Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа

Резюме

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Аннотация

Мы описали использование стандартного оптического микроскопа для выполнения количественных измерений массы, объема и плотности на клеточных образцах путем сочетания светлого поля и дифференциальной интерференционной контрастной образов. Два основных подхода представлены: noninterferometric количественный фазовая микроскопия (NIQPM), для выполнения измерений общей массы клеток и внутриклеточной распределения плотности и преобразование Гильберта дифференциальное вмешательство контрастной микроскопии (HTDIC), чтобы определить объем. NIQPM основана на упрощенной модели распространения волн, называется параксиальном приближении, с тремя основных предположений: низкий числовая апертура (NA) освещения, слабым рассеянием и слабого поглощения света на образце. К счастью, неокрашенные сотовые образцы удовлетворяют эти предположения и низкой освещенности Н.А. легко достигается на коммерческих микроскопов. HTDIC используется для получения информации от объемной через фокус DIC изображений под высоким NA ILLUMINусловия Ation. Высокое освещение NA обеспечивает улучшенную секционирования образца вдоль оптической оси. Преобразование Гильберта обработку изображения DIC стеки значительно повышает алгоритмы обнаружения края для локализации образца границ в трех измерениях, разделяя серые значения интенсивности образца от тех фона. Основными преимуществами NIQPM и HTDIC лежал в своей технологической доступности, используя "вне-полке" микроскопы. Есть два основных ограничения этих методов: медленный Z-Stack время сбора на коммерческих областей в настоящее время отменяет расследование явлений быстрее, чем 1 кадра / мин, а во-вторых, дифракционные эффекты ограничивают полезность NIQPM и HTDIC к объектам от 0,2 до 10 (NIQPM) и 20 (HTDIC) мкм в диаметре, соответственно. Таким образом, образцы и связанный с ним время динамика интереса должны соответствовать определенный размер и временные ограничения для того, чтобы использование этих методов. Возбуждающе, наиболее фиксированной CELLULAг образцы легко исследованы с помощью этих методов.

Введение

Использование оптической микроскопии является в настоящее время повсеместно в расследовании клеточных организмов. В связи с их низкой эндогенных поглощения и слабые рассеяния свойств более видимой оптического спектра, клетки не сильно влияют на амплитуду оптических волн, проходящих их и таким образом появляются полупрозрачные, когда изображается со стандартными микроскопов светлое поле. Сотовые образцы, тем не менее, замедлить оптических волн, распространяющихся через них таким образом, чтобы линейно связано с количеством местного плотности массы в конкретной области пространства, через которые свет путешествует. Использование этой гетерогенной временным лагом или "фазы" профиль оптических волн, прошедших через микроскопические образцов был впервые описан в 1935 году Фриц Цернике ¹ и экспериментально реализован Zernikein 1942 ^2. Зернике была присуждена Нобелевская премия в 1953 за это достижение. Zeiss коммерческую этот механизм в 1945 году ^3. В 1955 году Смит и Nomarskя бы представить свои первоначальные работы по применению ⁴ и теории ⁵ дифференциальной интерференционной отличие (ДВС-синдром) микроскопии, модальности, которая использует пространственный градиент фазы в качестве механизма контрастности. DIC был коммерческому Zeiss в 1965in тесном сотрудничестве с Nomarski ^6. В 1981 году две лаборатории продемонстрировали первый записанный живой клетке DIC изображения с включением видеокамер в оптике поезде от ДВС микроскопом ^{7, 8.} Родился Эпоха изображений живых клеток.

С этого времени, выполнение как фазового контраста и ДИК на коммерческих микроскопов во многом была неизменной. Эти методы в основном используются биологами для получения изображений клеток для качественных целей: мониторинг морфологии, отслеживания субклеточных структур и исследований динамики мембранных ^9. Эти методы являются качественными в их "не совсем готовом виде" конфигурации, как по фазе и DIC изображения произвольные функции интенсивности источника света, настройки оптика освещение, и усиления ПЗС-камера, гамма, и настройки экспозиции.

Небольшой легион физиков и оптических инженеров стремится делать коммерческие диагностические методы количественной. Среди первых попыток были два письма природе в 1952 и 1953 годах, в которых врач, а ныне биофизик Роберт Барьер продемонстрировали использование фазовой микроскопии для определения клеточного сухой массы клеток путем оценки фазовых сдвигов через эти типы клеток с использованием коммерчески доступного фазовом микроскопе ^{10, 11.} Поле разработала множество методов более последующие годы на основе вокруг трех основных этикеток без контрастных механизмов: фазовая микроскопия ^10,11, ДВС микроскопии ^12-17, и яркий полевых ^18-22 определить оптическую путь длины, фазу массы плотность, показатель преломления, и клеточная объем.

В пунктеllel, большая коллекция пользовательских оптических приборов были разработаны с 1950 года, и сделали далеко идущие оптических измерений, начиная от применения в рост паразита ^23, к документированию клеточный цикл ²⁴ к исследованию мембранных динамику эритроцитов ^25. В частности, за последние десять лет не видел богатство без наклеек количественного микроскопии в виде дифракционной фазовой микроскопии ²⁶ томографического фазовой микроскопии ^27, цифровой голографической микроскопии ^28, фазовый чувствительной оптической когерентной микроскопии ^29, пространственной интерференции света микроскопии ³⁰ Гильберта фазовая микроскопия ^31, и количественный фазовая микроскопия ^32. Несмотря на их коллективных успехов, эти инструменты не были распространены в большей области биологических исследователей благодаря, в основном, для их комплексного приборов и вычислительных требований.

Здесь мы гописывать круг использование стандартного оптического микроскопа для выполнения количественных измерений массы, объема и плотности на клеточных образцах путем сочетания светлого поля и ДИК образов. Два основных подхода представлены: noninterferometric количественный фазовая микроскопия (NIQPM), для выполнения измерений общей массы клеток и внутриклеточной распределения плотности и преобразование Гильберта дифференциальное вмешательство контрастной микроскопии (HTDIC), чтобы определить, громкость. Основными преимуществами NIQPM и HTDIC лежал в своей технологической доступности. Условия формирования изображения, необходимые для их успешного выполнения находятся в пределах объема нормальной эксплуатации большинстве коммерчески доступных микроскопов. Кроме того, алгоритмы постобработки стабильны, быстрый и надежный - будучи реализованы в MATLAB, используя быстрое преобразование Фурье алгоритмы (БПФ), основанные когда это возможно.

NIQPM это метод для восстановления фазы и аксиально интегрированный массовую плотность челlular образцы из образов ярко поля. Суммирование этой оси интегральной плотности массы по площади образца дает общее массовое содержание сухого образца. Протокол NIQPM основана на экспериментальных основах, заложенных Paganin и Nugent ^{18, 19,} - в котором было показано, что фаза профиль клетки могли быть восстановлены с помощью фокусировки светлом поле изображений образца - и теоретические работы Frank , Altmeyer и Вернике ²⁰ - на решении параксиальных волновые модели в эффективной БПФ на основе образом. Соединение по фазе на сухую плотности массы основан на работе Барьер ^{10, 11} и ³³ Попеску.

Объемный информация может быть получена из через фокус DIC изображений в условиях высокой освещенности НС, которые позволяют оптического секционирования образца вдоль оптической оси. Преобразование Гильберта обработку изображения стеков ОПК значительно повышаеталгоритмы обнаружения края для локализации образца границ в трех измерениях путем отделения серые значения интенсивности образца от тех фона. Эта работа происходит с Arinson др. ^34. Хотя мы ввели как Фурье методы фильтрации для повышения контрастности и Собел основе метод обнаружения края для автоматизированного объемного анализа образца. Мы также подтвердили HTDIC ранее на полистирольных сфер размером от дифракционного предела до 20 мкм в диаметре ^36.

Хотя оба NIQPM и HTDIC технологически доступной благодаря их развития на коммерческих микроскопов, эти методы принципиально ограничена аппаратной конфигурации самих микроскопов. Основные ограничения этих методов в два раза: медленно Z-Stack время сбора на коммерческих областей, в связи с переводом всей стадии образца, в отличие от всего объектива, В настоящее время ограничивает расследование явлений быстрее, чем примерно 1 кадр / мин, а во-вторых, дифракционные эффекты ограничивают полезность NIQPM и HTDIC к объектам площадью от 0,2 до 10 и 20 мкм в диаметре, соответственно. Таким образом, образец и связанные с временной динамики интерес должен соответствовать определенный размер и временные ограничения для того, чтобы использование этих методов на типичных «вне-полке" инструментов. Возбуждающе, большинство фиксированных сотовые образцы легко исследованы с помощью этих методов.

Обзор NIQPM и HTDIC протоколов приведены на рисунке 1. На рисунке 2 мы проиллюстрируем оптимальное и неоптимальный расфокусированной изображений под высоким и низким условиях NA освещения как для светлого поля и ДИК образов. 3 и 4 демонстрируют зависимость параметра алгоритма NIQPM подсветка удачные и неудачные реализации. Рисунок 5 показаны шаги в HTDIC алгоритма обработки изображений и демонстрирует оптимальное реализацию алгоритма для определения клеточного объема.

протокол

1. Микроскоп Характеристики

Для проведения томографии в правильном моды микроскоп должен иметь следующие технические характеристики:

1. Обладают как дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и светлого (BF) контрастности.
2. Есть компьютерным управлением движением ось г.
3. Уже регулируемый упор диафрагмы варьировать конденсатор объектива числовую апертуру. Отверстие с градуированной правило или электронного считывания требуется знать значение числовой апертуры. Числовая апертура должна быть в пределах от 0,1 для NIQPM до 0,9 (или выше) для HTDIC.
4. Микроскоп должен иметь узкую цвета полоса фильтра, которые будут использоваться для работы с изображениями яркого поля. Этот фильтр необходим, чтобы исправить преломляющую приращение, длин волн зависит от фактуры, используемый для преобразования фазы в плотности массы для NIQP.

2. Дифференциальный интерференционного контраста (DIC) Приобретение Z-Stack

1. Откройте ПРОГРАММУ Slidebookй создать новый слайд для коллекции изображений.
2. Затем откройте окно фокус. Под фильтром, установленным разделе выберите DIC. На закладке Область действия в разделе Конденсатор, отрегулировать ползунок диафрагмы к дальней правой позиции (открыть всю дорогу). Это обеспечивает высокую числовой апертуры освещения и повышает оптическую секционирования образца.
3. Сосредоточьтесь на образце с помощью цели DIC. Отрегулируйте интенсивность галогенные лампы, пока образец не хорошо просматривается. Для обеспечения камера не может быть насыщенной, выберите вкладку Камера в окне Фокус и убедитесь, что гистограмма интенсивностей пикселей в пределах динамического диапазона камеры.
4. Откройте окно Image Capture. В разделе Тип Сбора, проверьте 3D окно. В 3D разделе Capture, выбора диапазона вокруг центра и вернуться к текущему местоположению коробки и укажите диапазон Z-направление, количество самолетов, и размер шага. Диапазон Z-направлении должна включать весь образец.
5. В набор фильтров части окна Захват изображений, установите флажок DIC и указать время экспозиции. В разделе Информация об изображении на, назвать образ (не обязательно) и выберите Пуск, чтобы начать изображений.

3. Яркий поле (BF) Приобретение Z-Stack

1. После того, как микроскоп закончил сбор DIC Z-Stack образца, откройте окно фокус и выберите Открыть под фильтр Set разделе. Отрегулируйте ползунок диафрагмы к самой дальней левой позиции (закрыт весь путь), чтобы обеспечить низкое освещение NA.
2. Измените микроскопа фильтр светло-путь на зеленый. Отрегулируйте интенсивность галогенные лампы, пока образец не видна. Убедитесь, что нет насыщение камере, выбрав вкладка камеры в окне Фокус и убедившись, что гистограмма интенсивностей пикселей в пределах указанного диапазона.
3. Откройте окно Image Capture. Будут показаны настройки 3D Capture от приобретения Z-Stack DIC.
4. В набор фильтров части окна записи образа проверить поле Открыть и укажите время экспозиции. В разделе Информация об изображении на, назвать образ (не обязательно) и выберите Пуск, чтобы начать Z-Stack получения изображений.

4. Экспорт Z-Stack Images

1. Откройте захват Z-стека. Измените вид на 100%. Отрегулируйте гистограмму значений пикселей, которые будут отображаться в диапазоне от 0 и максимальное значение пикселя камеры (4095 для 12 битных камеры, 65535 для 16 бит.).
2. Выберите Вид> Экспорт> TIFF Series. Это будет экспортировать Z-Stack в виде серии изображений TIFF(По одному для каждого Z плоскости). Сохраните серию TIFF в отдельной папке с именем, который имеет знак подчеркивания в конце (то есть "ДИК Стек 1_"). Повторите это с каждым Z-Stack DIC или BF.

5. Объем Измерения

1. Откройте программу HTDIC MATLAB под названием "JoVE_HTDIC_v1.m".
2. В соответствии со статьей 0 из HTDIC программы, обновления переменной каталогов зависимостей. Скопируйте и вставьте каталог, содержащий hilbert_transform_dic.m и sobel_edge_detect.m файлы из проводника (PC) в между одинарные кавычки следующий "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 программы JoVE_HTDIC_v1.m.
3. В разделе 1, обновить "images_directory". Опять же, скопируйте и вставьте каталог, содержащий через фокусе фотографий в. Виде TIF в между одинарные кавычки. Работать только РАЗДЕЛ 1 РАЗ.
4. Выравнивание и вращение изображений для преобразования Гильберта Запустить раздел 2 кода. Появится диалоговое окно с названием «Определение HTDIC Параметры". Пять NumbeRS требуется от пользователя: в фокальной плоскости число, где изображение ДВС образца находится в фокусе, боковая разрешение (мкм / пиксель в изображении), осевое разрешение (это 0,1 для получения изображения в 0,1 мкм осевых ступеней), угол поворота изображения ДВС необходимо для выполнения преобразования Гильберта, типичные значения 45 и -135. Наконец, попадаем в область размером ставки, этот параметр определяет длину стороны ящика, который будет впоследствии появляются - типичное значение 400. Нажмите Ok.
5. Изображение фокальной плоскости DIC указанного координационного числа плоскости появится с синей коробке. Установите флажок над ней и интересов, например, клетки. Коробка не должна быть квадратной. После того, как коробка была размещен над желаемой области, дважды щелкните внутри коробки.
6. Другой показатель теперь появится: эта цифра содержит обрезанную и повернутый имиджа региона интереса выбранной на предыдущем шаге. Контрастность изображения должна быть такой,что темные черты появляются слева в то время как яркие черты появится справа. Перетащите синий ящик над интересующей области, изменить при необходимости.
7. Раздел 3 генерирует маску для куба Z-Stack. Есть два вида масок в наличии: прямоугольная маска, чтобы создать прямоугольник вокруг ячейки и инструмент для свободного рисования наметить ячейку интереса вручную.
8. Для создания прямоугольной маски, раскомментируйте строку 167 и комментарий линию 170 (комментировать линию путем размещения "%" в начале этой линии). Выполнить раздел 3 программы. Нажмите на изображении и перетащите мышь, чтобы начать определение прямоугольную маску. Дважды щелкните на поле, чтобы принять его.
9. Чтобы создать рисованную маску, комментарий линию 167 и раскомментируйте строку 170 и выполнить Раздел 3. Нажмите и привлечь нужную маску с помощью мыши. Дважды щелкните на маску, чтобы принять его.
10. Запустите Раздел 4to построить Гильберта превращается DIC стека изображений и соответствующий DIC изображения стопку интересующей области.Маска построены в разделе 3 будет применяться к преобразования Гильберта DIC стек и регулярное DIC стек, когда "maskON" устанавливается в 1 в строке 179. Установка "maskON" 0 построят стеки без нанесения маски.
11. Запустите раздел 5 оптимизировать сегментацию изображения креста XZ секционных изображений интересующей области. Рисунок 500, создаваемых программой, отображающий три различных типа контраста. Успех алгоритма, чтобы найти границы ячейки зависит от комбинации маски, используемой и значение "порога" на линии 229 программы. Начните со значением 0,5. Регулировка величины порога и повторно этот раздел программы, пока надлежащее структурирование не будет достигнуто в одном из столбцов.
12. Если структурирование был лучшим в колонке 1, используйте раздел 6 для определения объема помощи DIC изображения сегментацию. Если в колонке 2 дал оптимальные результаты, запустить раздел 7, чтобы определить объем клеток от Гильберта-трансформированной DIC образов. Если в колонке 3 гавэ оптимальные результаты, запустить раздел 8, чтобы определить объем помощи Фурье-фильтрованную Гильберта-преобразованный DIC образы.
13. Измеренный объем образца, сообщается в кубической мкм (Флорида) представлена ​​в названии рисунке 600, 700, или 800, полученного в рамках программы в зависимости от которого выбирается измерение объема.

6. Массовые Измерения

1. Откройте программу NIQPM MATLAB под названием "JoVE_NIQPM_v1.m".
2. В соответствии со статьей 0 программы NIQPM, установить на трех каталогов, необходимых для запуска программы. Это «dependencies_directory," "brightfield_directory," и "dic_directory."
3. Затем запустите Раздел 1. Эта часть кода создает светлое поле изображения куб полной области всего набора изображений. Работать только РАЗДЕЛ 1 РАЗ.
4. Затем запустите Раздел 2. Появится диалоговое окно с названием «Определение NIQPM Параметры". Четыре номера требуется от пользователя: число фокальной плоскости, где светлое поле образОбразец находится в фокусе, боковая разрешение (мкм / пиксель в изображении), осевое разрешение (это 0,1 для получения изображения в 0,1 мкм осевых шагов), и область от размера ставки, этот параметр определяет длину стороны окно, в котором будут появляться - типичное значение составляет 200. Нажмите Ok.
5. Образ яркий поля фокальной плоскости, заданной фокальной плоскости числа появится с синей коробке.
   1. Если изображение не в фокусе, дважды щелкните в синей коробке и запускать разделе 2, не забудьте настроить фокусное количество самолет в диалоговом окне.
   2. Если изображение находится в фокусе, перетащите синий прямоугольник вокруг изображения и изменить его размер, выбрав узлы коробки и перетаскивая их по мере необходимости. Расположите рамку вокруг особенностью интересов: например, клетки. Коробка не должна быть квадратной. Дважды щелкните внутри коробки, чтобы принять его.
6. Затем запустите Раздел 3 построить стек изображений в светлом поле обрезается до области втерес.
7. Для создания фазового карту, псевдо DIC изображение и сравнения с яркой образности поля и истинной DIC изображения, запускать раздел 4.
8. С псевдо DIC и DIC истинные изображения как можно более близкими плотность массы карты, общей массой и гистограммы плотности клеток может быть определена путем запуска участок 5a или 5b. Раздел 5a осуществляет автоматизированное обнаружение любителям сноуборда полевого - Оптимизация «порога» в строке 300 - типичные значения от 0,1-1. Запустить повторно раздел мере необходимости, чтобы оптимизировать величину порога. Раздел 5б осуществляет определение массы и т.д. после того как пользователь описывает ячейку интересов.

Результаты

Правильное освещение образца во время через фокусе получения изображений имеет решающее значение для успешной реализации NIQPM а й HTDIC алгоритмов. На рисунке 2 мы проиллюстрируем низкой и высокой освещенности NA рамках как DIC и яркой поля отличие для сферы полистирола и ?...

Обсуждение

В общем, NIQPM является методом дифракционной утверждена оптических путем длиной от 0.25-44.7. Проверка проводилась на п = 1,596 полистирольные сферы диаметром от 0.11-9.8 мкм, суспендированных в Fluoromount G (данные не показаны). Клетки обладают оптического пути длин, которые варьируются от почти 0-7.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media