D'un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

Résumé

Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d'identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d'échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l'identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.

Résumé

L'identification des molécules impliquées dans l'initiation et la progression de la tumeur est essentielle à la compréhension de la biologie de la maladie et, en conséquence, pour la prise en charge clinique des patients. Dans le présent travail, nous allons décrire une approche protéomique optimisé pour l'identification des molécules impliquées dans la progression de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Dans le détail, les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse en 2 dimensions (2DE) et visualisées sous forme de "taches" sur les gels de 2DE. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l'identification de protéines exprimées de façon différentielle (en termes d'abondance et de modifications post-traductionnelles) qui sont cueillies, isolé et identifié par spectrométrie de masse (MS). La fonction biologique des candidats identifiés peut être testée par des dosages différents (c.-à-migration, l'adhésion et la polymérisation de l'actine F), que nous avons optimisé pour les cellules leucémiques primaires.

Introduction

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie de l'adulte le plus fréquent dans les pays occidentaux, découle de l'accumulation de CD5 ⁺ lymphocytes B néoplasiques monoclonaux et est cliniquement très hétérogène. Il peut être présent sous une forme pré-leucémique, définie comme une lymphocytose monoclonal cellules B (MBL) ^1,2,3. Dans d'autres cas, la maladie peut apparaître soit avec une évolutivité clinique, qui peut rester stable pendant des années avant d'avoir besoin de traitement, ou comme une maladie progressive avec chemorefractory mauvais pronostic malgré le traitement. Enfin, elle peut évoluer en un lymphome de haut grade fréquemment mortelle (syndrome RS de Richter) ^2,3,4. Les patients sont généralement classés en deux sous-ensembles principaux: bon et mauvais pronostic, basé sur un ensemble de facteurs pronostiques qui fournit des informations complémentaires sur les prédicteurs de l'issue de la maladie et de la survie. L'hétérogénéité clinique reflète probablement l'hétérogénéité biologique. Un certain nombre de facteurs génétiques, microenvironnement et CEIl a été démontré facteurs llular de concourir à la pathogenèse de la maladie mais pas de mécanismes fédérateurs ont été trouvés ^5. Dans le détail, plusieurs études ont démontré que les différences dans l'évolution clinique de la maladie peuvent s'expliquer en partie par la présence (ou l'absence) de certains marqueurs biologiques qui ont une valeur pronostique de ^6,7,8. Ces données ont démontré qu'une meilleure compréhension de la biologie de la maladie pourrait fournir des indices supplémentaires pour la prise en charge clinique de la pathologie, par l'identification de deux marqueurs pronostiques et cibles thérapeutiques.

L'objectif du présent document est de montrer comment une combinaison de différentes techniques de protéomique peut être utilisé pour l'identification de protéines impliquées dans la LLC apparition et la progression. Notre approche démontre qu'il est possible de rejoindre protéomique ensemble de base et les données cliniques ^5.

Dans le présent flux de travail, les cellules leucémiques primaires chez certains patients(Bon vs mauvais pronostic) sont isolés et les lysats cellulaires sont ensuite utilisés pour obtenir des cartes protéomiques. 2DE permet la caractérisation du profil protéomique d'une population de cellules, y compris des modifications post-traductionnelles, donnant ainsi des informations indirectes sur l'activité biologique de chaque protéine. Des lysats de cellules entières sont réglées par un premier passage de dimension sur la base du point isoélectrique, suivie d'une seconde dimension sur un gel de polyacrylamide qui permet de résoudre les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l'identification de protéines différentiellement exprimés (à la fois en termes d'abondance et de modifications post-traductionnelles) comme des taches sur le gel qui peuvent être coupés et analysés par spectrométrie de masse. Le rôle de chaque candidat peut alors être exploité par différents tests.

Cette approche, limitée à CLL dans le manuscrit actuel, peut être facilement étendue à d'autres maladies / échantillons, fournissant ainsi des informations sur la proteomic / les différences biologiques entre les deux groupes (c.-à-pathologiques vs normale, stimulés vs, de type sauvage non stimulées vs knockdown).

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Protocole

REMARQUE: Tous les échantillons de tissus ont été obtenus avec l'approbation du comité d'éthique de l'hôpital San Raffaele (Milan, Italie).

1. échantillons de tissus humains et de cellules purification (Figure 1)

REMARQUE: les lymphocytes leucémiques ont été obtenues à partir du sang périphérique (PB) de patients atteints de LLC, diagnostiqués selon Mulligan et al ^9.

1.1) cellules leucémiques séparation de PB

1. Recueillir PB en collecte de sang tubes Vacutainer avec héparine de sodium.
2. Transférer le sang dans un tube de 15 ml et ajouter des cellules B humaines enrichissement cocktail à 50 ul / ml de sang entier. Bien mélanger et incuber 20 min à température ambiante.
3. Diluer l'échantillon avec un volume égal de PBS + 2% de FBS, mélanger le sang avec douceur et précaution superposition sur le Ficoll, veillant à ne pas briser l'interface. Utilisez au moins une partie de Ficoll à 2 parties de l'échantillon dilué (soit 4 ml de Ficoll + 10 ml de sang dans un 15 ml tube).
4. Centrifuger à 400 xg, à température ambiante (20 ° C) pendant 20 min sans frein. Les cellules mononucléaires seront à l'interface.
5. Aspirer soigneusement l'interface pour récupérer les cellules et les placer dans un nouveau tube. Laver les cellules une fois avec du PBS et on centrifuge à 300 x g, 4 ° C dans l'obscurité pendant 5 minutes. Le culot sera en bas.
6. Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans le surnageant restant en tapotant le tube d'avant en arrière avec les doigts. On dilue le culot avec 10 ml de milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 15 mg / ml de gentamicine) et compter les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion au bleu Trypan.

1.2) L'évaluation de la pureté

REMARQUE: Pureté de toutes les préparations doit toujours être supérieure à 99%.

1. Incuber 100 pi de suspension cellulaire purifiée avec les anticorps suivants (disponibles dans le commerce; voir le tableau des matériaux): CD3 _FITC (5 pi / test), CD14 _PE (5 pi / essai), CD19 _DPE (6 pi / essai), CD16-CD56 _PC5 (2 pi / essai), CD5 _PC7 (4 pi / essai), pendant 20 min à 4 ° C dans un Tube FACS.
2. Laver l'échantillon avec 4 ml de PBS (centrifugeuse pendant 5 min à 300 g) et vérifier la pureté par flux cytometry.Check dans le complot du% de cellules leucémiques (> 99%) qui co-expriment CD19 et CD5 sur leur surface comme représenté sur la figure 1 (6). Veiller à ce que les préparatifs sont pratiquement dépourvues de NK, lymphocytes T et les monocytes en cochant la% de CD3, CD14 et CD16-56 dans le complot, qui devrait être proche de zéro.

1.3) Les échantillons de stockage

1. Pour les études protéomiques, collecter 25 x 10 ⁶ cellules dans un tube de 1,5 ml, les cellules de centrifugation à 300 g pendant 10 min, jeter le surnageant et lyophiliser boulettes pendant 4 heures. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
2. Pour les essais de validation, remettre les cellules en RPMI complet (quantité dépend de l'analyse en outre que c'estchoisi) et passez à l'étape 4.

2 électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) (figure 2)

2.1) isoélectrofocalisation (IEF)

1. Solubiliser les cellules CLL pastilles avec un volume final de 380 ul de 2-DE tampon (344 ul d'une solution RBthio (9 M d'urée, Tris 10 mM, 4% de CHAPS), 30 pl de 65 mm de DTT, 6 ul de 2% IPG ampholine tampon pH 7.4).
2. Appliquer les échantillons de protéines (1 mg) à 18 bandes IPG (pH 4-7) et effectuer IEF suivant le protocole standard telle que décrite par Conti et al. ¹⁰
3. Equilibrer les bandes dans 2 ml de tampon d'équilibration (EB: tampon 50 mM pH 8.8 contenant du Tris-HCl 6 M d'urée, 30% de glycerol, 2% de SDS), additionné de 2% de frais de DTT pendant 15 minutes à température ambiante. Jeter EB + TNT et ajouter 2 ml de EB complétés avec 2,5% Iodoacetamide. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur oscillant.

2.2) SDS-PAGE

1. Sécher les plaques sur un papier sans toucher le gel pour éliminerl'excès de EB. Chargez chaque bande sur le dessus d'un gel de 9-16% de SDS-PAGE gradient. Ajouter une petite quantité d'électrophorèse SDS-tampon (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1% p / v) sur le dessus du gel, pour faciliter le chargement de la bande.
2. Sceller le gel par addition de ~ 5 ml de solution d'agar (0,8%) afin d'éviter de flotter la bande, puis l'assemblage de l'unité d'électrophorèse et remplir avec du tampon SDS-électrophorèse. Effectuer la course à 60 mA / gel pendant 4 heures à 4 ° C.
3. Retirer le gel de l'unité d'électrophorèse et le placer dans la boîte de bonne coloration.

2.3) coloration à l'argent pour préparative de gel

FIXER	50% methanol 12% d'acide acétique 0,05% de formol	2 heures (ou toute la nuit) *
TAMPON DE LAVAGE	35% Ehanol	20 min (répéter l'étape trois fois)
SENSIBILISATION	0,02% de thiosulfate de sodium	2 min
WASH	H 2 O	5 min (répéter l'étape trois fois)
NITRATE D'ARGENT	0,2% de nitrate d'argent 0,076% formol	20 min
WASH	H 2 O	1 min (répéter l'étape deux fois)
DÉVELOPPEUR	6% de carbonate de sodium 0,0004% de thiosulfate de sodium 0,05% de formol	Jusqu'à ce que la coloration est suffisante
Arrêtez	50% de méthanol	30 min
	* 2 heures est le temps minimum nécessaire pour fixation de la protéine

Tableau 1.

REMARQUE: les taches de protéines peuvent être visualisées par coloration des gels avec MS compatible coloration à l'argent ^11. Toutes les solutions nécessairespour coloration à l'argent sont énumérées dans le tableau 1.

1. Préparer environ 200 ml de chaque solution / gel et procéder comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter délicatement chaque solution à la boîte de coloration contenant le gel. Effectuer toutes les incubations sur une plate-forme à bascule.
2. Après la coloration, enlever la solution d'arrêt et laisser le gel dans une solution de 1% d'acide acétique jusqu'à ce que l'acquisition.

2.4) Gel d'acquisition et d'analyse

1. Acquérir des images à haute résolution à l'aide d'un densitomètre dans les 3 jours à partir de la coloration.
2. Analyser les modèles de protéines 2-D en utilisant un logiciel de 2-DE gels.
   REMARQUE: Le logiciel permet une comparaison d'image rapide et fiable.
   1. Créez un projet en choisissant "créer un nouveau projet" dans le menu contextuel. Créez un dossier et importer les gels en choisissant "images de gel d'importation" avec .tif, png. ou .gel prolongation.
   2. Une fois que les gels sont importés et ajoutés à la workspace, effectuer une détection d'angle automatique en sélectionnant les gels pour la détection de place et en choisissant "edit> place> détecter" dans le menu.
   3. Ensuite, effectuer une soustraction de fond en sélectionnant dans le menu "fond soustraction". Remarque: Après cela, il est possible de comparer plusieurs gels et de détecter des différences ou des similitudes par l'analyse quantitative et / ou qualitative.

3 Identification des protéines par MALDI-TOF MS (Figure 3)

3.1) La digestion des protéines

1. Rincer le gel avec des taches d'eau et d'accise d'intérêt à partir de gels soit par manuel (coupant avec un scalpel propre) ou par excision automatisée.
2. Laver les particules de gel avec de l'eau (100-150 pi), tourner vers le bas (30 sec à 400 xg) et enlever le liquide.
3. Ajouter un volume égal (en fonction du volume de gel) de CH ₃ CN pour les morceaux de gel et attendre pendant 10-15 min jusqu'à ce que les morceaux de gel se rétrécir. Sécher les particules de gel ina centrifugeuse sous vide.
4. Ajouter 75 à 100 ul de 10 mM de dithioérythritol dilué dans 50 mM de NH ₄ HCO ₃ et incuber pendant 30 min à 56 ° C (étape de réduction). Réduction de nouveau les morceaux de gel avec CH ₃ CN comme décrit à l'étape 3.1.3.
5. Procéder à alkylation en ajoutant 75-100 ul d'une solution à 55 mM Iodoacetamide dilué dans 50 mM NH ₄ HCO ₃ et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
6. Réduction de la taille des morceaux de gel une fois avec CH ₃ CN en utilisant un volume suffisant pour recouvrir les morceaux de gel comme décrit dans l'étape 3.1.3. Sec dans une centrifugeuse sous vide.
7. Réhydrater les particules dans un tampon contenant 25 mM de NH ₄ HCO _3, 5 mM de _{CaCl2, et 12,5 ng /} ul de trypsine à 4 ° C pendant 20 min. Utilisez un volume suffisant de tampon pour couvrir les morceaux de gel. Eliminer le surnageant de non absorbé par les morceaux de gel et ajouter mM NH 25 ₄ HCO _3, 5 mM de _CaCl2 sans trypsine à cover le gel.
8. Laisser les échantillons à 37 ° C au moins 3 heures (le délai minimum requis pour le peptide digestion) pour la nuit.

3.2) Spectrométrie de masse analyse (technique de gouttelettes séchées)

1. Coin 1 ul aliquote de chaque échantillon sur une plaque MALDI en acier inoxydable et mélanger avec 1 pi d'α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice, préparées dans 50% de CH ₃ CN et 0,1% de TFA.
2. Obtenir des spectres de masse sur un spectromètre de masse MALDI-TOF. Accumuler environ 200 spectres par endroit, en ajustant l'intensité du laser pour éviter la saturation du signal ou pour augmenter le signal. spectres de processus via le logiciel Data Explorer comme décrit ci-dessous:
   1. Importez le fichier dat et effectuer la correction de base en choisissant "processus> correction de base". Calibrer masses en utilisant les produits d'autolyse de la trypsine et les sommets de la matrice en choisissant "processus> étalonnage de masse> étalonnage manuel; sélectionnez pics proches de m / z 855,1 et 2163,1 by faisant glisser à gauche et sélectionner les masses de référence correspondant, puis cliquez sur «complot» et «s'applique calibrage" dans la fenêtre de calibrage manuel.
   2. Régler le seuil de détection de crête ("pic> détection de crête"), dupliquer la trace active ("affichage> dupliquer trace active"), sélectionnez la nouvelle trace et effectuer la deisotoping ("pic> deisotoping"). Utilisation de la macro "getpeaklist", générer une liste de masses à être utilisé pour l'identification. Si nécessaire, supprimer manuellement les signaux de bruit cueillis comme des pics pour nettoyer la liste et obtenir une meilleure identification.
3. Identifier les protéines par la recherche d'une base de données de protéines non-redondant complet utilisant profonde et Mascot les moteurs de recherche ^12.
   1. Utilisez les paramètres suivants dans toutes les recherches: on a manqué clivage par peptide, l'oxydation de la méthionine comme modification dans une variable, la cystéine carbamidomethylation que la modification fixe et une initial masse tolérance de 50 ppm.

4. cytosquelette des tests d'activité (Figure 4)

REMARQUE: Remettre en suspension les cellules purifiées à l'étape 1 dans du milieu RPMI complet (10 ⁶ cellules / 200 ul).

4.1) Migration dosage. Cet essai permet la quantification de la capacité de migration des cellules analysées (lymphocytes). Utiliser une chambre Transwell de 6,5 mm de diamètre et 5,0 pm de taille de pores et effectuer les essais en triple exemplaire. Optimiser la taille des pores et le temps de migration (étape 4.1.3) dans le cas de différents types de cellules.

1. Préparer la chambre inférieure en ajoutant 600 ul de RPMI complet avec ou sans stimuli spécifiques (SDF-1) pour mesurer la migration spontanée et induite par l'respectivement.
2. Mettre la chambre supérieure et à laisser le système s'équilibrer pendant 30 minutes à 37 ° C dans l'incubateur.
3. Semences 10 ⁶ cellules / 200 pi dans la chambre haute (nombre total de cellules) et incuberla plaque pendant 4 heures à 37 ° C dans l'incubateur.
4. Retirer la chambre haute, recueillir les médias dans la chambre inférieure et laver la chambre basse une fois avec 1 ml de PBS. Recueillir le PBS dans le tube.
5. Centrifugeuse 5 minutes à 300 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de PBS.
6. Par cytométrie en flux, compter le nombre de cellules ayant migré après 1 min de l'acquisition. Dans le cas d'une population cellulaire isolée, il n'est pas nécessaire d'ajouter un anticorps de surface. Vérifiez le nombre de cellules dans un complot point bidimensionnel considérant les disperse secondaires des cellules et le nombre d'événements visualisés en 1 min, ce qui est le nombre à utiliser pour le calcul.
7. Calculer l'indice de migration (MI) que:
   

4.2) test d'adhérence. Ce test permet de mesurer la capacité d'adhérence des cellules. Effectuer les essais en triple exemplaire.

1. Pré-manteau 96 wells plaque (-fond plat) avec 50 ul / puits soit de 2% de BSA-PBS (comme arrière-plan) ou 1 ug d'ICAM-1 dilué dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C.
2. Laver la plaque deux fois avec du PBS et de bloquer les sites non spécifiques par addition de 2% de BSA-PBS (100 pl / puits) pendant 1 heure à 37 ° C.
3. Dans les cellules attendant de remettre les à 5 x 10 ⁶ / ml dans RPMI complet, les étiqueter avec tracker cellule 1 mM CMFDA-vert et incuber 30 min à 37 ° C.
4. Ajouter 1 x 10 ⁶ cellules / puits dans les puits pré-enduits après avoir écarté la solution de blocage (étape 4.2.2) et incuber 1 h à 37 ° C.
5. Quantifier l'adhérence à l'aide d'un lecteur ELISA (excitation filtre: 485 nM, filtre d'émission: 535 nm). Effectuer une première mesure sur l'apport total (INPUT).
6. Laver la plaque doucement avec 2% de BSA-PBS (200 pl / puits) 4 fois (x). Effectuer une lecture de la plaque après chaque étape de lavage (adhérence _{de x).}
7. Après soustraction de fond pour chaque mesure, calculer ADHES spécifiquesion (ADHESION):
   

4.3) essai de polymérisation. Il s'agit d'un test colorimétrique qui quantifie la polymérisation de l'actine F. Effectuer les essais en triple exemplaire.

1. Remettre en suspension 1x10 ^ 6 cellules dans 100 pl d'préchauffé RPMI complet et ajouter le stimulus spécifique (c.-à-α-IgM 20 pg / ml) pendant 10 min.
2. Arrêter la réaction avec 400 pl de 4% de paraformaldéhyde et de fixer les cellules pendant 10 min à température ambiante.
3. Laver 3 fois avec du PBS (centrifugation à 300 xg pendant 5 min, 4 ° C).
4. Jeter le surnageant et perméabiliser les cellules avec du PBS-saponine 0,2% (200 ul) sur de la glace pendant 2 min.
5. Laver 3 fois avec du PBS-saponine 0,1% (centrifugeuse à 100 g pendant 5 min, 4 ° C), jeter le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul de PBS-saponine 0,1%.
6. Colorer avec phalloïdine-AlexaFluor 488 (3 pg / ml) pendant 30 min à la salle tEMPÉRATURE dans l'obscurité.
7. Laver 3 fois avec du PBS-0.1% saponine. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 300 ul de PBS.
8. Quantifier la quantité de F-actine par cytométrie de flux, calcul de l'intensité Floraison moyenne (MFI) de la phalloïdine. Analyser les données générées dans une parcelle de dimension unique afin de produire un histogramme basé sur l'intensité de fluorescence, la valeur de MFI est indiqué dans le rapport de graphique.
9. Mesurer la polymérisation d'actine (Δ F-actine) comme:
   

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Résultats

Nous avons isolé les cellules leucémiques primaires B forment PB de patients atteints de LLC et nous avons analysé les cartes protéomiques. Les échantillons (n = 104) ont été regroupées en deux sous-ensembles principaux sur la base des caractéristiques cliniques de chaque patient (mauvais pronostic vs bon pronostic) et l'analyse comparative des gels 2DE a été réalisée.

L'analyse a permis d'identifier des points exprimés de manière différentielle entre les...

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Discussion

Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole optimisé pour l'identification de molécules impliquées dans la pathogenèse de la CLL, même si cette approche peut être étendue à d'autres maladies et / ou d'autres types d'échantillons ^{de 16 à 18.} En comparant les profils protéomiques de 2 sous-ensembles de patients atteints de LLC, de bons vs mauvais pronostic ^19, nous avons démontré que ils diffèrent dans l'état de phosphorylation de HS1 et que s...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488