Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica

Resumen

Aquí se describe un protocolo que las parejas de dos técnicas de proteómica, es decir, de 2 dimensiones electroforesis (2DE) y espectrometría de masas (MS), para identificar expresados ​​diferencialmente / proteínas modificadas después de la traducción entre dos o más grupos de muestras primarias. Este enfoque, junto con los experimentos funcionales, permite la identificación y caracterización de los marcadores de pronóstico / dianas terapéuticas.

Resumen

La identificación de moléculas implicadas en la iniciación y progresión tumoral es fundamental para la biología de la comprensión de la enfermedad y, como consecuencia, para el manejo clínico de los pacientes. En el presente trabajo vamos a describir un enfoque proteómico optimizado para la identificación de moléculas implicadas en la progresión de la leucemia linfocítica crónica (CLL). En detalle, lisados ​​de células leucémicas se resuelven por 2 dimensiones electroforesis (2DE) y visualizados como "puntos" en los geles 2DE. Análisis comparativo de los mapas proteómicos permite la identificación de proteínas expresadas diferencialmente (en términos de abundancia y modificaciones post-traduccionales) que se recogió, aislado e identificado por espectrometría de masas (MS). La función biológica de los candidatos identificados puede ser probada por diferentes ensayos (es decir, la migración, la adhesión y la polimerización de actina F), que se ha optimizado para las células leucémicas primarias.

Introducción

La leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia adulta más común en los países occidentales, se deriva de la acumulación de CD5 ⁺ linfocitos B neoplásicas monoclonales y es clínicamente muy heterogénea. Puede estar presente como una forma pre-leucémica, definida como la linfocitosis monoclonal de células B (MBL) ^1,2,3. En otros casos, la enfermedad puede aparecer ya sea con un curso clínico indolente, que puede permanecer estable durante años antes de necesitar tratamiento, o como una enfermedad resistente a la quimioterapia progresiva con pronóstico sombrío a pesar del tratamiento. Por último, puede progresar en un linfoma de alto grado con frecuencia letal (Síndrome de Richter-RS) ^2,3,4. Los pacientes se suelen clasificar en dos subgrupos principales: el bien y el mal pronóstico, con base en un conjunto de factores pronósticos que proporciona información complementaria sobre los predictores de evolución de la enfermedad y la supervivencia. La heterogeneidad clínica probablemente refleja la heterogeneidad biológica. Un número de factores genéticos, microambientales y ceSe ha demostrado que los factores llular concurrir a la patogénesis de la enfermedad, aunque no se han encontrado mecanismos unificadores ^5. En detalle, varios estudios han demostrado que las diferencias en el curso clínico de la enfermedad se pueden explicar en parte por la presencia (o la ausencia) de algunos marcadores biológicos que tienen un valor pronóstico ^6,7,8. Estos datos demostraron que una mejor comprensión de la biología de la enfermedad podría proporcionar pistas adicionales para el manejo clínico de la patología, por la identificación de ambos marcadores de pronóstico y dianas terapéuticas.

El objetivo del presente trabajo es mostrar cómo una combinación de diferentes técnicas de proteómica se puede utilizar para la identificación de las proteínas implicadas en la aparición y progresión CLL. Nuestro enfoque demuestra que es posible unir juntos proteómico básica y los datos clínicos ^5.

En el presente flujo de trabajo, las células leucémicas primarias de pacientes seleccionados(Bien vs mal pronóstico) están aislados y lisados ​​celulares se usan después para obtener mapas proteómicos. 2DE permite la caracterización del perfil proteómico de una población de células, incluidas las modificaciones post-traduccionales, dando así información indirecta sobre la actividad biológica de cada proteína. Lisados ​​de células enteras se resuelven por un primer plazo dimensión basada en el punto isoeléctrico, seguida de una segunda dimensión ejecutarse en un gel de poliacrilamida que resuelve las proteínas en función de su peso molecular. Análisis comparativo de los mapas proteómicos permite la identificación de proteínas expresadas diferencialmente (tanto en términos de abundancia y modificaciones post-traduccionales) como manchas en el gel que se pueden cortar y se analizaron por espectrometría de masas. El papel de cada candidato puede ser entonces explotada por diferentes ensayos.

Este enfoque, restringido a CLL en el manuscrito actual, se puede ampliar fácilmente a otras enfermedades / muestras, proporcionando así información sobre el proteomic / diferencias biológicas entre dos grupos (es decir, patológicas vs normales, estimulados vs no estimulada, de tipo salvaje vs knockdown).

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Protocolo

NOTA: Todas las muestras de tejido se obtuvieron con la aprobación de la junta de revisión institucional del Hospital San Raffaele (Milán, Italia).

1. muestras de tejido humano y purificación celular (Figura 1)

NOTA: se obtuvieron linfocitos leucémicos de la sangre periférica (PB) de los pacientes con LLC, diagnosticados según Mulligan et al ^9.

1.1) Separación leucémica Móvil desde PB

1. Recoger PB en vacutainer tubos de recogida de sangre con heparina sódica.
2. Transferencia de sangre en un tubo de 15 ml y añadir cóctel de enriquecimiento de células B humanas a 50 l / ml de sangre entera. Mezclar bien e incubar 20 min a temperatura ambiente.
3. Diluir la muestra con un volumen igual de PBS + FBS al 2%, mezcle suavemente y con cuidado de superposición en la sangre durante el Ficoll, asegurándose de no romper la interfaz. Utilice por lo menos 1 parte de Ficoll a 2 partes de la muestra diluida (es decir, 4 ml de Ficoll + 10 ml de sangre en unos 15 ml de tube).
4. Centrifugar a 400 xg, a temperatura ambiente (20 ° C) durante 20 min sin freno. Las células mononucleares estarán en la interfaz.
5. Aspirar con cuidado la interfaz para recuperar las células y colocar en un tubo nuevo. Lavar las células una vez con PBS y centrifugar a 300 xg, 4 ° C en la oscuridad durante 5 min. El sedimento será en la parte inferior.
6. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante accionando el tubo de ida y vuelta con los dedos. Diluir el sedimento con 10 ml de medio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal y 15 mg / ml de gentamicina) y contar las células usando el método de exclusión de azul de tripano.

1.2) Evaluación Pureza

NOTA: La pureza de todas las preparaciones necesita estar siempre por encima de 99%.

1. Incubar 100 l de suspensión celular purificada con los siguientes anticuerpos (disponibles comercialmente; véase la Tabla de Materiales): CD3 _FITC (5 l / TESt), CD14 _PE (5 l / prueba), CD19 _ECD (6 l / prueba), CD16-CD56 _PC5 (2 l / prueba), CD5 _PC7 (4 l / ensayo), durante 20 min a 4 ° C en un tubo de FACS.
2. Lavar la muestra con 4 ml de PBS (centrífuga durante 5 minutos a 300 xg) y comprobar la pureza de flujo cytometry.Check en la trama del% de las células de LLC (> 99%) que co-expresan CD19 y CD5 en su superficie como se muestra en la Figura 1 (6). Asegúrese de que los preparativos están prácticamente desprovistos de NK, linfocitos T y monocitos comprobando el% de CD3, CD14 y CD16-56 en la trama, que debe estar cerca de cero.

1.3) Las muestras de almacenamiento

1. Para los estudios proteómicos, recoger 25 x 10 ⁶ células en un tubo de 1,5 ml, centrifugar las células a 300 xg durante 10 min, desechar los pellets sobrenadante y liofilizar durante 4 horas. Mantener a -80 ° C hasta su uso.
2. Para los ensayos de validación, Resuspender las células en RPMI completo (cantidad depende del ensayo adicional que seelegido) y proceda con el Paso 4.

2. electroforesis bidimensional (2-DE) (Figura 2)

2.1) isoelectroenfoque (IEF)

1. Solubilizar las células de CLL gránulos con un volumen final de 380 l 2-DE tampón (344 l de una solución RBthio (9 M urea, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 l de 65 mM de DTT, 6 l de 2% IPG anfolina tampón pH 7.4).
2. Aplicar las muestras de proteínas (1 mg) a 18 tiras de IPG (pH 4.7) y llevar a cabo IEF siguiente protocolo estándar como se describe por Conti et al. ¹⁰
3. Equilibrar las tiras en 2 ml de tampón de equilibrio (EB: 50 mM de tampón pH 8,8 que contiene Tris-HCl 6 M urea, 30% de glicerol, 2% SDS), suplementado con 2% de la TDT fresca, durante 15 minutos a RT. Descartar EB + TDT y añadir 2 ml de EB complementados con 2,5% Yodoacetamida. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.

2,2) SDS-PAGE

1. Secar las tiras sobre un papel sin tocar el gel para eliminarel exceso de EB. Cargar cada tira en la parte superior de un gradiente de gel de SDS-PAGE al 9-16%. Añadir un pequeño volumen de SDS-Tampón de electroforesis (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% w / v) en la parte superior del gel para facilitar la carga de la tira.
2. Sellar el gel mediante la adición de ~ 5 ml de solución de agar (0,8%) para prevenir flotante de la tira, a continuación, montar la unidad electroforética y llenar con tampón de SDS-electroforesis. Lleve a cabo la carrera a 60 mA / gel durante 4 horas a 4 ° C.
3. Retire el gel de la unidad electroforética y colocarlo en el cuadro tinción adecuada.

2.3) las manchas de Plata a la preparación del gel

FIXER	50% de metanol 12% de ácido acético 0,05% de formalina	2 h (o durante la noche) *
TAMPÓN DE LAVADO	35% Ehanol	20 min (repita el paso tres veces)
SENSIBILIZACIÓN	0,02% de tiosulfato de sodio	2 min
WASH	H 2 O	5 min (repita el paso tres veces)
El nitrato de plata	0,2% de nitrato de plata 0,076% de formalina	20 min
WASH	H 2 O	1 min (repita el paso dos veces)
REVELADOR	6% de carbonato de sodio 0,0004% de tiosulfato de sodio 0,05% de formalina	Hasta la tinción es suficiente
Deténgase	50% de metanol	30 min
	* Hr 2 se requiere que el tiempo mínimo para la fijación de proteínas

Tabla 1.

NOTA: manchas de proteínas se pueden visualizar por tinción de geles con tinción de plata compatible MS ^11. Todas las soluciones necesariaspara la tinción de plata se enumeran en la Tabla 1.

1. Preparar aproximadamente 200 ml de cada solución / gel y proceder como se indica en la Tabla 1. Añadir cuidadosamente cada solución a la caja de tinción que contiene el gel. Realice todas las incubaciones en una plataforma oscilante.
2. Después de la tinción, eliminar la solución de parada y dejar el gel en una solución de 1% de ácido acético hasta que la adquisición.

2.4) Gel Adquisición y Análisis

1. Adquirir las imágenes en alta resolución utilizando un densitómetro plazo de 3 días a partir de la tinción.
2. Analizar los patrones de proteínas 2-D mediante el uso de software para la 2-DE geles.
   NOTA: El software permite una comparación de imágenes rápido y fiable.
   1. Crear un proyecto eligiendo "crear un nuevo proyecto" en el menú contextual. Crear una carpeta e importar los geles eligiendo "imágenes de gel de importación" con .tif, png. o .gel extensión.
   2. Una vez que los geles se importan y se añaden a la workspas, realizar una detección de punto automático seleccionando los geles para la detección in situ y seleccionando "Editar> punto> detectar" en el menú.
   3. A continuación, realice una sustracción de fondo seleccionando en el menú "fondo de resta". Nota: Después de que es posible la comparación de varios geles y detectar diferencias o similitudes de análisis cuantitativo y / o cualitativo.

3. Identificación de proteínas por MALDI-TOF MS análisis (Figura 3)

3.1) la digestión de proteínas

1. Enjuague el gel con agua y los impuestos especiales puntos de interés a partir de geles ya sea manual (corte con un bisturí limpio) o por escisión automatizado.
2. Lávese las partículas de gel con agua (100-150 l), girar hacia abajo (30 seg a 400 xg) y eliminar el líquido.
3. Añadir un volumen igual (dependiendo del volumen de gel) de CH ₃ CN a las piezas de gel y esperar durante 10-15 minutos hasta que las piezas de gel se encogen. Seque las partículas de gel ina centrífuga de vacío.
4. Añadir 75-100 l de 10 mM ditioeritritol diluido en 50 mM NH ₄ HCO ₃ y se incuba durante 30 min a 56 ° C (Reducción de Paso). Shrink de nuevo las piezas de gel con CH ₃ CN como se describe en el Paso 3.1.3.
5. Proceder con la alquilación mediante la adición de 75-100 l de una solución 55 mM yodoacetamida diluye en 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubar durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
6. Reducir las piezas de gel una vez más con CH ₃ CN usando suficiente volumen para cubrir las piezas de gel como se describe en el Paso 3.1.3. Secar en una centrífuga de vacío.
7. Rehidratar las partículas en una solución tampón que contiene 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM CaCl _{2, y 12,5 ng /} l de tripsina a 4 ° C durante 20 min. Use suficiente volumen de tampón para cubrir las piezas de gel. Eliminar el sobrenadante no-absorbido de las piezas de gel y añadir 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM CaCl ₂ sin tripsina para cover el gel.
8. Deja muestras a 37 ° C al menos 3 horas (el tiempo mínimo requerido para la digestión del péptido) a durante la noche.

3.2) Análisis de Espectrometría de Masas (técnica de gotas secas)

1. Spot 1 l alícuota de cada muestra sobre una placa MALDI de acero inoxidable y se mezcla con 1 l de α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz, preparados en 50% _{de CH3CN} y 0,1% de TFA.
2. Obtener espectros de masas en un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Acumula aproximadamente 200 espectros por punto, el ajuste de la intensidad del láser para evitar la saturación de la señal o para aumentar la señal. Espectros de proceso a través del software del explorador de datos tal como se describe a continuación:
   1. Importe el archivo dat y realizar la corrección base, elija "proceso> corrección de línea base". Calibrar masas utilizando los productos de autolisis de tripsina y picos de matriz eligiendo "proceso> calibración de masa> Calibración manual; seleccione picos cercanos a m / z 855,1 y 2.163,1 by dejó arrastrar y seleccionar las masas de referencia correspondientes, a continuación, haga clic en "complot" y "aplicar la calibración" en la ventana de calibración manual.
   2. Ajuste el umbral para la detección de picos ("pico> detección de pico"), duplicar la traza activa ("display> duplicar traza activa"), seleccione la nueva traza y realizar la deisotoping ("pico> deisotoping"). Uso de la macro "getpeaklist", generar una lista de masas a ser utilizado para la identificación. Si es necesario, quite manualmente las señales de ruido recogido como picos para limpiar la lista y obtener una mejor identificación.
3. Identificar las proteínas mediante la búsqueda en una base de datos completa de proteínas no redundante usando profunda y la mascota de los motores de búsqueda ^12.
   1. Utilice los siguientes parámetros en todas las búsquedas: uno perdió la escisión por péptido, la oxidación de la metionina como variable modificación, carbamidomethylation cisteína como fijo modificación y un initolerancia de masa al de 50 ppm.

4. Citoesqueleto Actividad ensayos (Figura 4)

NOTA: Resuspender las células purificadas en el paso 1 en RPMI completo (10 ⁶ células / 200 l).

4.1) Ensayo de Migración. Esta prueba permite la cuantificación de la capacidad migratoria de las células analizadas (linfocitos). Utilice una cámara transwell de 6,5 mm de diámetro y 5,0 m de tamaño de poro y realizar el ensayo por triplicado. Optimizar tamaño de poro y el tiempo de migración (Paso 4.1.3) en el caso de diferentes tipos de células.

1. Preparar la cámara inferior mediante la adición de 600 l de RPMI completo con o sin los estímulos específicos (es decir, SDF-1) para medir la migración espontánea y la inducida respectivamente.
2. Ponga la cámara alta en él y dejar que el sistema se equilibre durante 30 minutos a 37 ° C en la incubadora.
3. Semilla 10 ⁶ células / 200 l en la cámara superior (número total de células) e incubarla placa durante 4 horas a 37 ° C en la incubadora.
4. Retire la cámara superior, recoger los medios de comunicación en la cámara inferior y lavar la cámara baja una vez con 1 ml de PBS. Recoger el PBS en el tubo.
5. Centrifugar 5 minutos a 300 xg, desechar el sobrenadante y resuspender en 500 l de PBS.
6. Por citometría de flujo, contar el número de células que migraron después de 1 min de adquisición. En caso de una población de células aisladas que no es necesario añadir ningún anticuerpo de superficie. Compruebe el número de células en un gráfico de puntos bi-dimensional teniendo en cuenta las dispersiones laterales de las células y el número de eventos visualizados en 1 min, que es el número a usar para el cálculo.
7. Calcular el Índice de Migración (MI) como:
   

4.2) La adhesión de ensayo. Este ensayo permite la medición de la capacidad de adhesión de las células. Realizar el ensayo por triplicado.

1. Pre-coat 96-wells placa (de fondo plano) con 50 l / pocillo de 2% de BSA-PBS (como fondo) o 1 g ICAM-1 diluido en PBS, durante la noche a 4 ° C.
2. Lavar la placa dos veces con PBS y bloquear los sitios no específicos mediante la adición de 2% de BSA-PBS (100 l / pocillo) durante 1 hora a 37 ° C.
3. En las células volver a suspender mientras tanto a 5 x 10 ⁶ / ml en RPMI completo, etiquetarlos con rastreador celular 1 mM CMFDA-verde e incubar 30 min a 37 ° C.
4. Añadir 1 x 10 ⁶ células / pocillo a los pocillos previamente recubiertos después de desechar la solución de bloqueo (Paso 4.2.2) y se incuba 1 hora a 37 ° C.
5. Cuantificar la adhesión mediante el uso de un lector de ELISA (Excitación filtro: 485 nM, filtro de emisión: 535 nm). Lleve a cabo una primera medición en la entrada total (INPUT).
6. Lavar la placa suavemente con 2% BSA-PBS (200 l / pocillo) 4 veces (x). Realizar una lectura de la placa después de cada etapa de lavado (Adhesión _x).
7. Después de sustracción de fondo para cada medición, cálculo ADHES específicosion (ADHESION):
   

4.3) Ensayo de polimerización. Este es un ensayo colorimétrico que cuantifica la polimerización de actina-F. Realizar el ensayo por triplicado.

1. Resuspender 1x10 ^ 6 células en 100 l de pre-calentado RPMI completo y añadir el estímulo específico (es decir, α-IgM 20 mg / ml) durante 10 min.
2. Detener la reacción con 400 l de paraformaldehído al 4% y fijar las células durante 10 min a RT.
3. Lavar 3 veces con PBS (centrifugar a 300 xg durante 5 min, 4 ° C).
4. Descartar el sobrenadante y las células permeabilizar con PBS-saponina 0,2% (200 l) en hielo durante 2 min.
5. Lavar 3 veces con PBS-saponina 0,1% (centrifugar a 100 xg durante 5 min, 4 ° C), descartar el sobrenadante y resuspender en 100 l de PBS-saponina 0,1%.
6. Teñir con faloidina-Alexafluor 488 (3 mg / ml) durante 30 minutos en la sala de temperatura en la oscuridad.
7. Lavar 3 veces con PBS-saponina 0,1%. Descartar el sobrenadante y resuspender en 300 l de PBS.
8. Cuantificar la cantidad de F-actina mediante citometría de flujo, el cálculo de la intensidad media de Florescence (IMF) de la faloidina. Analizar los datos generados en una sola parcela dimensión con el fin de producir un histograma basado en la intensidad de fluorescencia, el valor de las IFM se muestra en el informe de gráfico.
9. Mida la polimerización de actina F (Δ F-actina) como:
   

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Resultados

Se aislaron las células B leucémicas primarias forman PB de los pacientes con LLC y se analizaron los mapas proteómicos. Las muestras (n = 104) se agruparon en dos subgrupos principales en base a las características clínicas de cada paciente (mal pronóstico vs buen pronóstico) y se realizó un análisis comparativo de los geles 2DE.

El análisis permitió la identificación de los puntos expresados ​​diferencialmente entre los dos subconjuntos (en términos de la presenci...

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Discusión

El objetivo de este manuscrito es describir un protocolo optimizado para la identificación de moléculas implicadas en la patogénesis de la CLL, incluso si este enfoque puede extenderse a otras enfermedades y / o en otros tipos de muestras ^16-18. Mediante la comparación de los perfiles proteómicos de 2 subconjuntos de pacientes con LLC, bueno contra mal pronóstico ^19, hemos demostrado que se diferencian en el estado de fosforilación de HS1, y que su activación afecta a la capa...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488