Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Özet

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Özet

Tümör başlaması ve ilerlemesinde rol moleküllerin belirlenmesi hastaların klinik yönetimi için, bir sonucu olarak, anlayış hastalığın biyolojisi için temel ve. Bu çalışmada biz kronik lenfositik lösemi (KLL) ilerlemesinde katılan moleküllerin tanımlanması için optimize edilmiş bir proteomik yaklaşım anlatacağız. Ayrıntılı, lösemik hücre lizatlan 2-boyutlu Elektroforez (2DE) tarafından çözümlenir ve 2DE jelleri "noktalar" olarak görünür. Proteomik haritaları karşılaştırmalı analizi, kütle spektrometrisi (MS) ile izole edilmiş toplandı ve tespit edilir (bol miktarda ve post-translasyonel modifikasyonlar bakımından) farklı şekilde eksprese edilmiş proteinlerin tanımlanmasına izin verir. Belirlenen aday biyolojik işlevi primer lösemi hücreleri için optimize edilmiş olması, farklı deneylerde (yani geçiş, yapışma ve F-aktin polimerizasyonu) ile test edilebilir.

Giriş

Kronik lenfositik lösemi (KLL), Batı ülkelerinde en yaygın yetişkin lösemi, monoklonal neoplastik CD5 ⁺ B lenfositlerinin birikimi türemiştir ve klinik çok heterojen. Bu nedenle, monoklonlu B hücresi lemfositozu (MBL) ^1,2,3 olarak tanımlanan bir ön-lösemi form olarak mevcut olabilir. Hastalık ya bir seyirli ders ile görünebilir diğer durumlarda, bu tedaviye ihtiyaç duyan daha önce yıllarca stabil kalır veya serdedilebilmektedir ilerleyici bir kemorefrakter hastalık olarak tedaviye rağmen. Son olarak, bir sıklıkla ölümcül yüksek dereceli lenfoma (Richter'in Sendromu-RS) ^2,3,4 ilerleyebilir. Iyi ve kötü prognoz, hastalık sonucu ve yaşam belirleyicileri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlar prognostik faktörlerin bir dizi dayalı: Hastalar genellikle iki ana alt gruplarında sınıflandırılır. Klinik heterojenite olasılıkla biyolojik heterojenitesini yansıtır. Genetik, microenvironmental ve ce bir dizillular faktörler birleştirici bir mekanizma ⁵ tespit edilmiştir bile hastalık patojenezine hemfikir gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, çeşitli çalışmalar hastalığın klinik seyrinde farklılıklar kısmen prognostik değer ^6,7,8 olan bazı biyolojik belirteçlerin varlığı (veya yokluğu) ile izah edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu veriler, hastalık biyolojisinin daha iyi anlaşılması, prognostik işaretleri ve terapötik hedeflerin her ikisinin belirlenmesi ile, patolojinin klinik yönetimi için ek ipuçları sağlayabildiğini göstermiştir.

Bu yazıda amacı, farklı proteomik tekniklerin bir kombinasyonu CLL başlangıcı ve ilerlemesinde de görev proteinlerin tanımlanması için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bizim yaklaşımımız bu arada temel proteomik verileri ve klinik verileri ⁵ katılmak mümkün olduğunu göstermektedir.

Seçilen hastaların mevcut iş akışında, primer lösemi hücreleri(Kötü prognoz good vs) izole edilmiş ve hücre lizatlan sonra proteomik haritalar elde etmek için kullanılır. 2DE dolayısıyla her bir proteinin biyolojik aktivitesi üzerinde dolaylı bilgi verilmesi sonrası değişiklikleri dahil olmak üzere, bir hücre popülasyonu, proteomik profilinin karakterizasyonu sağlar. Tüm hücre lisatları, moleküler ağırlığına dayalı olarak proteinleri gideren bir poliakrilamid jeli üzerinde çalışan bir ikinci boyut, ardından izoelektrik noktasına göre bir birinci boyuta çalışma ile çözümlenir. Proteomik haritaları karşılaştırmalı analizi, diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin belirlenmesini sağlar (her ikisi de bol miktarda ve post-translasyonel modifikasyonlar bakımından) kesilmiş ve kütle spektrometresi ile analiz edilebilir jeli üzerinde lekeler halinde. Her adayın rolü daha sonra farklı deneyleri tarafından istismar edilebilir.

Geçerli el yazması KLL sınırlı Bu yaklaşım, kolay, böylece proteomi hakkında bilgi veren, diğer hastalıklar / örnekleri genişletilebilir(v demonte uyarılmamış, vahşi tip v uyarılan normal v patolojik yani,), iki grup arasında C / biyolojik farklılıklar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Tüm doku örnekleri San Raffaele Hastanesi (Milan, İtalya) kurumsal inceleme kurulu onayı ile elde edilmiştir.

1. İnsan Doku ve Hücre numuneleri saflaştırma (Şekil 1)

NOT: Lösemik lenfositler Mulligan ve ark göre, KLL hastalarının Periferik Kan (PB) elde tanısı konuldu ^9.

PB 1.1) Lösemik Hücre Ayırma

1. Sodyum Heparin ile vacutainer kan toplama tüpleri içinde PB toplayın.
2. 15 ml'lik bir tüp içine kan transferi ve tam kan, 50 uL / ​​mL insan B-hücresi zenginleştirme kokteyl ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
3. PBS +% 2 FBS eşit hacimde örnek seyreltilir emin arabirimi kırmak için dikkat ederek, Ficoll üzerinde yavaş ve dikkatli bir katlamalı kan karıştırın. 15 ml t seyreltilmiş numunenin 2 kısım Ficoll, en az 1 kısmı kullanarak (örneğin 4 ml Ficoll + 10 ml kanube).
4. Hiçbir frenli 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (20 ° C) 400 xg'de santrifüj. Mononükleer hücreler arayüzde olacaktır.
5. Dikkatle hücreleri kurtarmak ve yeni bir tüp içine yerleştirmek için arayüz aspire. 5 dakika boyunca karanlıkta, 300 x g hızında santrifüj ve PBS ile bir defa, 4 ° C hücreleri yıkayın. Topak alt olacaktır.
6. Süpernatant atın. Ileri ve geri parmaklarınızla tüp hafifçe vurarak kalan süpernatantında pelletini. (% 10 Fetal dana serumu ve 15 mg / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640), 10 ml tam RPMI ortamı ile pelet seyreltin ve Tripan Mavisi dışlama yöntemi kullanarak hücreleri sayın.

1.2) saflığının değerlendirilmesi

Not: Tüm preparatların saflığı% 99'un üzerinde her zaman gerekir.

1. Aşağıdaki antikorlar ile saflaştırılmış hücre süspansiyonu 100 ul inkübe (ticari olarak temin edilebilir; Malzemelerin tabloya bakınız): CD3 _FITC (5 ul / test); CD14 _PE (5 ul / deney), CD19 _ECD (6 ul / deney), CD16-CD56 _PY5 (2 ul / deney), CD5 _PY7 bir 4 ° C'de 20 dakika boyunca (4 ul / deney), FACS tüpü.
2. (300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj) PBS içinde 4 ml ile örnek yıkayın ve arsa olarak yüzeyi üzerinde CD19 ile birlikte ifade CD5-CLL hücreleri (>% 99)% akış cytometry.Check ile saflığını kontrol Şekil 1 'de gösterilen (6). Hazırlıkları sıfıra yakın olmalıdır arsa, CD3, CD14 ve CD16-56 içinde% kontrol ederek NK, T lenfositlerin ve monositlerin neredeyse yoksun olduğundan emin olun.

1.3) Numuneler Depolama

1. Proteomik çalışmalar için, 10 dakika boyunca 300 x g'de 25 x 10 ^6, 1.5 ml bir tüp içinde hücreler, santrifüj hücreleri toplamak, 4 saat boyunca yüzer madde ve liyofilize pelet atın. -80 ° C'de kullanıma kadar muhafaza edin.
2. Tam RPMI doğrulama deneyleri, tekrar süspansiyon hücreleri (miktar daha tahlil bağlıdır içinseçilmiş) ve Adım 4 ile devam edin.

2. İki boyutlu Elektroforez (2-DE) (Şekil 2)

2.1) izoelektro-odaklanma (İEF)

1. 380 ul 2-DE tampon maddesi (bir RBthio çözeltisi 344 ul bir son hacme sahip CLL hücreleri topakları çözünürleştirilir (9 M üre, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 65 mm DTT, 30 ul,% 2 IPG tamponu amfolin 6 ul pH 4-7).
2. 18 IPG şeritler (pH 4-7) ile protein numuneleri (1 mg) uygulayın ve Conti ve arkadaşları tarafından tarif edilen standart protokol izlenerek IEF gerçekleştirin. ¹⁰
3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, taze DTT,% 2 ile takviye edilmiş, (6 M üre,% 30 gliserol,% 2 SDS ihtiva eden 50 mM, pH = 8,8 Tris-HCl tampon EB) dengeleme tampon maddesinin 2 ml şeritler dengelenmesi. Iskarta EB + DTT ve EB 2 ml ekleyin% 2.5 İyodoasetamid ile desteklenmiş. Sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.

2,2) SDS-PAGE

1. Çıkarmak için jel dokunmadan, bir kağıt üzerinde kurutun şeritlerEB fazla. Bir% 9-16 gradyan SDS-PAGE jeli üzerine her bir şerit yerleştirin. SDS-elektroforez tamponu (Tris 25 mM, 192 mM Glisin, a / h SDS,% 0,1) jelinin üzerine şeridin yüklenmesini kolaylaştırmak için küçük bir hacim.
2. Yüzer şeridin önlemek için agar çözeltisi (% 0.8), ~ 5 ml ilave etmek suretiyle jel Seal, daha sonra elektroforetik ünitesini kurmak ve SDS-elektroforez tamponu ile doldurun. 4 ° C'de 4 saat boyunca 60 mA / jel bölümünde çalışma gerçekleştirin.
3. Elektroforetik üniteden jel çıkarın ve düzgün boyama kutuya yerleştirin.

Preparatif Gel 2.3) Gümüş Leke

FIXER	% 50 metanol% 12 Asetik Asit % 0,05 Formalin	2 saat (veya gece) *
YIKAMA TAMPON	% 35 etil alkol'le	20 dakika (adımı üç kez tekrarlayın)
Sensitizing	% 0,02 Sodyum Tiyosülfat	2 dakika
YIKAMA	H2O	5 dk (adımı üç kez tekrarlayın)
Gümüş nitrat	% 0,2 Gümüş Nitrat 0076% Formalin	20 dakika
YIKAMA	H2O	1 dk (iki adımı tekrarlayın)
DEVELOPER	% 6 Sodyum Karbonat% 0,0004 Sodyum Tiyosülfat 0,05% formalin	Boyama yeterli olana kadar
Dur	50% Metanol	30 dakika
	* 2 saat minimum zaman protein tespiti için gerekli

Tablo 1.

NOT: Protein noktalar MS uyumlu gümüş boyası ¹¹ ile jeller boyanarak görülebilir. Tüm çözümler gereklidirGümüş boyama için Tablo 1 'de listelenmiştir.

1. Her bir çözelti / jel, yaklaşık 200 ml hazırlayın ve Tablo 1 'de gösterildiği gibi devam edin. Dikkatli bir jel ihtiva eden boyama kutusuna her bir çözeltiyi ekleyin. Sallanan bir platform üzerinde tüm inkübasyonlar gerçekleştirin.
2. Boyama işleminden sonra Durdurma çözeltisi çıkarın ve satın alınana kadar% 1 asetik asit çözeltisi içinde jel bırakın.

2.4) Jel ​​Toplama ve Analiz

1. Boyama itibaren 3 gün içinde bir dansitometresi kullanarak yüksek çözünürlükte görüntüler elde.
2. 2-DE jeller için yazılımı kullanarak 2 boyutlu protein kalıplarını analiz.
   NOT: yazılımı hızlı ve güvenilir bir görüntü karşılaştırma sağlar.
   1. Bağlam menüsünden "Yeni bir proje oluşturmak" seçerek bir proje oluşturun. Bir klasör oluşturun ve .tif ile "ithal jel görüntüleri" seçerek .png tarafından jeller içe. veya .gel uzantısı.
   2. Jeller ithal ve worksp eklenir kezace, menüde "tespit edit> nokta>" nokta tespiti için jeller seçip seçerek otomatik bir nokta algılaması gerçekleştirmek.
   3. Sonraki, menüde "çıkarma plan" seçerek bir arka plan çıkarma işlemleri. Not: Birden çok jelleri karşılaştırmak ve nicel ve / veya nitel analizi ile farklılıklar ve benzerlikler tespit etmek mümkündür Bundan sonra.

MALDI-TOF MS analizi ile 3. Protein Tanımlama (Şekil 3)

3.1) Protein Sindirimi

1. Ya (temiz bir neşter ile kesim) manuel veya otomatik eksizyon ile jeller ilgi ve su tüketim noktalar ile jel durulayın.
2. , Su (100-150 ul) ile jel parçacıkları yıkayın aşağı spin (400 x g'de 30 sn) ve sıvı çıkarın.
3. Jel parçalara _CH3 CN (jel hacmine bağlı olarak) bir eşit hacmi ekleyin ve jel parçaları küçültmek kadar 10-15 dakika boyunca bekleyin. Jel parçacıkları kurulayın ina vakum santrifüj.
4. 50 mM _{NH4 HCO3} içerisinde seyreltilmiş 10 mM ditioeritritol 75-100 ul ekleyin ve 56 ° C (Aşama indirgenmesi) 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşama 3.1.3 de tarif edildiği gibi tekrar _CH3CN ile jel parçaları küçültür.
5. MM iodoasetamid, 50 mM _{NH4 HCO3} içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe bir çözelti 55 75-100 ul ekleyerek alkilasyon ile devam edin.
6. Aşama 3.1.3 tarif edildiği gibi jel parçaları karşılamak için yeterli hacmi kullanılarak _CH3CN ile bir kez daha jel parçaları küçültür. Bir vakum santrifüj içinde kurutun.
7. 20 dakika boyunca 4 ° C de _{4 HCO3} 25 mM _NH, 5 mM _{CaCl2, ve 12.5 ng} tripsin _{/ ml} ihtiva eden bir tampon içinde, parçacıkları rehidrate. Jel parçaları karşılamak için yeterli hacim tampon kullanır. Jel parçalardan un-absorbe Süpernatantı ve 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM _CaCl2 tripsine olmadan cov eklejel er.
8. Gece boyunca 37 ° C'de en az 3 saat (peptid sindirimi için gerekli olan minimum süre) için numuneler bırakın.

3.2) Kütle Spektrometre Analiz (Kuru damlacık tekniği)

1. Paslanmaz çelik bir levha üzerine MALDI Her numunenin Noktası 1 ul eş-payı ve 50% _CH3CN ve% 0.1 TFA içinde hazırlanmış α-siyano-4-hidroksisinamik asit, matris olarak 1 ul ile karıştırılır.
2. Bir MALDI-TOF kütle spektrometresi üzerinde kütle spektrumları elde edilir. Lazer yoğunluğu sinyal doygunluğu önlemek veya sinyali artırmak için ayarlama, ve benek başına yaklaşık 200 spektrumları birikir. Veri Gezgin yazılımı ile işlem spektrumları, aşağıda tarif edildiği gibidir:
   1. .dat Dosyası almak ve "süreci> temel düzeltme" seçerek temel düzeltme gerçekleştirin. "Süreç> kütle kalibrasyon> manuel kalibrasyon seçerek tripsin otoliz ürünler ve matris zirveleri kullanarak kitleleri kalibre; m / z 855,1 ve 2163,1 b yakın zirveleri seçiny ardından "komplo" tıklayın ve manuel kalibrasyon penceresinde "kalibrasyonu uygulamak", sürükleyerek ve ilgili referans kitleleri seçin bıraktı.
   2. , ("Aktif iz yinelenen> Ekran") Etkin izlemeyi çoğaltmak, tepe tespiti için eşik ("pik> pik algılama") ayarlayın yeni iz seçin ve deisotoping ("pik> deisotoping") gerçekleştirin. Makro "getpeaklist" kullanarak, tanımlama için kullanılacak kitlelerin bir listesini oluşturmak. Gerekirse, elle listesini temizlemek ve daha iyi bir kimlik almak için zirveleri olarak aldı gürültü sinyalleri kaldırın.
3. Arama motorları ¹² kadar derin ve Mascot kullanarak kapsamlı bir yedekli olmayan protein veritabanı arayarak proteinleri tespit.
   1. Tüm aramalarda aşağıdaki parametreleri kullanın: Bir sabit modifikasyon ve başlatılışının olarak peptit başına bölünme, değişken modifikasyonu gibi metiyonin oksidasyonu, sistein karbamido cevapsız50 ppm arkadaşları kütle tolerans.

4. Sitoskeletal Etkinlik Tahliller (Şekil 4)

Not: süspanse hücreleri tam RPMI (10 ⁶ hücre / 200 ul) içindeki Aşama 1 'de arıtıldı.

4.1) Yer değiştirme tahlili. Bu test analiz hücreleri (lenfositler) göç kapasitesinin ölçümü sağlar. 6.5 mm çapında ve 5.0 mikron gözenek boyutunda bir Transwell odasını ve üç kopya halinde tahlilin gerçekleştirilmesi. Farklı hücre tipleri durumunda gözenek boyutuna ve geçiş süresi (Aşama 4.1.3) duruma getirin.

1. Sırasıyla indüklenen ve kendiliğinden migrasyonun ölçülmesi için ya da belirli bir uyaranlara (yani SDF-1) olmadan tam RPMI 600 ul ekleyerek alt odayı hazırlayın.
2. Bunun üzerindeki üst odasına koyun ve sistem kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
3. Tohum 10 ⁶ hücre / üst bölmeye 200 ul (Toplam hücre sayısı) ve inkübekuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat boyunca plakası.
4. , Üst oda çıkarın, alt bölmede ise medya toplamak ve 1 ml PBS ile bir kez alt odayı yıkayın. Tüp içinde PBS toplayın.
5. 5 dakika 300 x g'de santrifüje, 500 ul PBS içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.
6. Akış sitometrisi tarafından, satın alma 1 dakika sonra göç hücre sayısı. Izole edilmiş bir hücre popülasyonu durumunda, herhangi bir yüzey antikoru ilave etmek gerekli değildir. Hücrelerin yan scatter ve hesaplama için kullanılacak sayıdır, 1 dakika görüntülendi olayların sayısı göz önüne alındığında, bir iki-boyutlu bir nokta arsa hücre sayısını kontrol edin.
7. Göç Endeksi (MI) gibi hesaplayın:
   

4.2) Yapışma deneyi. Bu deney, hücre yapışma kapasitesinin ölçülmesi sağlar. Üç kopya halinde tahlil gerçekleştirin.

1. Ön ceket 96-welmi, 50 ul plakası (düz tabanlı) / oyuk ya da gece boyunca 4 ° C'de, PBS içinde sulandırılmış% 2 BSA-PBS (arka plan) ya da 1 ug, ICAM-1.
2. PBS ile iki kez, plakayı yıkayın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca% 2 BSA-PBS (100 ul / göz) eklenerek spesifik olmayan the bloke eder.
3. Tam RPMI içinde 5 x 10 ⁶ / ml arada tekrar süspansiyon hücrelerde, 1mM CMFDA-yeşil cep izci ile etiket ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
4. Blokaj çözeltisi (Aşama 4.2.2) çıkartıldıktan sonra 1 x 10 ⁶ hücre / oyuk önceden kaplanmış oyuklara ilave edin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir.
5. , Bir ELISA okuyucu kullanılarak yapışma miktarını (Uyarım filtresi: 485 nM, emisyon filtresi: 535 nM). Toplam girişi (GİRİŞ) bir ilk ölçümü yapın.
6. % 2 BSA-PBS ile hafifçe plakayı yıkayın (200 ul / kuyucuk) 4 kez (x). Her bir yıkama basamağı (Yapışma _x), ardından bir plaka okuma gerçekleştirin.
7. Her bir ölçüm için plan çıkarma sonra, belirli ADHES hesaplamakiyon (ADEZYON):
   

4.3) Polimerizasyon deneyi. Bu F-aktin polimerizasyonu rakamlarla bir kolorimetrik testtir. Üç kopya halinde tahlil gerçekleştirin.

1. Yeniden süspanse 1x10 ^, 10 dakika boyunca 6 önceden ısıtılmış tam RPMI, 100 ul hücre ve spesifik bir uyarıcı ekleme (örneğin, α-lgM 20 ug / ml).
2. % 4 paraformaldehit ile 400 ul reaksiyonu durdurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücrelerin tespit.
3. (5 dakika, 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj) 3 defa PBS ile yıkayın.
4. 2 dakika boyunca buz üzerinde, PBS-% 0.2 saponinler (200 ul) ile yüzer ve Permeabilize hücreleri atın.
5. , (5 dakika, 4 ° C'de 100 x g'de santrifüj) PBS-% 0.1 saponinler ile 3 kez 100 ul PBS ile yıkayın-saponinler% 0.1 supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
6. Oda t'de 30 dakika boyunca Phalloidin-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) ile LekeKaranlıkta emperature.
7. PBS-% 0.1 saponinler ile 3 kez yıkayın. 300 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant atılır.
8. Phalloidin bir ortalama flüoresans şiddeti (MFI) hesaplanması, akış sitometrisi ile, F-aktin miktarı belirlenmiştir. Floresan yoğunluğuna dayalı bir histogram üretmek için tek bir boyuta parselde oluşturulan verileri analiz, MFI değeri grafik raporu gösterilmiştir.
9. F-aktin polimerizasyonu (Δ F-aktin) olarak ölçün:
   

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz primer lösemi B hücreleri KLL hastalarının PB formu izole ve biz proteomik haritalar analiz. Numuneler (n = 104) her hasta (iyi prognoz vs kötü prognoz) ve 2DE jellerin karşılaştırmalı analizi yapılmıştır klinik özelliklerine göre iki ana alt gruplarında gruplandırıldı.

Analiz izin diferansiyel olarak ifade edilen iki alt noktalar arasındaki tanımlama (post-translasyonel modifikasyonlar değişiklik ima varlığında / yokluğunda, veya jel üzerinde kayma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda amacı, bu yaklaşım, başka hastalıklar ve / veya başka bir numune türlerine ^16-18 kadar uzatılabilir bile, CLL patogenezinde rol oynayan moleküllerin tanımlanması için optimize edilmiş bir protokol tanımlamaktır. Kötü prognoz ¹⁹ karşı iyi CLL 'li hastalarda, 2 altkümelerinin proteomik profilleri karşılaştırarak, bu HS1 fosforilasyon durumu açısından farklılık gösterir ve aktivasyonu lösemi hücrelerinin göçü ve yapışması kapasitesini...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488