barra di scorrimento Aperture per la più giusta posizione (aperto tutto il senso). Questo fornisce alta numerico illuminazione dell'apertura e migliora sezionamento ottico del campione.
3. Focus sul campione utilizzando un obiettivo DIC. Regolare l'intensità della lampada alogena finché il campione è facilmente visibile. Per assicurare che la fotocamera non viene saturato, selezionare la scheda della fotocamera nella finestra di messa a fuoco e verificare che l'istogramma di intensità dei pixel è all'interno del range dinamico della telecamera.
4. Aprire la finestra Acquisizione Immagine. Nella sezione Tipo di ripresa, selezionare la casella 3D. Nella sezione Capture 3D, selezionare l'intervallo intorno al centro e torna alla posizione attuale caselle e specificare l'intervallo direzione Z, numero di aerei, e passo. La gamma Z-direzione dovrebbe includere l'intero campione.
5. Nella sezione Filtro Set della finestra Acquisizione Immagine, selezionare la casella DIC e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione Informazioni dell'immagine, il nome dell'immagine (opzionale), e selezionare Start per avviare il imaging.

3. Campo chiaro (BF) Acquisizione Z-stack

1. Una volta che il microscopio ha finito di raccogliere il DIC Z-stack del campione, aprire la finestra Focus e selezionare Apri nella sezione Filter Set. Regolare la barra di scorrimento Aperture per la posizione più a sinistra (chiuso tutto il senso) per fornire l'illuminazione bassa NA.
2. Cambiare il filtro di luce-path microscopio a verde. Regolare l'intensità della lampada alogena finché il campione è visibile. Assicurarsi che non vi è saturazione della fotocamera selezionando la scheda telecamera nella finestra di messa a fuoco e verificando che l'istogramma di intensità dei pixel è entro l'intervallo specificato.
3. Aprire la finestra Acquisizione Immagine. Verranno visualizzate le impostazioni di acquisizione 3D DIC acquisizione Z-stack.
4. Nella sezione Filtro Set della finestra Acquisizione Immagine, selezionare la casella OPEN e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione Informazioni dell'immagine, il nome dell'immagine (opzionale), e selezionare Start per avviare Z-stack acquisizione delle immagini.

4. Esportazione di Z-stack Immagini

1. Aprire una cattura Z-stack. Modificare la visualizzazione al 100%. Regolare l'istogramma dei valori di pixel da visualizzare tra 0 e il valore massimo del pixel della telecamera (4.095 per telecamere 12 bit, 65.535 per 16 bit.).
2. Selezionare Visualizza> Esporta> TIFF Series. Ciò esportare la Z-stack come una serie di immagini TIFF(Uno per ogni piano Z). Salvare la serie TIFF in una cartella separata con un nome che ha un carattere di sottolineatura alla fine (ad esempio "DIC Stack 1_"). Ripetere questa operazione con ogni DIC o BF Z-stack.

5. Misure Volume

1. Aprire il programma HTDIC MATLAB intitolato "JoVE_HTDIC_v1.m".
2. Sotto la sezione 0 del programma HTDIC, aggiornare la variabile directory dipendenze. Copia e incolla il directory contenente il hilbert_transform_dic.m e file sobel_edge_detect.m da Explorer (PC) tra le virgolette singole seguente "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 del programma JoVE_HTDIC_v1.m.
3. Nella sezione 1, aggiornare l'"images_directory". Ancora una volta, copiare e incollare la cartella contenente le immagini in-focus in. Forma tif tra le virgolette singole. SOLO RUN SEZIONE 1 VOLTA.
4. Allineamento e rotazione delle immagini per Hilbert trasformano Run sezione 2 del codice. Apparirà una finestra di dialogo intitolata "Definisci HTDIC Parametri". Cinque numbers sono richiesti dall'utente: il numero di piano focale dove l'immagine DIC del campione è a fuoco, risoluzione laterale (micron / pixel nell'immagine), la risoluzione assiale (questo è il 0,1 per l'acquisizione di immagini a 0.1 micron fasi assiali), l'angolo di rotazione dell'immagine DIC necessario per eseguire la trasformata di Hilbert, valori tipici sono 45 e -135. Infine, inserire la regione di interesse dimensioni, questo parametro definisce la lunghezza di un lato di una scatola che appaiono successivamente - valore tipico è 400. Fare clic su OK.
5. Un'immagine del piano focale DIC specificato dal numero di piano focale apparirà con una scatola blu. Posizionare la scatola sopra la caratteristica di interesse, ad esempio una cella. La scatola non deve essere quadrata. Una volta che il box è stato posizionato sopra la regione desiderata, fare doppio clic all'interno della casella.
6. Un'altra figura appare ora: questa figura contiene un'immagine ritagliata e ruotata della regione di interesse selezionato nel passaggio precedente. Il contrasto dell'immagine deve essere talecaratteristiche che scure sulla sinistra, mentre le caratteristiche luminose appaiono sulla destra. Trascinare la casella blu sopra la regione di interesse, rimodellare, se necessario.
7. Sezione 3 genera una maschera per il cubo z-stack. Ci sono due tipi di maschere disponibili: una maschera rettangolare per creare un rettangolo intorno alla cella e uno strumento a mano libera per delineare la cella di interesse a mano.
8. Per generare una maschera rettangolare, decommentare la linea 167 e commentare la linea 170 (commentare una linea fuori con un "%" all'inizio della riga). Eseguire sezione 3 del programma. Fare clic nell'immagine e trascinare il mouse per iniziare a definire la maschera rettangolare. Fare doppio clic sulla casella di accettarla.
9. Per generare una maschera disegnata a mano, commentare linea 167 e decommentare la linea 170 ed eseguire Sezione 3. Fare clic e disegnare la maschera desiderato con il mouse. Fare doppio clic sulla maschera di accettarla.
10. Sezione Eseguire 4to costruire la trasformata di Hilbert DIC pila di immagini e la corrispondente DIC pila immagine dell'area di interesse.La maschera costruito nella Sezione 3 verrà applicato alla trasformata di Hilbert pila DIC e lo stack regolare DIC quando "maskON" è impostato a 1 alla riga 179. Impostazione "maskON" per 0 costruirà stack di immagini senza applicare la maschera.
11. Eseguire sezione 5 per ottimizzare la segmentazione dell'immagine dei xz trasversali immagini sezionali della regione di interesse. Figura 500, prodotta dal programma, appare a visualizzare tre diversi tipi di contrasto. Il successo dell'algoritmo per trovare i bordi della cella fa affidamento su una combinazione della maschera utilizzata e il valore di "soglia" alla riga 229 del programma. Iniziare con un valore di 0,5. Regolare il valore di soglia e rieseguire questa sezione del programma fino alla corretta delineazione è raggiunto in una delle colonne.
12. Se la delineazione era meglio nella colonna 1, utilizzare la sezione 6 per determinare il volume utilizzando DIC immagine segmentazione. Se colonna 2 ha dato risultati ottimali, sezione 7 per determinare il volume delle cellule da Hilbert-trasformata immagini DIC correre. Se colonna 3 gavE i risultati ottimali, eseguire la Sezione 8 per determinare il volume utilizzando Fourier filtrata Hilbert-trasformata immagini DIC.
13. Il volume di campione, riportato in micron cubico (fl) è presentato nel titolo della figura 600, 700, o 800 prodotto dal programma a seconda di quale viene scelto misura del volume.

6. Misure di massa

1. Aprire il programma NIQPM MATLAB intitolato "JoVE_NIQPM_v1.m".
2. Sotto la sezione 0 del programma NIQPM, aggiornare la posizione di tre directory necessarie per eseguire il programma. Questi sono i "dependencies_directory", il "brightfield_directory," e il "dic_directory".
3. Avanti, sezione 1 eseguire. Questa sezione di codice genera un campo luminoso cubo del campo pieno di tutta la serie di immagini. SOLO RUN SEZIONE 1 VOLTA.
4. Avanti, Sezione 2 eseguire. Apparirà una finestra di dialogo intitolata "Definisci NIQPM Parametri". Quattro numeri sono richiesti dall'utente: il numero piano focale dove l'immagine luminosa campo dellacampione è a fuoco, risoluzione laterale (micron / pixel nell'immagine), la risoluzione assiale (questo è 0,1 per acquisizione immagini a 0,1 micron di passaggi assiali), e la regione di interesse dimensioni, questo parametro definisce la lunghezza di un lato di un dialogo che appaiono successivamente - un valore tipico è 200. Fare clic su OK.
5. Un'immagine del piano focale campo luminoso specificato dal numero di piano focale apparirà con una scatola blu.
   1. Se l'immagine non è a fuoco, fare doppio clic nella casella blu ed eseguire nuovamente sezione 2, assicurarsi di regolare il numero di piano focale nella finestra di dialogo.
   2. Se l'immagine è a fuoco, trascinare la casella blu intorno all'immagine e ridimensionarlo selezionando i nodi della scatola e trascinandole come necessario. Posizionare la casella intorno la caratteristica di interesse, ad esempio un cellulare. La scatola non deve essere quadrata. Fare doppio clic all'interno della casella di accettarla.
6. Successivamente, eseguire Sezione 3 per costruire una pila di immagini in campo chiaro ritagliata nella regione di interesse.
7. Per generare la mappa di fase, pseudo immagine DIC e confronti con le immagini in campo chiaro e l'immagine vera DIC, sezione 4 correre.
8. Con la pseudo DIC e DIC vere immagini il più possibile simili alla mappa di densità di massa, massa totale, e istogramma della densità cellulare possono essere determinati eseguendo Sezione 5a o 5b. Sezione 5 bis effettua il rilevamento automatico confine del campo - optimize "soglia" alla riga 300 - i valori tipici variano tra 0.1-1. Eseguire nuovamente questa sezione come necessario per ottimizzare il valore di soglia. Sezione 5b effettua la determinazione della massa, ecc dopo che l'utente delinea la cella di interesse.

Risultati

Corretta illuminazione campione durante passante fuoco acquisizione delle immagini è fondamentale per la corretta attuazione del NIQPM un algoritmi HTDIC nd. Nella figura 2 si illustrano alta e bassa illuminazione NA sia sotto DIC e contrasto campo chiaro di una sfera di polistirolo e la linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano SW620. Figure 2A, 2C, 2I, e 2K dimostrano di imaging ottimale per NIQPM. Figure 2F, 2H, 2N e 2P dimo...

Discussione

In generale, NIQPM è una tecnica di diffrazione limitata convalidata su percorso lunghezze ottiche vanno ,25-44,7. Validazione è stata eseguita su n = 1.596 sfere di polistirene variano in diametro 0,11-9,8 micron sospese in Fluoromount G (dati non mostrati). Cellule possiedono percorso lunghezze ottiche che vanno da quasi 0-7.

Quando si misura la distribuzione della densità di un esemplare si può scoprire che l'immagine pseudo DIC guarda bene mentre la mappa di densità possiede con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media