Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

Résumé

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Résumé

Nous décrivons l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume et la densité sur des échantillons cellulaires grâce à une combinaison de champ lumineux et contraste d'interférence différentiel imagerie. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC) pour déterminer le volume. NIQPM est basé sur un modèle simplifié de propagation de l'onde, appelée l'approximation paraxiale, avec trois hypothèses sous-jacentes: faible ouverture numérique (NA), éclairage faible diffusion, et la faible absorption de la lumière par l'échantillon. Heureusement, les échantillons cellulaires non colorées répondent à ces hypothèses et un éclairage faible NA est facile à réaliser sur des microscopes commerciaux. HTDIC est utilisé pour obtenir des informations volumétrique de par-focus DIC imagerie sous haute illumin NAconditions ation. Illumination NA élevé permet une meilleure découpe de l'éprouvette le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert de traitement sur l'image DIC empile améliore considérablement les algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimen en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles du fond. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique utilisant des microscopes "off-the-shelf". Il existe deux principales limitations de ces méthodes: lente z-stack temps d'acquisition sur les étendues commerciales abroge actuellement l'enquête de phénomènes plus rapidement que 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets de 0,2 à 10 (NIQPM) et 20 (HTDIC) um de diamètre, respectivement. Par conséquent, les spécimens et son temps associé dynamique d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes. Excitant, cellula plus fixespécimens r sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Introduction

L'utilisation de la microscopie optique est désormais omniprésent dans l'enquête des organismes cellulaires. En raison de leur faible absorption et faible diffusion propriétés endogènes sur le spectre optique visible, les cellules n'affectent pas fortement l'amplitude des ondes optiques qui les traversent et donc apparaissent semi quand imagé avec des microscopes de champ lumineux standard. Échantillons cellulaires font, cependant, ralentissent ondes optiques qui transitent par eux d'une manière qui est linéairement liée à la quantité de masse volumique locale dans une région particulière de l'espace à travers lequel la lumière se déplace. L'utilisation de ce laps de temps hétérogènes ou profil "en phase" d'ondes optiques transmis à travers les échantillons microscopiques a été décrite pour la première en 1935 par Frits Zernike ¹ et expérimentalement réalisée par Zernikein 1942 ^2. Zernike a reçu le prix Nobel en 1953 pour cette réalisation. Zeiss commercialisé cette modalité en 1945 ^3. En 1955, Smith et Nomarski souhaite présenter leurs travaux initiaux sur l'utilisation ⁴ et ⁵ théorie de contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, une modalité qui utilise le gradient spatial de phase en tant que mécanisme de contraste. DIC a été commercialisé par Zeiss en 1965in étroite collaboration avec Nomarski ^6. En 1981, deux laboratoires ont démontré la première enregistrée cellules vivantes DIC imagerie avec l'incorporation de caméras vidéo dans le train optique du microscope DIC ^{7, 8.} L'ère de l'imagerie des cellules vivantes est né.

Depuis ce temps, l'exécution de deux à contraste de phase et DIC sur microscopes commerciaux a été largement inchangé. Ces méthodes sont principalement utilisées par les biologistes pour produire des images de cellules à des fins qualitatives: la surveillance de la morphologie, le suivi des structures sous-cellulaires, et les enquêtes de la dynamique de la membrane ^9. Ces techniques sont d'ordre qualitatif dans leur configuration "off-the-shelf" que la phase et DIC images sont des fonctions arbitraires de l'intensité de la source lumineuse, les paramètres optiques d'éclairage, et le gain de la caméra CCD, gamma, et les paramètres d'exposition.

Une petite légion de physiciens et d'ingénieurs optiques s'est efforcé de modalités d'imagerie quantitative commerciales. Parmi les premiers efforts étaient deux lettres à la nature en 1952 et 1953 où le médecin devenu biophysicien Robert Barer démontré l'utilisation de la microscopie de phase pour déterminer la masse sèche cellulaire des cellules en estimant déphasages par ces types de cellules en utilisant un microscope de phase disponible dans le commerce ^{10, 11.} Le champ a développé une multitude de techniques au cours des années qui ont suivi articulés autour de trois mécanismes de contraste de base sans étiquette: microscopie de phase ^10,11, DIC microscopie ^12-17, et sur ​​le terrain lumineux ^18-22 pour déterminer chemin optique de longueur, la phase, la masse densité, indice de réfraction, et le volume cellulaire.

Au paragraphellèle, une grande collection d'instruments optiques personnalisées ont également été développés depuis les années 1950, et ont consenti des mesures optiques allant des applications à la croissance du parasite ^23, à la documentation du cycle cellulaire ²⁴ d'enquêter sur la dynamique des membranes de globules rouges ^25. En particulier, les dix dernières années ont vu une multitude de microscopie quantitative sans étiquette sous la forme de microscopie de phase de diffraction ^26, la microscopie de phase tomographique ^27, la microscopie holographique numérique ^28, phase délicate microscopie par cohérence optique ^29, spatiale interférence de lumière microscopie ^30, Hilbert phase de microscopie ^31, et la microscopie de phase quantitative ^32. Malgré leurs réussites collectives, ces instruments n'ont pas été diffusés dans le domaine plus large de chercheurs biologiques en raison, principalement, de leur instrumentation complexe et les exigences de calcul.

Ici, nous Describe l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume, la densité et sur des échantillons cellulaires à travers une combinaison de champ lumineux et l'imagerie DIC. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC), pour déterminer le volume. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique. Les conditions de formation d'image nécessaire à la bonne exécution entrent dans le cadre du fonctionnement normal de la plupart des microscopes disponibles dans le commerce. En outre, les algorithmes de post-traitement sont stables, rapide et robuste - ayant été mis en œuvre dans MATLAB en utilisant la transformée algorithmes (FFT) sur la base de Fourier rapide chaque fois que possible.

NIQPM est un procédé pour reconstruire la phase et la densité de la masse axialement intégré de celspécimens lular à partir d'images de champ lumineux. Sommation de cette masse volumique axialement intégrée sur la surface de l'échantillon donne la teneur en masse sèche totale de l'éprouvette. Le protocole de NIQPM repose sur les fondations expérimentales définies par Paganin et Nugent ^{18, 19} - dans lequel il a été démontré que le profil de phase d'une cellule peut être reconstruit à partir traversant focalisation champ lumineux imagerie de l'échantillon - et le travail théorique de Frank , Altmeyer, et Wernicke ²⁰ - sur la résolution des modèles de vagues parallèles à l'axe d'une manière efficace par FFT. La connexion de la phase de la densité de la masse sèche est basée sur les travaux de Barer ^{10, 11} et ³³ Popescu.

Volumétrique informations peuvent être obtenues à partir des images de mise au point à travers DIC dans des conditions d'illumination NA élevées qui permettent sectionnement optique de l'échantillon le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert traitement sur les piles d'images DIC améliore grandementLes algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimens en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles de l'arrière-plan. Ce travail émane de Arinson et al. ³⁴ bien que nous avons mis en place deux méthodes de filtrage de Fourier pour améliorer le contraste et d'une méthode de détection bord à base de Sobel pour l'analyse automatique volumétrique de l'échantillon. Nous avons également validé HTDIC précédemment sur ​​des sphères de polystyrène d'une taille allant de la limite de diffraction de 20 um de diamètre ^36.

Bien que les deux NIQPM HTDIC et sont accessibles sur le plan technologique à cause de leur développement sur les microscopes commerciaux, les procédés sont fondamentalement limitées par la configuration matérielle des microscopes eux-mêmes. Les principales limites de ces techniques sont de deux ordres: lente z-stack temps d'acquisition sur des champs commerciaux, en raison de la traduction de l'étape de la totalité de l'échantillon plutôt que de simplement l'objectif, Limite actuellement l'étude des phénomènes plus rapidement que d'environ 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets d'une taille allant de 0,2 à 10 et 20 m de diamètre, respectivement. Ainsi, l'échantillon et de sa dynamique de temps associées d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes sur les instruments typiques "off-the-shelf". Passionnante, la plupart des spécimens cellulaires fixes sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Un aperçu de la NIQPM et protocoles HTDIC sont donnés dans la figure 1. Dans la figure 2, nous illustrons l'imagerie optimale et sous-optimale par-focus dans des conditions d'éclairage à la fois basse et haute NA pour les deux champs lumineux et imagerie DIC. Figures 3 et 4 montrent le paramètre dépendance de l'algorithme de NIQPM soulignant implémentations réussies ou non. Figure 5 illustre les étapes de l'algorithme de traitement d'image HTDIC et démontre la mise en œuvre optimale de l'algorithme pour déterminer le volume cellulaire.

Protocole

Une. Microscope Spécifications

Pour faire de l'imagerie dans le bon mode microscope devrait avoir les caractéristiques suivantes:

1. Posséder à la fois contraste interférentiel différentiel (DIC) et fond clair (BF) contraste.
2. Avoir un mouvement d'axe z commandé par ordinateur.
3. Avoir un diaphragme d'ouverture réglable pour faire varier l'ouverture numérique de la lentille de condenseur. Une ouverture avec une règle graduée ou lecture électronique est nécessaire de connaître la valeur de l'ouverture numérique. L'ouverture numérique devrait se situer entre 0,1 pour NIQPM à 0,9 (ou ultérieure) pour HTDIC.
4. Le microscope doit avoir un filtre étroit de la couleur de la bande pour être utilisé pour l'imagerie par champ lumineux. Ce filtre est nécessaire pour fixer le minimum de réfraction, une facture de longueur d'onde dépendant utilisé pour convertir la phase de la densité de masse pour PNRPI.

2. Contraste interférentiel différentiel (DIC) Acquisition Z-stack

1. Ouvrez le logiciel SlideBook unee créer une nouvelle diapositive pour la collecte de l'image.
2. Ensuite, ouvrez la fenêtre de mise au point. Dans la section Filtre de Set, sélectionnez DIC. Dans l'onglet Champ, dans la section condenseur, réglez la barre coulissante ouverture à la position la plus à droite (ouvrir tout le chemin). Ceci permet d'obtenir l'illumination de grande ouverture numérique et améliore sectionnement optique de l'échantillon.
3. Focus sur l'échantillon en utilisant un objectif DIC. Réglez l'intensité de la lampe halogène jusqu'à l'échantillon est facilement visible. Pour assurer la caméra n'est pas saturé, sélectionnez l'onglet de la caméra dans la fenêtre de mise au point et vérifier que l'histogramme des intensités des pixels est dans la gamme dynamique de la caméra.
4. Ouvrez la fenêtre de capture d'image. Dans la section Type de capture, cochez la case 3D. Dans la section de capture 3D, sélectionnez la chaîne autour du centre et de retour à l'emplacement actuel boîtes et spécifier la gamme Z-direction, nombre d'avions, et la taille de l'étape. La gamme Z-direction devrait intégrer l'ensemble de l'échantillon.
5. Dans la section Filtre de consigne de la fenêtre de capture d'image, cochez la case DIC et spécifier la durée d'exposition. Dans la section Informations sur l'image, le nom de l'image (en option), puis sélectionnez Démarrer pour lancer l'imagerie.

3. Champ lumineux (BF) Acquisition Z-stack

1. Une fois que le microscope a terminé la collecte de la DIC Z-pile de l'échantillon, ouvrir la fenêtre Focus et sélectionnez Ouvrir dans la section Filtre de Set. Réglez le curseur d'ouverture à la position la plus à gauche (fermé tout le chemin) pour fournir un éclairage faible NA.
2. Changer le filtre parcours de lumière microscope au vert. Réglez l'intensité de la lampe halogène jusqu'à l'échantillon est visible. Assurez-vous qu'il n'ya pas de saturation de l'appareil en sélectionnant le onglet de la caméra dans la fenêtre de mise au point et vérifier que l'histogramme des intensités des pixels est dans la plage spécifiée.
3. Ouvrez la fenêtre de capture d'image. Les paramètres de capture 3D de l'acquisition de Z-stack DIC seront affichés.
4. Dans la section Filtre de consigne de la fenêtre de capture d'image, cochez la case OPEN et indiquer la durée d'exposition. Dans la section Informations sur l'image, le nom de l'image (en option), puis sélectionnez Démarrer pour lancer l'acquisition d'images Z-stack.

4. Exportation Z-stack Images

1. Ouvrez une capture Z-stack. Modifier l'affichage à 100%. Réglez l'histogramme des valeurs de pixels à afficher entre 0 et la valeur maximale en pixels de la caméra (4095 pour 12 caméras de bits, 65535 pour 16 bits.).
2. Sélectionnez Affichage> Exporter> Série TIFF. Cela exporter le Z-stack comme une série d'images TIFF(Une pour chaque plan de Z). Enregistrer la série TIFF dans un dossier séparé avec un nom qui a un trait de soulignement à la fin (c'est à dire "DIC Pile 1_"). Répétez cette opération avec chaque Z-stack DIC ou BF.

5. Les mesures de volume

1. Ouvrez le programme HTDIC MATLAB intitulé «JoVE_HTDIC_v1.m".
2. Conformément à l'article 0 du programme HTDIC, mettre à jour la variable du répertoire des dépendances. Copiez et collez le répertoire contenant le hilbert_transform_dic.m et fichiers sobel_edge_detect.m de l'explorateur (PC) entre les guillemets simples suivant "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 du programme JoVE_HTDIC_v1.m.
3. Dans la section 1, mettre à jour le "images_directory". Encore une fois, copier et coller le répertoire contenant les images à travers au point sous forme de tif. Entre les guillemets simples. Fonctionnent uniquement SECTION 1 ONCE.
4. Alignement et la rotation des images pour Hilbert transforment Run Section 2 du code. Une boîte de dialogue intitulée "Définir HTDIC Paramètres" apparaît. Cinq numbers sont nécessaires à l'utilisateur: le nombre de plan focal où l'image DIC de l'échantillon est mis au point, la résolution latérale (um / pixel dans l'image), la résolution axiale (c'est 0,1 pour l'acquisition d'images de 0,1 um étapes axiales), l'angle de l'image DIC de rotation nécessaire pour effectuer la transformée de Hilbert, les valeurs typiques sont de 45 et -135. Enfin, saisissez la région de la taille de l'intérêt, ce paramètre définit la longueur d'un côté d'une boîte qui apparaîtra par la suite - valeur typique est de 400. Cliquez sur OK.
5. Une image du plan focal DIC spécifiée par le numéro de plan focal apparaît avec une boîte bleue. Placez la boîte sur la fonction d'intérêt, par exemple une cellule. La boîte ne doit pas être carré. Une fois que la boîte a été placée sur la région désirée, double-cliquez à l'intérieur de la boîte.
6. Un autre personnage apparaît maintenant: ce chiffre contient une image recadrée et tournée de la région d'intérêt sélectionnée à l'étape précédente. Le contraste de l'image doit être tellecaractéristiques que sombres apparaissent à gauche tandis que des caractéristiques lumineuses apparaissent sur la droite. Faites glisser la boîte bleue sur la région d'intérêt, remodeler si nécessaire.
7. Section 3 génère un masque pour le cube z-stack. Il existe deux types de masques disponibles: un masque rectangulaire pour créer un rectangle autour de la cellule et un outil à main pour exposer la cellule d'intérêt à la main.
8. Pour générer un masque rectangulaire, décommentez la ligne 167 et ligne 170 commentaire (commenter une ligne en plaçant un "%" au début de cette ligne). Exécuter la section 3 du programme. Cliquez sur l'image et faites glisser la souris pour commencer à définir le masque rectangulaire. Double-cliquez sur la case pour l'accepter.
9. Pour générer un masque dessiné à la main, commentaire la ligne 167 et ligne 170 décommentez et exécuter la section 3. Cliquez et dessinez le masque désiré avec la souris. Double-cliquez sur le masque de l'accepter.
10. Section Exécutez 4to construire Hilbert transformé l'image DIC pile et l'image DIC pile correspondante de la zone d'intérêt.Le masque construit dans la section 3 sera appliquée à la transformée de Hilbert DIC pile et la pile DIC régulière quand "maskON" est mis à 1 à la ligne 179. Réglage "maskON" à 0 va construire des piles d'images sans appliquer le masque.
11. Exécuter la section 5 d'optimiser la segmentation d'image des images en coupe transversale de xz de la région d'intérêt. Figure 500, produite par le programme, l'affichage apparaît trois types de contraste différents. Le succès de l'algorithme pour trouver les bordures de la cellule est tributaire de la combinaison du masque utilisé et la valeur de «seuil» à la ligne 229 du programme. Commencez avec une valeur de 0,5. Réglez la valeur de seuil et relancer cette section du programme jusqu'à ce que le mode Plan adéquate est obtenue dans l'une des colonnes.
12. Si le mode Plan était le meilleur dans la colonne 1, utilisez la section 6 pour déterminer le volume à l'aide DIC segmentation d'image. Si la colonne 2 a donné des résultats optimaux, exécutez la section 7 pour déterminer le volume de la cellule de l'imagerie DIC Hilbert transformée. Si la colonne 3 gave les résultats optimaux, Section 8 de fonctionner afin de déterminer le volume moyen de l'imagerie DIC Hilbert transformée de Fourier filtré.
13. Le volume mesuré de l'échantillon, rapportée dans um cube (fl) est présenté dans le document de la figure 600, 700, 800 ou produite par le programme en fonction de la mesure du volume est choisi.

6. Mesures de masse

1. Ouvrez le programme NIQPM MATLAB intitulé «JoVE_NIQPM_v1.m".
2. Conformément à l'article 0 du programme NIQPM, mettre à jour l'emplacement de trois répertoires nécessaires pour exécuter le programme. Ce sont les "dependencies_directory," le "brightfield_directory," et le "dic_directory."
3. Ensuite, exécutez la section 1. Cette section de code génère un champ lumineux cube image de la totalité du champ de l'ensemble des images. Fonctionnent uniquement SECTION 1 ONCE.
4. Ensuite, exécutez la section 2. Une boîte de dialogue intitulée "Définir NIQPM Paramètres" apparaît. Quatre numéros sont nécessaires à l'utilisateur: le nombre de plan focal où l'image de champ lumineux de lal'échantillon est mis au point, la résolution latérale (um / pixel dans l'image), la résolution axiale (c'est 0,1 pour l'acquisition d'images à 0,1 um étapes axiales), et la région de la taille d'intérêt, ce paramètre définit la longueur d'un côté d'un boîte qui apparaîtra par la suite - une valeur typique est de 200. Cliquez sur OK.
5. Une image du plan focal de champ lumineux spécifié par le numéro de plan focal apparaît avec une boîte bleue.
   1. Si l'image n'est pas au point, double-cliquez dans la boîte bleue et la section reprise 2, assurez-vous de régler le nombre de plan focal dans la boîte de dialogue.
   2. Si l'image est mise au point, faites glisser la boîte bleue autour de l'image et la redimensionner en sélectionnant les nœuds de la boîte et en les déplaçant au besoin. Placez la boîte autour de la caractéristique d'intérêt, par exemple une cellule. La boîte ne doit pas être carré. Double-cliquez à l'intérieur de la boîte à l'accepter.
6. Ensuite, exécutez la section 3 pour construire une pile d'images de fond clair cultivé dans la région de dansintérêt.
7. Pour générer la carte de phase, l'image pseudo DIC, et des comparaisons avec des images lumineuses sur le terrain et la véritable image DIC, exécutez la section 4.
8. Avec le pseudo DIC et de vraies images DIC aussi proches que possible de la carte de la densité de la masse, la masse totale, et l'histogramme de la densité de cellules peuvent être déterminées en exécutant l'article 5a ou 5b. Section 5a effectue la détection de frontière automatisé du domaine - optimiser «seuil» à la ligne 300 - valeurs typiques varient entre 0,1-1. Relancez cette section que nécessaire pour optimiser la valeur de seuil. Section 5b effectue détermination de la masse, etc après que l'utilisateur définit la cellule d'intérêt.

Résultats

Corriger éclairage de l'échantillon lors de l'acquisition de l'image par-focus est essentielle à la mise en œuvre réussie de la NIQPM un Algorithmes HTDIC nd. Dans la figure 2, nous illustrons éclairage basse et haute NA sous deux DIC et lumineux contraste de champ pour une sphère de polystyrène et le colorectal ligne de cellules d'adénocarcinome humain SW620. Figures 2A, 2C, 2I, et 2K démontrent imagerie optimale pour NIQPM. <...

Discussion

En général, NIQPM est une technique de diffraction limitée validée sur le chemin optique des longueurs allant de 0,25 à 44,7. La validation a été effectuée sur n = 1,596 sphères de polystyrène de diamètre allant de 0,11 à 9,8 um en suspension dans Fluoromount G (données non présentées). Les cellules possèdent chemin longueurs optiques qui vont de près de 0-7.

Lorsque la mesure de la distribution de la densité d'un échantillon, on peut constater que l'image de pseud...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media